De nombreuses études révèlent que le domaine de liaison au ligand de RXRα est très dynamique, même en présence d'un ligand agoniste. Nous avons utilisé les données expérimentales (HDX, RMN et X-ray) disponibles sur ce domaine pour mettre en place un protocole, basé sur la dynamique moléculaire accélérée, permettant d'explorer efficacement la dynamique conformationnelle du domaine de liaison au ligand de RXRα et de valider les ensembles conformationnels obtenus. Ce protocole a été appliqué pour analyser l'influence de la phosphorylation pSer260, située à proximité de la surface d'interaction avec les protéines coactivatrice et impliquée dans le développement de carcinomes hépatocellulaires, sur la structure de ce domaine et sa dynamique. Parallèlement, une méthode de réduction de la dimensionnalité a été développé afin d'analyser de longues trajectoires de dynamique moléculaire. Ainsi grâce à cette méthode, nous avons pu identifier plusieurs nouvelles conformations alternative stables du domaine de liaison au ligand de RXRα. / Many studies reveal that the ligand binding domain of RXRα is very dynamic, still even in a presence of an agonist ligand. Therefore, the availability of experimental data (HDX, NMR and X-ray) on the domain was used as a leverage in order to set up a protocol, based on accelerated molecular dynamics, to explore its conformational dynamic and to validate it. This protocol was applied to understand the influence of the pSer260 phosphorylation, closed to the binding surface of coactivator proteins and implied in the hepatocellular carcinoma growth, on its structure and its dynamic. At the same time, a dimensional reduction method was developed to analyse long molecular dynamic trajectories. Thus, with this approach, we identified a couple of new alternative and stable conformations of the ligand binding domain of RXRα.

Τα καρκινώματα του λάρυγγα και του λαρυγγοφάρυγγα αποτελούν τη συχνότερη κακοήθη νεοπλασία Κεφαλής & Τραχήλου. Οι προκαρκινικές βλάβες είναι ενδιάμεσοι σταθμοί της καρκινογένεσης, που καταλήγει στον καρκίνο. Παράλληλα με την καρκινογένεση συμβαίνει ενεργοποίηση κυττάρων του υποεπιθηλιακού στρώματος. Η χημειοπρόληψη είναι απόπειρα φαρμακολογικής ανακοπής της καρκινογένεσης. Ο πυρηνικός υποδοχέας PPARγ καταλήγει σε διαφοροποίηση αρκετών κυττάρων. Ο RXRα ετεροδιμερίζεται με τον PPARγ και άλλους πυρηνικούς υποδοχείς. Ο μεταγραφικός παράγοντας NF-κB ενισχύει την κυτταρική επιβίωση και φλεγμονή. Ο μεμβρανικός υποδοχέας EGFR κινητοποιεί μιτογόνες διαδικασίες. Η COX-2 συνθέτει προσταγλανδίνες. Κατά την παρούσα εργασία, μελετήθηκε με ανοσοϊστοχημεία σε τομές παραφίνης η έκφραση των πέντε μορίων στο φυσιολογικό λαρυγγικό επιθήλιο, προκαρκινικές βλάβες και καρκινώματα διαφόρων Grade, καθώς και το υποκείμενο στρώμα, σε ιστικά δείγματα λάρυγγα από 127 ασθενείς. Από τους PPARγ, NF-κB(υπομονάδα p65) και RXRα, που εμφάνισαν μεικτή υποκυττάρια εντόπιση, οι δύο πρώτοι αναγνωρίστηκαν κυρίως στο κυτταρόπλασμα και ο τρίτος στον πυρήνα. Οι EGFR και COX-2 παρουσίασαν μεμβρανική και κυτταροπλασματική ανοσοδραστικότητα αντίστοιχα. Η έκφραση του υποδοχέα PPARγ συσχετίστηκε θετικά με την καλή διαφοροποίηση των όγκων. Ο RXRα ελαττώθηκε κατά την καρκινογένεση. Τα επίπεδα των παραγόντων NF-κB, EGFR και COX-2 παρουσίασαν αύξηση στην καρκινογένεση. Η COX-2 συσχετίστηκε αρνητικά με το Grade των όγκων. Στις υπόλοιπες συσχετίσεις μελετήθηκε η συνέκφραση των παραγόντων σε κάθε ασθενή. Παρατηρήθηκε στο φυσιολογικό και προνεοπλασματικό επιθήλιο, θετική σχέση της COX-2 με τους υπόλοιπους παράγοντες. Επιβεβαιώθηκε η συνέργεια των PPARγ & RXRα, ως προς την πρόκληση διαφοροποίησης στα καρκινικά κύτταρα. Διαπιστώθηκε κατασταλτική επίδραση του PPARγ στην καρκινογόνο δράση του NF-κB. Αποκαλύφθηκε συνεργιστική δράση της COX-2 στην PPARγ-εξαρτώμενη διαφοροποίηση, οφειλόμενη πιθανόν σε προσφορά της 15d-PGJ2, από το ένζυμο στον πυρηνικό υποδοχέα. Κατά την εκτίμηση του μικροπεριβάλλοντος, αξιολογήθηκε η έκφραση σε συνάρτηση με την ύπαρξη καρκινώματος και το βαθμό διαφοροποίησής του. Οι μυοϊνοβλάστες που περιβάλλουν καρκινώματα (CAFs), παρουσιάζουν επαγωγή των RXRα, NF-κB και COX-2. Μάλιστα η υψηλή έκφραση COX-2 στους CAFs, συνδυάζεται με υψηλό Grade. Ενεργοποίηση στους CAFs, συνδέεται με υπερ-δραστήρια NF-κB σηματοδότηση στο καρκίνωμα. Ο NF-κB υπερεκφράζεται στα λεμφοκύτταρα που διηθούν τους όγκους (TILs). Επίσης τα μακροφάγα γύρω από νεοπλάσματα (TAMs), περιέχουν υψηλό PPARγ. Η χρήση αγωνιστών των PPARγ, RXRα, με παράλληλη αναστολή των NF-κB, EGFR και COX-2, θα είχε πιθανότατα ευνοϊκό αποτέλεσμα στην αναστροφή της λαρυγγικής καρκινογένεσης. Το χημειοπροληπτικό σχήμα, θα ήταν ωφέλιμο να τροποποιείται ύστερα από εξατομικευμένη αξιολόγηση του δικτύου των πέντε παραγόντων. / Carcinomas of the larynx and laryngopharynx are the most common malignancies of the Head&Neck. The precancerous lesions are mid-points of carcinogenesis, which results in cancer. Carcinogenesis is accompanied by reactive initiation of stromal cells. Chemoprevention pursues the arrest of carcinogenesis, by pharmacological means. PPARγ, a nuclear receptor, promotes cellular differentiation. The nuclear receptor RXRα partners with PPARγ or other members of the superfamily. The transcription factor NF-κB enhances cell survival and inflammation. The receptor EGFR receives growth signals. The enzyme COX-2 perpetuates inflammation by means of prostaglandin synthesis. The present study, utilizing paraffin section immunohistochemistry, assessed expression of the five molecules in normal laryngeal epithelium, precancerous lesions and carcinomas, along with their adjacent stroma. Clinical samples were derived from 127 patients who had undergone biopsy or laryngectomy. Of the three molecules demonstrating mixed subcellular presence, PPARγ and NF-κB(p65 subunit) localized more frequently in cytoplasm, whereas RXRα expression was mainly nuclear. EGFR and COX-2 staining patterns were membranous and cytoplasmic, respectively. PPARγ correlated with high tumor differentiation. RXRα was diminished in dysplasia and cancer. NF-κB, EGFR and COX-2, were upregulated as tumorigenesis progressed. COX-2 showed an inverse relationship with tumor Grade. The remaining correlations are based on coexpression analysis of the aforementioned factors. COX-2 was positively associated in normal and preneoplastic epithelia with the four regulating proteins. The data verify the synergistic effect of PPARγ and RXRα, regarding potentiation of neoplastic cell differentiation. Suppressive influence of PPARγ on NF-κB–mediated carcinogenesis was manifested. COX-2 overexpression was shown to reinforce the beneficial role of PPARγ in cell differentiation, probably due to production of the receptor agonist 15d-PGJ2. Subepithelial stroma was examined with regard to immunoreactivity in relation to the presence of invasion as well as to tumor Grade. Carcinoma Associated Myofibroblasts (CAFs), manifested upregulation of RXRα, NF-κB and COX-2, which mediate in concert angiogenesis, inflammation, and tumor spread. Intense COX-2 expression in CAFs, correlated with poor tumor differentiation. CAF activation was associated with intense NF-κB signalling in cancer cells. NF-κB was overexpressed in Tumor Infiltrating Lymphocytes (TILs). Finally, in Tumor Associated Macrophages (TAMs), PPARγ was induced. PPARγ, RXRα agonists, combined with NF-κB, EGFR and COX-2 inhibitors, would likely restrain laryngeal carcinogenesis. Subtle variations in the chemopreventive regimen, based on personalized molecular profiling, would hopefully achieve a patient-tailored therapeutic approach.

Ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης είναι η τέταρτη συχνότερη κακοήθεια στους άνδρες και η δέκατη στις γυναίκες και η ετήσια επίπτωσή του αυξάνει συνεχώς στις ανεπτυγμένες χώρες. Oι προγνωστικοί παράγοντες που χρησιμοποιούνται σήμερα δεν μπορούν να προβλέψουν με βεβαιότητα την μακροπρόθεσμη έκβαση του ουροθηλιακού καρκίνου και έτσι προκύπτει η ανάγκη αναγνώρισης δεικτών με δυνατότητα πρόγνωσης της συμπεριφοράς των καρκινωμάτων. Επιπλέον, δεδομένων των περιορισμένων δυνατοτήτων των σημερινών θεραπευτικών επιλογών (χειρουργική αντιμετώπιση, χημειοθεραπεία ή ανοσοθεραπεία και ακτινοθεραπεία), απαιτούνται νέες θεραπευτικές στρατηγικές. Μία τέτοια στρατηγική είναι η στόχευση σε μεταγραφικούς παράγοντες όπως οι πυρηνικοί υποδοχείς και οι upstream ενεργοποιητές τους. Η διαταραχή αυτών των μεταγραφικών παραγόντων είναι κομβικό σημείο της έναρξης και διατήρησης του κακοήθους φαινοτύπου. O πυρηνικός υποδοχέας PPARγ εμπλέκεται στον έλεγχο του μεταβολισμού, την κυτταρική ανάπτυξη, την αγγειογένεση και την ανοσολογική και φλεγμονώδη απάντηση. Επιπρόσθετα, υπάρχουν ενδείξεις ότι ρυθμίζει τους μηχανισμούς καταστολής αλλά και προαγωγής της καρκινογένεσης. Ο RXRα είναι επίσης μέλος της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων και ετεροδιμερίζεται με τον PPARγ προς σχηματισμό του συμπλόκου που αλληλεπιδρά με το DNA. Οι προσδέτες των RXR υποδοχέων έχουν ήδη χρησιμοποιηθεί στη χημειοπρόληψη διαφόρων μορφών καρκίνου. Ο μεταγραφικός παράγoντας AP-1, απαρτίζεται από διμερή των Fos και Jun πρωτεϊνών και η δράση του σχετίζεται με την πρόοδο της καρκινογένεσης. Υπάρχουν πάντως και ενδείξεις για προ-αποπτωτική δράση του. Η CBP είναι ένας απ’ τους σημαντικότερους ολοκληρωτές σημάτων της μεταγραφής. Ο ανταγωνισμός μεταξύ των PPARγ και AP-1 για τη CBP είναι ένας απ’ τους μηχανισμούς που εξηγούν την αρνητική «συνομιλία» (cross-talk) μεταξύ των PPARγ και AP-1. Στην παρούσα μελέτη εξετάσαμε τόσο ξεχωριστά όσο και σε συνδυασμό μεταξύ τους, την έκφραση των πέντε μοριακών παραγόντων (PPARγ, RXRα, p-c-Jun, c-Fos, CBP) στο φυσιολογικό ουροθήλιο, τις προκαρκινικές αλλοιώσεις και τα ουροθηλιακά καρκινώματα (ΟΚ). Τα ιστικά δείγματα προήλθαν από 88 ασθενείς οι οποίοι υπέστησαν διαγνωστική βιοψία ή θεραπευτική κυστεκτομή, νεφρεκτομή ή ουρητηρεκτομή. Εφαρμόστηκε η ανοσοϊστοχημική μέθοδος σε τομές παραφίνης και εκτιμήθηκε η σχετική έκφραση των μελετώμενων παραγόντων στα ενδοκυττάρια διαμερίσματα, τις ενδοεπιθηλιακές στιβάδες και τις φυσιολογικές ή παθολογικές ιστολογικές βαθμίδες. Όλοι οι παράγοντες παρουσίασαν κυρίως πυρηνική εντόπιση. Η έκφραση του p-c-Jun ελαττώνεται στους ασθενείς άνω των 70 ετών σε σχέση με τους νεώτερους, ενώ κανένα άλλο απ’ τα μελετώμενα μόρια δε φαίνεται να επηρεάζεται από την ηλικία. Η έκφραση των PPARγ, CBP, p-c-Jun και c-Fos σημειώνει αύξηση κατά την πορεία προς τον καρκίνο. Όσο αφορά στα ΟΚ, οι PPARγ και CBP παρουσιάζουν αρνητική συσχέτιση με την αποδιαφοροποίηση. Επιπλέον ο PPARγ συσχετίζεται αρνητικά με την απόκτηση χαρακτήρων διήθησης στα ΟΚ. Αντιθέτως, η έκφραση του RXRα δεν διακυμαίνεται στατιστικώς σημαντικά σε όλη την πορεία της καρκινογένεσης. Η ανάλυση της συνδυασμένης έκφρασης των πέντε παραγόντων έγινε με σκοπό την αποκάλυψη ενδεχόμενων αλληλεπιδράσεων μεταξύ τους. Η προστατευτική δράση του PPARγ στο ουροθήλιο συνοδεύεται από ταυτόχρονη μέτρια ή ισχυρή έκφραση των RXRα, p-c-Jun και c-Fos. Αναλυτικά, η αυξανόμενη έκφραση του p-c-Jun συμπίπτει με ενίσχυση της θετικής συσχέτισης του PPARγ με καλύτερα διαφοροποιημένους, λιγότερο διηθητικούς όγκους, ενώ ο c-Fos φαίνεται να εξασθενίζει ήπια την ευνοϊκή δράση του PPARγ στη διαφοροποίηση του ουροθηλίου. Η αυξανόμενη έκφραση της CBP έδειξε να εξασθενίζει και τελικά να εκμηδενίζει τη στατιστικά σημαντική αύξηση του PPARγ στην πορεία προς τον καρκίνο και την επαγωγή του στους μη διηθητικούς όγκους σε σύγκριση με τους διηθητικούς. Ταυτόχρονα, η αρνητική σχέση της CBP με την αποδιαφοροποίηση και την αύξηση της κακοήθειας των ΟΚ επηρεάζεται από την παρουσία των PPARγ και AP-1, επιβεβαιώνοντας την υπόθεση της συνομιλίας αυτών των μοριακών παραγόντων. Ενδιαφέρουσα είναι η παρατήρηση ότι οι περισσότερες από τις αναφερθείσες πιο πάνω συσχτίσεις μεταξύ των μοριακών παραγόντων ίσχυαν για μεγαλύτερους των 70 ετών αλλά όχι πάντα για τους νεώτερους ασθενείς. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης μπορούν πιθανόν να οδηγήσουν σε συμπεράσματα με εφαρμογή σε χημειοπροληπτικές και θεραπευτικές στρατηγικές για τον ουροθηλιακό καρκίνο. / Bladder cancer is the fourth and tenth most common malignancy in men and women, respectively, and its incidence is increasing annually in the developed countries. Current prognostic parameters cannot predict with certainty the long-term outcome of bladder cancer and as a result there is a need to identify markers that may predict tumor behavior. Furthermore, given the limitations of current therapeutic options (surgery, chemotherapy or immunotherapy and radiotherapy), novel treatment strategies are very much needed. One such strategy targets transcription factors such as nuclear receptors and their upstream activators. Disruption of these transcription factors is a key element in the initiation and maintenance of a malignant phenotype. The nuclear receptor PPARγ is involved in controlling metabolism, cell growth, angiogenesis, and immune and inflammatory responses. In addition, it has also been suggested that it regulates tumor suppression as well as tumor promotion. RXRα is another member of the nuclear receptor superfamily, that partners PPARγ to form the DNA-binding complex. RXR ligands are already being used as chemopreventive agents in various types of cancer. The transcription factor AP-1 is formed by dimerization of Jun and Fos proteins and its activity is often associated with tumor progression. On the other hand, there is also evidence that AP-1 may enhance apoptosis. CBP is one of the most important transcriptional integrators. The competition of PPARγ and AP-1 for CBP is one of the multiple mechanisms that explain the negative PPARγ/AP-1 cross-talk. In the present study, we assessed separate and concurrent expression of the five factors (PPARγ, RXRα, p-c-Jun, c-Fos, CBP) in normal urothelium, precancerous lesions and urothelial carcinomas (UC). Clinical samples were derived from 88 patients who had undergone diagnostic biopsy or therapeutic excision of the bladder, the kidney or the ureter. Parafin section immunohistochemistry was utilized and relative expression was estimated in intracellular compartments, intraepithelial layers and histologic categories of urothelium. All five factors had mainly nuclear pattern of expression. P-c-jun was downregulated in patients older than 70 years old compared to younger ones, whereas age did not affect the expression of the rest four factors. PPARγ, CBP, p-c-Jun and c-Fos were upregulated towards tumorigenesis. PPARγ and CBP showed an inverse relationship with carcinoma level of differentiation. Moreover, PPARγ expression downregulated significantly in invasive tumors compared to non-invasive ones. On the contrary, RXRα expression did not vary significantly along the carcinogenesis course. The following correlations were based on coexpression analysis to reveal molecular interactions between the five factors. The established protective effect of PPARγ on urothelium was accompanied by concomitant RXRα, p-c-Jun and c-Fos moderate or strong expression. In detail, p-c-Jun’s increasing expression strengthened the positive relation of PPARγ with better differentiated, less invasive tumors, whereas c-Fos seemed to mildly lessen PPARγ’s favourable effect in urothelium differentiation. Statistically significant PPARγ upregulation in malignant tissues compared to normal urothelium and in non-invasive tumors compared to invasive ones is suppressed and finally cancelled by CBP’s increasing expression. PPARγ and AP-1 seemed to influence the negative relation of CBP with loss of differentiation and increase of malignant potential in UC, an observation that denotes a cross-talk between these molecular factors. Interestingly, most of the aforementioned correlations were noticed in patients older than 70 years old, but not all of them were plausible in younger patients. The results from the present study could lead to conclusions possibly applicable in chemoprevention and therapy strategies for urothelial carcinomas.