The bone marrow (BM) niche provides hematopoietic stem (HSC) and progenitor cells with many exogenous cues that tightly regulate homeostasis. These cues orchestrate cellular decisions, which are difficult to dissect and analyze in vivo. This thesis introduces a novel in vitro platform that permits systematic studies of BM-relevant factors that regulate homeostasis. Specifically, the role of 3D patterned adhesion ligands and soluble cytokines were studied in a combinatorial fashion. Analysis of human HSC differentiation and proliferation at both population and single cell level showed synergistic and antagonistic effects of adhesion- and cytokine-related signals. Those effects were dependent on the cytokine concentration and the distribution and number of adhesion ligands. The aim of this thesis was to model the in vivo bone marrow with its porous 3D structure and different sized niche compartments using a microcavity culture carrier. The developed culture system presented extracellular matrix (ECM) adhesion ligands to the HSCs in various defined dimensions ranging from single- to multi-cell capacity. The 3D open well geometry of the microcavity carriers also allowed HSCs to freely explore different scenarios including homing, migration, adhesion, or suspension. Furthermore, the developed setup offered straightforward accessibility to analytical methods like cytometry and quantitative microscopy. Single cell analysis of adherent HSCs showed decreased DNA synthesis and higher levels of stem cell marker expression within single cell microcavities under low cytokine conditions . This effect was reflected in a decline of proliferation and differentiation with decreasing microcavity size. When the cytokine concentration was increased2 beyond physiological levels the inhibitory effect on proliferation and differentiation due to single-cell-microcavity adherence was diminished. This result highlighted the fine balance between adhesion related and soluble cues regulating HSC fate. Within small microcavities more adhesion related receptors were engaged due to the 3D character of the culture carrier compared to multi-cell wells or conventional 2D cell culture plates. This study demonstrated that adhesion-related signal activation leads to reduced proliferation and differentiation. This geometry-based effect could be reversed by increased cytokine supplementation in the culture media. For plane substrates, HSCs attachment to fibronectin or heparin initiated early cell cycle entry compared to non-adherent cells during the initial 24h. Cytokine supplemented media favored integrin activation that induced fast adhesion, ultimately leading to early cell cycle activation. However, after prolonged cell culture the system balanced itself with a lower cycling rate of adherent versus non-adherent HSCs. Furthermore, HSCs within the 3-dimensionality of the microcavities cycled less than 2D adherent cells. These findings additionally supported the above stated idea of limited HSC proliferation as a consequence of more adhesion-related signals overwriting cytokine driven expansion. To complement the various in vitro studies, an in vivo repopulation study was performed. Cultured HSCs derived from single cell microcavities outperformed freshly isolated HSCs in a competitive repopulation assay, indicating that carefully engineered substrates are capable of preserving stem cell potential. Overall the reported findings provide a promising in vitro culture strategy that allows the stem cell field to gain a better understanding of the impact of distinct exogenous signals on human HSCs, which discloses new concepts for the wide scientific community working towards tissue engineering and regenerative medicine. / Die Homöostase der Hämatopoietischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSC) in der Knochenmark Nische wird von einer Vielzahl exogener Faktoren gezielt reguliert. Diese Faktoren orchestrieren intrazelluläre Vorgänge, deren in vivo Analyse kompliziert ist. Die vorliegende These widmet sich einem neuen biotechnologischen Ansatz, der systematische Studien von Knochenmark-relevanten Faktoren ermöglicht. Im Speziellen wurde die Rolle 3D-präsentierter Zell Adhäsionsliganden in Kombination mit verschiedenen Konzentrationen löslicher Zytokine untersucht. Die Auswertung der Proliferation und Differenzierung von humanen HSC auf Einzelzell- und Populationsebene offenbarte die synergistischen und antagonistischen Effekte von Adhäsions- und Zytokinsignalen in ihrer Abhängigkeit von der Verteilung und der Anzahl von Adhäsionsliganden sowie der Zytokinkonzentration. Um die poröse Struktur des Knochenmarks in vivo-ähnlich darzustellen, wurde eine Zellkultur Plattform mit Mikrokavitäten verschiedenster Dimensionen von Multi- bis Einzelzellgröße entwickelt und mit Molekülen der extrazellulären Matrix beschichtet. Die Vorteile dieser Plattform liegen in der offenen 3D-Geometrie dieses mikrokavitäten Kultursystems, die den Zellen ermöglichte verschiedene Wachstumsbedingungen bezüglich Homing, Migration, Adhäsion oder Suspension frei zu erkunden. Das leicht zugängliche Setup eignete sich zudem hervorragend für die zytometrische Analyse der Zellen oder die quantitative Mikroskopie. Die Einzelzellanalyse adhärenter HSC ergab eine Reduktion von DNA Synthese und eine höhere Expression von Stammzelloberflächenfaktoren innerhalb der Einzelzell-Mikrokavitäten bei niedrigen Zytokinkonzentrationen . Dieser Effekt spiegelte sich auch auf Populationsebene in verminderter Proliferation und Differenzierung mit abnehmender Größe der Mikrokavitäten wider. Wurde die Zytokinkonzentration jedoch weit über physiologische Bedingungen erhöht, verminderte sich der Effekt (reduzierte DNA Synthese und höhere Stammzellfaktorexpression) beschrieben für die Einzelzellmikrokavitäten. Dieses Ergebnis verdeutlicht die empfindliche intrazelluläre Balance, vermittelt durch Adhäsionsignale und löslichen Faktoren, die das Verhalten von HSCs regulieren. Aufgrund des 3D-Charakters des Zellkulturträgers wurden innerhalb kleiner Mikrokavitäten mehr Adhäsionsrezeptoren ringsum die Zelle aktiviert. Dieser Vorteil gegenüber den Multizellkavitäten oder der herkömmlichen 2D–Zellkultur ermöglichte eine hohe Anzahl adhäsionsvermittelter Signale mit entsprechend höherer Proliferations-inhibitorischer Wirkung. Je höher die Konzentration der Zytokine war, desto stärker erfolgte die Stimulation der Proliferation und Differenzierung. Auf 2D Substraten, initiierte Adhäsion zu Fibronektin und Heparin innerhalb der ersten 24h einen frühen Zell-Zyklus-Start im Gegensatz zu nicht adhärenten Zellen. Die Zytokine im Zellmedium förderten die Integrin Aktivierung, was zu einer schnellen Zelladhäsion führte. Die Adhäsionsrezeptoren wiederum kooperieren mit Zytokinrezeptoren im Zellinneren und begünstigten damit einen zeitigeren Zell-Zyklus- Start. Allerdings stellte sich danach ein Gleichgewicht im Kultursystem ein, wobei weniger adhärente Zellen als nicht-adhärente Zellen den Zellzyklus durchliefen. Des Weiteren war die Zellzyklusrate innerhalb von 3D Mikrokavitäten niedriger verglichen mit herkömmlichen 2D Substraten. Diese Ergebnisse bestätigen ferner obenstehende These, dass Zytokin-induzierte Zellexpansion durch erhöhte Zelladhäsions-vermittelte Signale überschrieben wird. Um die in vitro Studien zu komplettieren wurde ein in vivo Repopulationsversuch durchgeführt. HSC kultiviert auf Einzel-Zell-Mikrokavitäten übertrafen frisch isolierte Konkurrenz-Zellen in einem kompetitiven Repopulationsversuch. Dieses erste Ergebnis zeigt, dass sich der Zellgröße entsprechende Biomaterialien für die erfolgreiche Stammzell-Kultur eignen. Die Ergebnisse dieser Arbeit bieten eine vielversprechende in vitro Zellkulturstrategie, die ein besseres Verständnis der Einflüsse von exogenen Signalen auf HSC erlaubt und damit eine Grundlage für neue Erkenntnisse in Richtung erfolgreicheres Tissue Engineering und klinische Anwendungen im Bereich der regenerativen Medizin bildet.

Sulfated glycosaminoglycans (GAG) are components of the bone marrow stem cell niche and to a minor extent of mature bone tissue with important functions in regulating stem cell lineage commitment and differentiation. We anticipated that artificial extracellular matrices (aECM) composed of collagen I and synthetically oversulfated GAG derivatives affect preferentially the differentiation of osteoblast-precursor cells and early osteoblasts. A set of gradually sulfated chondroitin sulfate and hyaluronan derivatives was used for the preparation of aECM. All these matrices were analysed with human bone marrow stromal cells to identify the most potent aECM and to determine the influence of the degree and position of sulfate groups and the kind of disaccharide units on the osteogenic differentiation. Oversulfated GAG derivatives with a sulfate group at the C-6 position of the N-acetylglycosamine revealed the most pronounced proosteogenic effect as determined by tissue nonspecific alkaline phosphatase activity and calcium deposition. A subset of the aECM was further analysed with different primary osteoblasts and cell lines reflecting different maturation stages to test whether the effect of sulfated GAG derivatives depends on the maturation status of the cells. It was shown that the proosteogenic effect of aECMwasmost prominent in early osteoblasts. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Background Regulatory T cells (Treg) are a subpopulation of CD4+ T cells that play an important role in the peripheral tolerance mechanisms of the immune system. Their suppressive function on autoreactive T cells can prevent autoimmunity. In type 1 diabetes (T1D), Treg have been inconsistently reported to be impaired in their capability to suppress autoreactive T cells (Tan, et al., 2014; Zhang, et al., 2012). Treg can be thymus derived (tTreg) or generated from naïve CD4+ CD25- T cells in the periphery (pTreg), which exhibit similar suppressive qualities as tTreg. They have also been reported to be actively induced (iTreg) under tolerogenic conditions (Kleijwegt, et al., 2010; Yuan and Malek, 2012). Although several Treg subpopulations have been described, the archetypical Treg express the major markers CD4, CD25 and FOXP3, while CD127 is heavily downregulated. However, activated conventional T cells (Tconv) show a similar phenotype, at least transiently (Miyara, et al., 2009). Since Treg and Tconv have opposing functions and therapeutic indications, it is important to obtain markers that confidently identify bona fide Treg. Scientific aim The aim of my thesis is to define the heterogeneity of human T cells with a specific emphasis to identify bona fide Treg. I examined heterogeneity of this population in healthy controls and T1D patients, as my model disease, and examined how T cells that are exposed to antigen can be defined as Treg or Tconv. Material and Methods For marker phenotyping I used samples from new onset T1D patients (age 7-11 years), autoantibody positive (Aab+) patients and age-matched healthy controls, which were tested by flow cytometry with an array of Treg-associated markers. Separately, freshly isolated CD4+CD25+CD127lo Treg and CD+CD25- Tconv were used for transcriptomic analysis, which was done by RNAseq on isolated whole RNA. For functional analysis of antigen specific gene expression patterns I developed a multi-dye proliferation assay. Treg (CD4+CD25+CD127lo) and Tconv (CD4+CD25-CD127+/lo) were sorted from isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMC). I recombined the sorted and proliferation dye stained subsets with CD4- cells to simulate whole PBMC assays and stimulated them with tetanus-, influenza- or auto-antigens (GAD65, proinsulin). Cells were incubated for 5 days and responding proliferating cells as well as non-responding cells were single cell sorted and analyzed by multiplex qPCR. In investigating therapeutic approaches to expand or generate Treg, I examined in vitro approaches for de novo induction of Tregs with tolerogenic dendritic cells (tDCs). The tDCs were differentiated from monocytes either in the presence of 1α,25-OH(2)Vitamin D3 and/or Dexamethasone and matured with lipopolysaccharide. In a multistep assay, naïve T cells were incubated with DCs for two rounds and functional suppression assays were performed. The resultant T cells were analyzed at the DNA, protein, and functional level. Results Substantial phenotypic heterogeneity of peripheral blood CD4+ T cells was observed and documented for three major populations: resting Tconv (CD25-CD127+/lo), activated Tconv (CD25+CD127+) and Treg (CD25+CD127lo) in healthy controls. Despite this, I observed no differences between the Treg subpopulations from new onset T1D patients, Aab+ patients and healthy controls. In addition, there were no differences in the Treg transcriptome of T1D patients and healthy controls by RNAseq. I was, however, able to identify a small set of differentially expressed genes was discovered in Tconv suggesting a role of neutrophils in the onset of T1D. Heterogeneity of antigen-responsive Tconv and Treg was identified by gene expression profiling. I was able to define Treg specific as well as activation specific profiles, and found different expression profiles if T cells are foreign antigen or autoantigen activated and if the responding cells are Treg or Tconv. Genes that define the specific profiles include FOXP3, CD127, several cytokines, transcription factors and activation markers. The manipulation of naïve CD4+CD25- T cells by tDCs led to an unstable CD25+CD127loFOXP3+ phenotype of the generated cells. However, none of the subsequently performed functional assays could confirm that the resultant cells were iTreg or exhausted activated Tconv. In particular, methylation status of the Treg-specific demethylated region (TSDR) was inconsistent with stable Treg, suggesting that so-called tolerogenic protocols may not lead to a long-lived Treg phenotype. Conclusion CD4+CD25+ T cells are heterogeneous. I defined marker combinations that will help distinguish Treg from ex vivo and in vitro activated Tconv cells. With these tools, I was able to show that healthy controls and patients with type 1 diabetes cannot be distinguished by Treg phenotype. Comprehensive single cell analysis of antigen activated T cells provided the most promising avenue for identifying antigen-specific Treg and opens new possibilities to analyze immune therapeutic approaches, particularly when Treg expansion is the therapeutic objective. The findings will be used for monitoring children participating in antigen-based prevention studies in children at risk for T1D. / Hintergrund Regulatorische T Zellen (Treg) sind eine Subpopulation der CD4+ T Zellen, welche eine wichtige Rolle in den peripheren Toleranzmechanismen des Immunsystems spielen. Ihre suppressive Funktion auf autoreaktive T Zellen kann Autoimmunität verhindern. Verschiedene Studien berichteten widersprüchlich, dass Treg in Typ 1 Diabetes (T1D) in ihrer Fähigkeit beeinträchtigt sind autoreaktive T Zellen zu supprimieren (Tan et al., 2014; Zhang et al., 2012). Treg können im Thymus differenzieren (tTreg) oder aus peripheren naïven CD4+CD25- T Zellen generiert werden (pTreg), welche ähnliche suppressive Eigenschaften wie tTreg besitzen. Es wurde außerdem berichtet, dass Treg aktiv unter tolerisierenden Konditionen induziert werden können (iTreg) (Kleijwegt et al., 2010; Yuan and Malek, 2012). Obwohl verschiedene Treg Subpopulationen beschrieben wurden, exprimieren die archetypischen humanen Treg die Hauptmarker CD4, CD25 und FOXP3 exprimieren, während CD127 herunterreguliert ist. Jedoch zeigen auch aktivierte konventionelle T Zellen (Tconv) diesen Phänotyp (Miyara et al., 2009). Da Treg und Tconv gegensätzliche Funktionen und therapeutische Indikationen aufweisen, ist es wichtig Marker zu erhalten, die sicher bona fide Treg identifizieren. Fragestellung Das Ziel meiner Arbeit ist es, die Heterogenität von humanen T Zellen zu definieren mit einen spezifischen Fokus bona fide Treg zu identifizieren. Dafür untersuchte ich die Heterogenität dieser Zellpopulation in gesunden Individuen und T1D Patienten, als Krankheitsmodell, und wie T Zellen als Treg oder Tconv definiert werden können wenn sie einem Antigen ausgesetzt sind. Material und Methoden Für das Phänotypisieren habe ich Proben von Patienten mit beginnendem T1D (Alter 7-11 Jahre), Autoantikörper positiven Patienten (Aab+) und gesunden Individuen mittels Durchflusszytometrie auf eine Reihe von Treg-assoziierten Markern getestet. Des Weiteren wurden frisch isolierte CD4+CD25+CD127lo Treg und CD+CD25- Tconv für die Transkriptomanalyse (RNAseq) genutzt, welche mit der Gesamt-RNA durchgeführt wurden. Für die funktionelle Analyse von Antigen-spezifischen Genexpressionsmustern habe ich ein Multifarbenproliferationstest entwickelt. Treg (CD4+CD25+CD127lo) und Tconv (CD4+CD25-CD127+/lo) wurden aus isolierten mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) sortiert. Ich habe die sortierten und gefärbten Zellen mit CD4- Zellen zusammengefügt, um einen Gesamt-PBMC-Test zu simulieren und habe die Zellen mit Tetanus-, Influenza- oder Auto-antigen (GAD65, Proinsulin) stimuliert. Die Zellen wurden für 5 Tage inkubiert und die Antigen-reagierenden und -proliferierenden Zellen sowie die nicht-reagierenden Zellen Einzelzell sortiert und mittels Multiplex qPCR analysiert. Um therapeutische Ansätze zum Expandieren oder Generieren von Treg zu untersuchen, habe ich in vitro Ansätze für die de novo Induktion von Treg durch die Nutzung von tolerisierenden dendritischen Zellen (tDCs) untersucht. Die tDCs wurden von Monozyten in Anwesenheit von 1α,25-OH(2)Vitamin D3 und/oder Dexamethason differenziert und mit Lipoploysaccharid maturiert. Naïve T Zellen wurden in einem Mehrschrittverfahren mit DCs inkubiert. Die resultierenden T Zellen wurden auf DNA, Protein und funktioneller Ebene analysiert. Ergebnisse Substantielle phänotypische Heterogenität von peripheren Blut CD4+ T Zellen wurde in drei Hauptpopulationen in gesunden Individuen beobachtet und dokumentiert: ruhende Tconv (CD25-CD127+/lo), aktivierte Tconv (CD25+CD127+) und Treg (CD25+CD127lo). Weiterführend ergab der phänotypische Vergleich von Patienten mit beginnender T1D, Aab+ Patienten und gesunden Individuen keine Unterschiede in den Treg Subpopulationen. Außerdem zeigten sich keine Unterschiede in den durch RNAseq gemessenen Treg Transkriptomen von T1D Patienten und gesunden Individuen. Jedoch wurde ein kleine Gruppe von differentiell exprimierten Genen in Tconv entdeckt, welche eine mögliche Rolle von Neutrophilen in T1D andeuten. Heterogenität von Antigen-spezifischen Tconv und Treg Antworten wurde durch Genexpressionsanalysen identifiziert. Ich konnte Treg- sowie Aktivierungs-spezifische Muster definieren und verschiedene Expressionsprofile finden, wenn T Zellen durch Fremd- oder Autoantigen aktiviert wurden und ob sie die reagierenden Zellen Treg oder Tconv sind. Folgende Gene waren hauptsächlich in die Profilbildung involviert: FOXP3, CD127, mehrere Zytokine, Transkriptionsfaktoren und Aktivierungsmarker. Die Manipulation von naïven CD4+CD25- T Zellen durch tDCs führte zu einem instabilen CD25+CD127loFOXP3+ Phänotyp der generierten Zellen. Jedoch konnte keiner der weiterführenden funktionellen Analysen unterscheiden, ob die resultierenden Zellen iTreg oder aktivierte erschöpfte T Zellen waren. Insbesondere war der Methylierungsstatus der Treg-spezifisch demethylierten Region (TSDR) nicht konsistent mit einen stabilen Treg Phänotyp, was darauf hinweist, dass sogenannte tolerisiernde Protokolle nicht zu einem langlebigen Treg Phänotyp führen. Schlussfolgerungen CD4+CD25+ T Zellen sind heterogen. Ich habe Markerkombinationen definiert die helfen werden Treg von ex vivo und in vitro aktivierten Tconv Zellen zu unterscheiden. Mit diesen Mitteln war ich in der Lage zu zeigen, dass gesunde Individuen und Patienten mit Typ 1 Diabetes nicht anhand ihres Treg Phänotyps unterschieden werden können. Umfassende Einzelzell-Analysen von Antigen aktivierten T Zellen lieferten den vielversprechendsten Ansatz für die Identifizierung von Antigen-spezifischen Treg und eröffnen neue Möglichkeiten um immuntherapeutische Ansätze zu analysieren, insbesondere wenn Treg Expansion das therapeutische Ziel ist. Diese Erkenntnisse werden zukünftig für das Monitoring von Kindern, mit einem hohen T1D Risiko, genutzt die an Antigen-basierten Präventionsstudien teilnehmen.