The goal of this thesis is to analyze current requirements of navigation system RNP RNAV. Particularly is behaving about estimation current ways and description of future improving GNSS performance. In submitted thesis is describes present evolution of area navigation and required navigation performance RNP. The next part deals with the common access how to raise the performance parameters, their estimation and also description how it'll be solve in future systems.

La machinerie d'assemblage HSP90/R2TP est impliquée dans la biogenèse de complexes essentiels à l'expression génique et à la croissance cellulaire. Le complexe est constitué des protéines PIH1D1, RPAP3 et des AAA+ ATPases RVB1 et RVB2. Le R2TP, via son adaptateur NUFIP, permet l'assemblage de complexes ribonucléoprotéiques tels que les snoRNP à boîtes C/D, et le snRNP U4, tous deux impliqués respectivement dans la maturation des ARNr et ARNm. Le mode d'action du R2TP dans ces processus n'était pas bien compris. Pour étudier cela, une approche de protéomique, avec des tests d'interaction ARN/protéine et protéine/protéine, ainsi qu'une approche structurale, ont été utilisés. Un nouveau modèle a ainsi été établi. Le R2TP permettrait de former des pré-complexes d'assemblage contenant les protéines cœurs du complexe RNP avec des facteurs d'assemblage mais sans l'ARN. Les protéines RVB se détacheraient du R2TP pour rester associées à ce pré-complexe d'assemblage, par la suite, elles permettraient de le stabiliser tout en y incorporant de nouvelles protéines cœurs, et en relargant des facteurs d'assemblage ayant déjà accompli leur fonction dans le processus de biogenèse. Cette fonction de chaperon moléculaire des complexes en cours d'assemblage est très probablement régulée par hydrolyse de l'ATP par les ATPases RVB, et ceci sous le contrôle de co-facteurs, comme potentiellement la protéine BCD1. Dans le cas de l'assemblage des C/D snoRNP, il a été établi un modèle d'assemblage dans lequel le rôle des différents facteurs d'assemblage peut être prédit. ZNHIT3 aurait un rôle dans l'incorporation du snoARN naissant dans le pré-complexe, et NUFIP permettrait de garder la particule immature dans une conformation inactive afin de faciliter l'obtention de la structure active du snoRNP grâce aux RVB. Avec les travaux sur la biogenèse de la particule U4, il a été mis en évidence l'existence d'un pré-complexe cytoplasmique contenant PRP31/NUFIP/R2TP/complexe SMN qui serait important pour l'assemblage de la snRNP U4 avec non seulement les protéines Sm, mais aussi la protéine PRP31. / The HSP90/R2TP machinery is involved in the biogenesis of essential complex for gene expression and cell growth. The complex consists of proteins PIH1D1, RPAP3 and the AAA+ ATPases RVB1 and RVB2. The R2TP, via its NUFIP adaptator, allows assembly of ribonucleoprotein complexes like box C/D snoRNP, and the U4 snRNP, both involved in the maturation of mRNA and rRNA respectively. The mode of action of R2TP in these processes is not well understood. In this study, a proteomic approach, with tests of interaction RNA/protein and protein/protein and a structural approach, were used. A new model has been established. The R2TP would form an assembly pre-complex containing RNP core proteins with assembly factors but not RNA. RVB proteins detach from R2TP to remain associated with the assembly pre-complex, and then, would stabilize it while incorporating new core proteins. They would also release assembly factors that already have accomplished their function in the biogenesis process. This function of molecular chaperone complex during assembly is most likely regulated by ATP hydrolysis by the RVB ATPases, and this under the control of co-factors as potentially BCD1 protein. In the case of the assembly of box C/D snoRNP, it was established an assembly model in which the roles of the various assembly factors can be predicted. ZNHIT3 has a role in the incorporation of the nascent snoRNA in the pre-complex and NUFIP would keep the immature particle into an inactive conformation to facilitate the formation of the active structure of the snoRNP through RVB. With the study of the biogenesis of the U4 particle, it was revealed the existence of a cytoplasmic pre-complex containing PRP31/NUFIP/R2TP/SMN complex that would be important for the assembly of the U4 snRNP with not only Sm protein but also the PRP31 protein.

Le virus de la grippe A est un virus à ARN négatif appartenant à la famille des Orthomyxoviriadea dont la réplication se produit dans le noyau des cellules infectées. L'organisation du génome est segmentée en huit segments d'ARNv de polarité négative, codant pour un minimum de 16 protéines virales différentes. Ces ARN viraux (ARNv) sont en complexe avec de nombreuses copies de nucléoprotéines et liés par leurs extrémités 5' et 3' au complexe hétérotrimérique de l'ARN-polymérase ARN-dépendante composé des sous unités PA, PB1 et PB2. Cet assemblage macromoléculaire (ARNv / polymérase / NP) nommée Ribonucléoprotéine (RNP) constitue une entité génomique indépendante. Dans le contexte de la RNP, l'ARN-polymérase assure à la fois la transcription et la réplication du génome ARNv. En assurant ces deux fonctions, l'ARN-polymérase joue un rôle majeur dans la réplication virale et constitue une cible antivirale privilégiée. Les travaux de recherche présentés dans cette thèse se concentrent sur les éléments structuraux participants à l'assemblage de l'ARN polymérase et son interaction avec les avec les ARNv. Pour atteindre ces objectifs, notre laboratoire, en collaboration avec d'autres groupes, a mis en place un système d'expression en polyprotéines permettant d'exprimer la polymérase. Plus encore, cette méthode a aussi permis de reconstituer des complexes entre l'ARN-polymérase et des partenaires cellulaires, notamment RanBP5 qui appartient à la famille des importines-β. / Influenza A virus is a negative-strand RNA virus belonging to the Orthomyxoviriadea family whose replication occurs in the nucleus of infected cells. The genome organisation of influenza virus is segmented in eight vRNA segments of negative polarity coding for at least 16 different viral proteins. Each vRNA is bound to multiple copies of nucleoprotein (NP) and to the heterotrimeric RNA-dependent RNA-polymerase complex (PA, PB1 and PB2) through its 5' and 3' extremities. This macromolecular assembly (vRNA/polymerase/NP) forms the ribonucleoprotein (RNP) particle, which acts as a separate genomic entity within the virion. The RNP complex is at the core of viral replication and in the context of RNPs, the polymerase performs both transcription and replication of the vRNA genome. As such, the polymerase constitutes a major antiviral drug target. The research work presented within this thesis focuses on the underlying determinants of the RNA polymerase assembly process and its interaction with its vRNA genome. To fulfill these goals, our lab, in collaboration with other groups, has set up a novel polyprotein expression system to express the polymerase but also to reconstitute polymerase and cellular partner complexes, notably RanBP5, which belongs to the importin-β family.

La synthèse des sélénoprotéines fait appel à un mécanisme de recodage traductionnel d’un codon UGASec. Chez les mammifères, ce processus est conditionné par le recrutement de facteurs spécialisés dans la région 3’UTR des ARNm de sélénoprotéines, au niveau d’une tige-boucle appelée SECIS. Lors de ma thèse, nous avons montré que certains ARNm de sélénoprotéines possèdent une coiffe hyperméthylée m32,2,7G à leur extrémité 5’, à la manière d’ARN non-codants, et ne sont pas reconnus efficacement par le facteur canonique d’initiation de la traduction eIF4E. Nous avons déterminé le mécanisme de biogenèse de cette coiffe qui fait appel à la Triméthyl-guanosine synthase, et avons montré que les ARNm de sélénoprotéines coiffés m32,2,7G sont traduits in vivo. Par ailleurs, nos résultats indiquent que l’initiation de la traduction des ARNm de sélénoprotéines suit un mécanisme atypique qui ferait intervenir des éléments structuraux de l’ARNm, la région 3’UTR et une GTPase encore inconnue. / Selenoprotein synthesis requires co-translational recoding of in-frame UGA codons. In mammals, this process is governed by the recruitment of dedicated factors on a hairpin structure, called SECIS, in the 3’UTR of selenoprotein mRNAs. During my PhD, we showed that several selenoprotein mRNAs bear a hypermethylated m32,2,7G cap and undergo a similar 5’ end maturation pathway than non-coding RNAs. This cap biogenesis mechanism involves the enzyme Trimethyl-guanosine synthase, m32,2,7G capped selenoprotein mRNAs are not efficiently recognized by the canonical translation initiation factor eIF4E but are translated in vivo. Furthermore, our results suggest the existence of an atypical mechanism of translation initiation for selenoprotein mRNAs. This process involves structural RNA determinants, the 3’UTR region and a GTPase that remains to be identified.

Le génome humain est constitué d'environ 45% d'éléments transposables, et l'élément LINE-1 (L1), qui représente 17% de la masse totale, est le seul élément actif connu de notre génome capable de rétrotransposer. Les protéines de L1, ORF1p et ORF2p, peuvent mobiliser divers ARN en trans, tel que Alu, le snRNA U6 ou encore d'autres ARNm cellulaires. C'est, en partie pour ces raisons que l'élément L1 est considéré comme un acteur majeur de la plasticité de notre génome.Dans un premier temps, nous avons élaboré un nouveau système, la lignée stable inductible Trex, qui permettra d'étudier la rétrotransposition de L1 à partir d'une localisation chromosomique. Cette lignée stable présente une intégration d'un élément L1 marqué avec T7 et Flag-HA pour ORF1p et ORF2p, respectivement. Ce système nous permettra dans un avenir proche de purifier les partenaires protéiques d'ORF2p selon le protocole de double purification sur colonne d'affinité Flag suivi de HA, et de les identifier par spectrométrie de masse (MS/MS). Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés aux séquences chimères U6-L1 présentes au niveau du génome humain. Nous avons entamé ainsi une étude in silico, qui nous a conduit à la découverte d'une nouvelle unité répétée présente dans les génomes de primates, que l'on a appelé ‘'RSU6''. / The human génome is composed of about 45% of mobile elements. LINE-1 (L1, which represents 17% of the total mass, is the only active element, capable of retrotransposition in our génome. L1 proteins, ORF1p and ORF2p, can mobilise other RNA in trans, such Alu, snRNA U6 or other cellular mRNA. This is one of the reasons why L1 element is considered as the major actor of genome plasticity. First, we have developed a new system, the stable Trex cell line, which will allow us to study L1 retrotransposition from a chromosomal location. This stable cell line has integrated a marqued L1 (with ORF1-T7 and ORF2- Flag-HA) into the genome. This new system will enable us to purify cellular cofactors of ORF2p, according to the double affinity protocol (Flag and HA), and to identify them by mass spectrometry. Second, we were intersted in the chimeric sequences U6-L1 present in the human genome. We have done an in silico analyses which allowed us to identify a new repeated unit in the primate genome that we called ‘'RSU6''.

Les ARNms des cellules eucaryotes sont liés à des protéines de liaison aux ARNs (RBPs) et empaquetés au sein d’assemblages macro-moléculaires appelés granules RNP. Dans les cellules neuronales, les granules RNP de transport sont impliqués dans le transport d’ARNms spécifiques jusqu’aux axones et dendrites, ainsi que dans leur traduction locale en réponse à des signaux externes. Bien que peu de choses soient connues sur l’assemblage et la régulation de ces granules in vivo, des résultats récents ont indiqué que la présence de domaines de type prion (PLDs) dans les RBPs facilite les interactions protéines-protéines et protéines-ARN, favorisant ainsi la condensation de complexes solubles en granules RNP. La RBP conservée Imp est un composant central de granules RNP qui sont transportés dans les axones lors du remodelage neuronal chez la drosophile. De plus, la fonction de Imp est nécessaire au remodelage des axones lors de la maturation du système nerveux de drosophile. Une analyse de la séquence de la protéine Imp a révélé qu’en plus de quatre domaines de liaison aux ARNs, Imp contient un domaine C-terminal désordonné enrichi en Glutamines et Serines, deux propriétés caractéristiques des domaines PLDs. Lors de ma thèse, j’ai étudié la fonction de ce PLD dans le contexte de l’assemblage et du transport des granules RNP. J’ai observé en culture de cellules que les granules Imp s’assemblent en absence de PLD, bien que leur nombre et leur taille soient augmentés. Des protéines présentant une séquence PLD mélangée, au contraire, s’accumulent dans des granules au nombre et à la taille normale, indiquant que l’état désordonné de ce domaine, et non sa séquence primaire, est essentiel à l’homéostasie des granules. De plus, des expériences de FRAP réalisées en culture de cellule et in vivo ont révélé que le domaine PLD de Imp favorise la dynamique des granules. In vivo, ce domaine est nécessaire et suffisant à l’accumulation axonale de Imp. Comme montré par une analyse en temps réel, l’absence de domaine PLD aboutit également à une diminution du nombre de granules axonaux motiles. Fonctionnellement, le domaine PLD de Imp est essentiel au remodelage neuronal car des protéines sans ce domaine ne sont pas capables de supprimer les défauts de repousse axonale observés après inactivation de imp. Enfin, la génération d’un variant de Imp dans lequel le domaine PLD a été déplacé en N-terminus a montré que les fonctions du PLD dans le transport des granules et dans leur assemblage sont découplées, et que la modulation des propriétés des granules Imp médiée par le domaine PLD n’est pas nécessaire au remodelage neuronal in vivo. En conclusion, mes résultats ont montré que le domaine PLD de Imp n’est pas nécessaire à l’assemblage des granules RNP Imp, mais régule leur nombre et leur dynamique. De plus, mon travail a mis en évidence une fonction inattendue pour un domaine PLD dans le transport axonal et le remodelage des neurones lors de la maturation du système nerveux. / Eukaryotic mRNAs are bound by RNA Binding Proteins (RBP) and packaged into diverse range of macromolecular assemblies named RNP granules. In neurons, transport RNP granules are implicated in the transport of specific mRNAs to axons or dendrites, and in their local translation in response to external cues. Although little is known about the assembly and regulation of these granules in vivo, growing evidence indicates that the presence of Prion Like domains (PLD) within RBPs favours multivalent protein–protein and protein-RNA interactions, promoting the transition of soluble complexes into RNP granules. The conserved RBP Imp is as a core component of RNP granules that are actively transported to axons upon neuronal remodelling in Drosophila. Furthermore, Imp function was shown to be required for axonal remodelling during Drosophila nervous system maturation. Analyses of the domain architecture of the Imp protein revealed that, in addition to four RNA binding domains (RBD), Imp contains a Cterminal domain showing a striking enrichment in Glutamines and Serines, which is one of the characteristics of a PLD. During my PhD, I explored the function of the PLD in the context of granule assembly and transport. In cultured cells, I observed that Imp granules assembled in the absence of the PLD, however their number and size were increased. Proteins with scrambled PLD sequence accumulated in granules of normal size and number, implying that the degree of disorder of this domain, and not its sequence, is essential for granule homeostasis. Moreover, FRAP experiments, performed on cultured cells and in vivo, revealed that Imp PLD is important to maintain the turnover of these granules. In vivo, this domain is both necessary and sufficient for efficient transport of Imp granules to axons. These defects are associated with a reduction on the number of motile granules in axons. Furthermore, mutant forms lacking the PLD do not rescue the axon remodelling defects observed upon imp loss of function. Finally, a swapping experiment in which I moved Imp PLD from the C-terminus to the N-terminus of the protein revealed that the functions of Imp PLD in granule transport and homeostasis are uncoupled, and that PLD-dependent modulation of Imp granule properties is dispensable in vivo. Together, my results show that Imp PLD of is not required for the assembly of RNP granules, but rather regulates granule number and dynamics. Furthermore, my work uncovered an unexpected in vivo function for a PLD in axonal transport and remodelling during nervous system maturation.

Les particules ribonucléoprotéiques (RNP) sont impliquées dans divers mécanismes cellulaires : les UsnRNP, la SRP, les RNP à boîtes C/D et H/ACA dans la modification des ARN et la maturation des ARN ribosomiques, et la télomérase dans le maintien des extrémités chromosomiques. L'assemblage de ces RNP est un processus complexe faisant intervenir de nombreux facteurs, dont le complexe SMN. Un déficit de l’une des protéines de ce complexe conduit à l’amyotrophie spinale. Il est essentiel à la survie cellulaire et est nécessaire à l’assemblage des UsnRNP et de la SRP. Il est suggèré que le complexe SMN joue un rôle dans la biogenèse des RNP à boîtes C/D et H/ACA. Nous avons montré des interactions in vitro et des associations in cellulo entre le complexe SMN et la protéine NUFIP (un facteur d’assemblage de ces RNP). Ces résultats suggèrent l’existence d’un lien fonctionnel entre le complexe SMN et NUFIP dans l'assemblage des RNP à boîtes C/D et H/ACA et de la snRNP U4. Des interactions in vitro entre le complexe SMN et la protéine NAF1 (un facteur d’assemblage des RNP à boîtes H/ACA) ont révélés, que le complexe SMN est capable de s’associer avec la RNP à boîtes H/ACA en formation. Si le complexe SMN intervient dans l’assemblage des RNP, on peut supposer que cet assemblage soit défectueux dans la SMA. Nous avons montré que certains ARN sont accumulés dans la moelle épinière et le cerveau de souris SMA. La télomérase est réactivée dans les cellules cancéreuses. En collaboration avec l’équipe de J-M Vignaud (CHU central, Nancy), nous avons montré une augmentation du taux des protéines cœur des RNP à boîtes H/ACA et de NUFIP dans les cellules tumorales / Ribonucleoprotein particles (RNPs) are involved in various cellular mechanisms in eukaryotic cells: UsnRNP, SRP, C/D and H/ACA box RNPs in RNA modifications and rRNA maturation and telomerase in the synthesis of the chromosome extremities. RNP assembly is a very complex process, which involves numerous factors. One of these factors is the SMN complex. Decreased level of one of its components leads to spinal muscular atrophy. It is essential for cell survival and necessary for UsnRNP and SRP assembly. It is suggested that the SMN complex plays a role in C/D and H/ACA RNP biogenesis. We showed in vitro interactions and in cellulo associations between the SMN complex and the protein NUFIP (an assembly factor of these RNP). These results suggest the existence of a functional link between the SMN complex and NUFIP in the assembly of the C/D and H/ACA box RNPs and the U4 snRNP. In vitro interactions between the SMN complex and the protein NAF1 (an assembly factor of the H/ACA boxes RNPs) revealed, that the SMN complex is capable of joining with the H/ACA boxes RNPs in formation. If the SMN complex intervenes in the RNPs assembly, we can suppose that this assembly is defective in the SMA. We showed that any ARN is accumulated in the spinal cord and the brain of SMA mouse. The telomerase is reactivated in cancer cells. In association with the team of J-M Vignaud (CHU central, Nancy), we showed an increase of H/ACA box RNP proteins and NUFIP in these cancer cells

Die neurodegenerative Krankheit Spinale Muskelatrophie (SMA) wird durch den Mangel an funktionellem Survival Motor Neuron Protein (SMN) verursacht. Eine Funktion von SMN liegt in der Biogenese spleißosomaler UsnRNPs (U-rich small nuclear ribonucleoprotein particles). Diese Arbeit zeigt in einem SMA-Modell in Hela-Zellkultur, dass der SMN-Mangel zu einer reduzierten de novo-Produktion der spleißosomalen UsnRNPs führt. In einem Zebrafisch-Modell für SMA wurde nachgewiesen, dass die reduzierte UsnRNP-Produktion die Degenerationen von Axonen der Motoneuronen verursacht, einen Phänotyp wie er bei SMA auftritt. Damit konnte erstmals eine direkte Verbindung zwischen einer zellulären Funktion von SMN und der Entstehung von SMA hergestellt werden. / The neurodegenerative disease spinal muscular atrophy (SMA) is caused by unsufficient production of the survival motor neuron protein (SMN). This study shows in a SMA-model in Hela cells that SMN deficiency results in reduced de novo synthesis of spliceosomal UsnRNPs (U-rich small nuclear ribonucleoprotein particles). A zebrafish model for SMA revealed that the impaired synthesis of UsnRNPs is a direct cause for the degeneration of axons in motor neurons. This is the first link between a cellular function of SMN and the pathogenesis of SMA.

Universiẗat, Diss., 2005--Würzburg.

The function of two subunits of the putative mitochondrial RNA binding complex (MRB1) associated with RNA editing in parasitic protist Trypanosoma brucei was studied using various in vivo and in vitro methods of molecular biology.