Interstrand DNA crosslinks (ICLs) são importantes lesões genotóxicas que podem causar morte celular se não for devidamente reparadas. Diversas drogas antitumorais atuam através da indução de ICLs no DNA, e a resistência a essas drogas está muitas vezes relacionada à maior capacidade de células tumorais para reparar tais lesões. As ICLs são lesões complexas que requerem o envolvimento de diferentes vias de reparação, tais como BER NER, TLS e vias de reparação de DSBs (RH e NHEJ). Além disso, foi demonstrado que Pso2p desempenha um papel importante na reparação de ICLs. Muitos estudos também apontam para as alterações epigenéticas como essenciais para a sobrevivência da célula em resposta ao dano genotóxico, através da indução de checkpoints de ciclo celular e da modulação da eficiência (e, possivelmente, da escolha) das vias de reparação de DNA. Assim, a primeira parte desta Tese apresenta uma revisão dos mecanismos envolvidos na citotoxicidade dos ICLs induzidos pela furocumarina bifuncional 8-metoxipsoraleno (8-MOP) em Saccharomyces cerevisiae. A abordagem adotada discute a ação integrada de proteínas que atuam em vias de reparação de DNA envolvidas na remoção de ICLs, em combinação com fatores envolvidos no remodelamento da cromatina dependente de ATP. A fim de investigar o papel do remodelamento da cromatina em resposta a danos ao DNA induzidos pelo tratamento com furocumarinas mono e bifuncionais fotoativadas e ditelureto de difenila (DTDF), foram utilizadas linhagens de S. cerevisiae deficientes em diferentes proteínas relacionadas com a reparação do DNA e o remodelamento da cromatina. DTDF é um composto organotelurado proposto como um protótipo potencial para o desenvolvimento de novas drogas antitumorais. A sensibilidade do mutante pso2Δ ao DTDF, semelhante à observada para o 8-MOP, indica que este composto pode induzir lesões capazes de bloquear a replicação do DNA, tais como ligações cruzadas ou DSBs hairpin capped. Os resultados obtidos mostraram que os duplos mutantes pso2Δswr1Δ e rad52Δswr1Δ não são mais sensíveis aos agentes testados, DTDF, 3-CPS e 8-MOP, do que o mais sensível dos simples mutantes (pso2Δ e rad52Δ, respectivamente). Tendo em mente que Rad52p e Pso2p não têm interação epistática (aditiva ou sinergística) na reparação das lesões fotoinduzidas por 3-CPS e 8-MOP, sugere-se que Pso2p pode fornecer substrato para vias de reparação diferentes de HR, que poderiam ser NHEJ canônica e/ou MMEJ. O fato de que swr1Δ (deficiente em NHEJ) não aumenta a sensibilidade dos duplos mutantes, além da baixa sensibilidade observada para o mutante yku80Δ ao DTDF e à fotoadição de psoralenos, sugere que as lesões induzidas podem ser direcionadas para as vias HR ou MMEJ, ao invéz de NHEJ canônica. O envolvimento da via MMEJ sujeita a erros na reparação de lesões induzidas por DTDF pode explicar a indução de mutação frameshift, observada para este agente. Além disso, investigou-se a citotoxicidade induzida pelas drogas antitumorais cisplatina (CDDP), 5-fluorouracil (5-FU) e sua combinação, em S. cerevisiae. Os resultados obtidos com os mutantes de reparação do DNA mostraram que a sensibilidade à CDDP + 5-FU parece refletir a sensibilidade de linhagens específicas a cada droga utilizada individualmente. Este resultado sugere que o efeito intensificado do tratamento combinado na terapia do câncer pode ser devido à ação de cada agente isoladamente, conforme observado em clones diferentes da população heterogênea de células transformadas. Os resultados referentes aos mutantes em remodelamento da cromatina demonstraram que o tratamento com CDDP + 5-FU provoca uma resposta mais eficaz na indução de morte celular, nos mutantes deficientes em CR (ino80Δ), HATs (elp3Δ, gcn5Δ, hat2Δ e hpa2Δ), HDACs (sin3Δ, sir2Δ, hos2Δ , hst1Δ, hst2Δ, e hst3Δ), HML (dot1Δ) e HMT (erg6Δ), enquanto CDDP induz sensibilidade em mutantes HAT, além do mutante de HDAC hos3Δ, e o tratamento com 5-FU induz sensibilidade em HAT (gcn5Δ) e HDAC (sin3Δ e hos3Δ). Esses resultados apontam para o envolvimento de proteínas de remodelamento da cromatina como importantes alvos terapêuticos em resposta a agentes genotóxicos. Portanto, os resultados obtidos podem abrir novas perspectivas para a compreensão dos mecanismos envolvidos na resposta ao tratamento com CDDP + 5-FU, bem como auxiliar na escolha dos melhores protocolos terapêuticos. / Interstrand DNA crosslinks (ICLs) are important genotoxic lesions that can cause cell death if not properly repaired. Several antitumoral drugs act by inducing ICLs in DNA, and the resistance to these drugs is often related to an increased capacity of tumor cells to repair such lesions. The ICLs are complex lesions requiring involvement of different pathways for repair, such as BER, NER, TLS and DSB repair pathways (HR and NHEJ). In addition, Pso2p was shown to play an important role in ICLs repair. Many studies also point to the epigenetic changes as essential for cell survival in response to genotoxic damage, through induction of cell cycle checkpoints and modulating the efficiency (and possibly, the choice) of the DNA repair pathways. So, the first part of this Thesis gives a review of the mechanisms involved in the cytotoxicity of the ICLs induced by the bifunctional furocumarin 8-methoxypsoralen (8-MOP) in Saccharomyces cerevisiae. The adopted approach discusses the integrated action of proteins that work in the DNA repair pathways involved in ICLs removing in combination with factors involved in ATP-dependent chromatin remodeling. In order to investigate the role of the chromatin remodeling in response to DNA damage induced by treatment with mono- and bifunctional photoactivated furocumarins and diphenyl ditelluride (DPDT), we used S. cerevisiae strains deficient in different proteins related to DNA repair and chromatin remodeling. DPDT is organotellurium compound proposed as a potential prototype for development of new antitumoral drugs. The sensitivity of pso2Δ to DPDT, similar to that observed for 8-MOP, indicates that this compound could induce lesions able to block DNA replication, such as crosslinks or hairpin-capped DSBs. The obtained results showed that the double mutants pso2Δswr1Δ and rad52Δswr1Δ are not more sensitive to the tested DPDT, 3-CPS and 8-MOP agents than the more sensitive single mutant (pso2Δ and rad52Δ, respectively). Having in mind that Rad52p and Pso2p have non-epistatic interaction (additive or synergistic) in the repair of 3-CPS and 8-MOP photoinduced lesions, we suggest that Pso2p could provide substrate for repair pathway different from HR, which could be canonical NHEJ and/or MMEJ. The fact that swr1Δ (deficient in NHEJ) do not enhance the sensitivity of the double-mutants, in addition to the observed low sensitivity of the yku80Δ mutant to DPDT and psoralens photoaddition, suggests that the induced lesions could be directed to HR or MMEJ pathways rather than to canonical NHEJ. The involvement of the error-prone MMEJ in repair of DPDT-induced lesions could explain the observed frameshift mutation induction by this agent. Moreover, we investigated the cytotoxicity induced by the antitumoral drugs cisplatin (CDDP), 5-fluorouracil (5-FU), and their combination in S. cerevisiae. The results obtained with DNA repair mutants showed that the sensitivity to cisplatin + 5-FU appears to reflect the sensitivity of the specific strains to each individual drug used. This finding suggests that the enhanced effect of the combined treatment in cancer therapy could be due to the action of each agent alone, as observed on different clones from the heterogeneous population of transformed cells. The results concerning chromatin remodeling mutants demonstrated that CDDP + 5-FU treatment causes a more effective response in the induction of cell death, in CR (ino80Δ), HATs (elp3Δ, gcn5Δ, hat2Δ and hpa2Δ), HDACs (sin3Δ, sir2Δ, hos2Δ , hst1Δ, hst2Δ, and hst3Δ), HML (dot1Δ) and HMT (erg6Δ) mutants, while CDDP induces sensitivity in HAT mutants, besides the HDAC mutant hos3Δ, and 5-FU treatment induces sensitivity in HAT (gcn5Δ) and HDACs (sin3Δ and hos3Δ). These results point to involvement of chromatin remodeling proteins as important therapeutic targets in response to genotoxic agents. Therefore, our findings could provide new insights for understanding the mechanisms involved in the response to treatment with CDDP + 5-FU, as well as to help in the choice of optimal therapeutic protocols.

O vinho é a bebida obtida por meio da fermentação alcoólica do mosto simples de uva sã, fresca e madura. Durante o processo fermentativo, realizado por leveduras Saccharomyces cerevisiae, ocorre uma sucessão de microrganismos. Espécies pertencentes aos gêneros Brettanomyces e Dekkera permanecem no produto final podendo influenciar de forma negativa ao produzirem compostos fenólicos voláteis. Estas leveduras apresentam como uma de suas características a lenta taxa de crescimento. Com isto, este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de meio de cultivo para isolamento e detecção destas leveduras e de metodologia molecular para detecção independente de cultivo. O meio de cultivo desenvolvido permitiu o isolamento e também a diferenciação de leveduras dos gêneros Brettanomyces e Dekkera das demais leveduras comumente encontradas em vinho. Uma metodologia molecular, baseada em PCR convencional, foi desenvolvida para a detecção dos gêneros em vinhos. Inicialmente foram construídos dois pares de oligonucleotídeos. Um par universal para leveduras e outro específico para D. bruxellensis. O primeiro par apresentou ampla aplicabilidade na avaliação da efetividade de diferentes processos de extração de DNA e na detecção de compostos inibidores presentes em amostras de vinho. A utilização de ambos os pares permitiu o desenvolvimento de um protocolo de extração e amplificação de DNA diretamente de amostras de vinho, facilitando a identificação de leveduras D. bruxellensis e permitindo a tomada de decisão em tempo hábil de evitar perdas econômicas. / The wine is a beverage obtained by alcoholic fermentation of simple must of healthy, fresh and mature grape. During the fermentation process, carried out by Saccharomyces cerevisiae yeasts, these is a succession of microorganisms. Species belonging to the genera Brettanomyces and Dekkera remain in the final product can influence negatively by producing volatile phenolic compounds. These yeasts present as one the features of the slow rate of growth. This work aimed at the development of culture media for isolation and detection of these strains and molecular methods for detection of independent culture. The medium developed also allowed the isolation and differentiation of yeasts of the genera Brettanomyces and Dekkera yeasts from other commonly found in wine. A molecular approach, based on conventional PCR, was developed for the detection of genera in wines. Initially we constructed two sets of primers. A universal pair for yeast and other specific for D. bruxellensis. The first pair showed a broad applicability in evaluating the effectiveness of various procedures for DNA extraction and detection of inhibitory compounds present in wine samples. The use of both pairs allowed development of a protocol for extracting and amplifying DNA directly from wine samples, facilitating the identification of yeasts D. bruxellensis and allowing the decision-making in a timely manner to avoid economic losses.

Resumo não disponível

Os polímeros do tipo poli-hidroxialcanoatos (PHAs) são poliésteres bacterianos que apresentam as propriedades de termoplásticos e elastômeros biodegradáveis. A síntese deste polímero em plantas de interesse agroindustrial tem sido vista como uma área promissora dentro da biotecnologia de polímeros para a produção em grande escala com baixos custos. Contudo, esta tarefa requer o aprimoramento de diferentes metodologias bioquímicas e moleculares, além de maximizar os processos de extração destes polímeros biológicos. A produção de PHAs em peroxissomos ou no citoplasma de Saccharomyces cerevisiae, por meio da expressão de uma PHA-sintase bacteriana, pode servir como indicador e modulador do fluxo de carbonos que percorre vias biossintéticas como a síntese de novo de ácidos graxos e a β-oxidação. Esta levedura tem sido usada como eucarioto modelo para manipular as rotas envolvidas na síntese de PHAs do tipo MCL (PHA com um número médio de carbonos), um polímero menos cristalino e com menor ponto de fusão quando comparado ao PHA-SCL (PHA com um número pequeno de carbonos). A enzima PhaG (3-hidroxidecanoil-ACP-CoA transacilase) é responsável pela conexão entre a síntese de ácidos graxos e a produção de PHA-MCL em bactérias do gênero Pseudomonas, em meios de cultura contendo uma fonte de carbono nãorelacionada como gliconato, etanol ou acetato. Para tentar estabelecer esta rota metabólica em S. cerevisiae, o presente trabalho avaliou a coexpressão de PhaGPa e PhaC1Pa (PHA-sintase) de P. aeruginosa para a síntese de PHA-MCL a partir de uma fonte de carbono não-relacionada em leveduras. Contudo, a presença de PhaGPa não alterou a composição ou a quantidade de PHA-MCL em relação à cepa controle contendo apenas PhaC1Pa citoplasmática ou direcionada ao peroxissomo, independentemente da fonte de carbono utilizada (rafinose ou ácido oléico). Este resultado permite sugerir que a ligação entre a síntese de ácidos graxos e a produção de PHA-MCL em S. cerevisiae não foi estabelecida, provavelmente devido à ausência de algum passo enzimático que limita o desvio de substratos da síntese de ácidos graxos para a produção de PHA-MCL em organismos que não são capazes de acumular naturalmente este polímero quando cultivados em fontes de carbono não-relacionadas.A levedura S. cerevisiae tem sido usada como um sistema modelo para estudar a β-oxidação de ácidos graxos insaturados em peroxissomos. A produção de PHA-MCL pela expressão de PhaC1Pa em peroxissomos de cepas selvagens e mutantes nulos de S. cerevisiae para as enzimas auxiliares da β-oxidação (Eci1p, Sps19p e Dci1p), multiplicadas em meio de cultivo contendo um ácido graxo insaturado como fonte de carbono, permitiu monitorar o fluxo de carbonos que percorre as vias dependente de isomerase, redutase e di-isomerase. Desta forma, o presente estudo permitiu avaliar a β- oxidação in vivo dos ácidos graxos linoléico conjugado, 9-cis,11-trans-CLA (ácido rumênico) ou 10-cis,13-cis-nonadecadienóico, para determinar a contribuição das vias alternativas na degradação destes substratos pela utilização de cepas selvagens, mutantes nulos e linhagens contendo um plasmídio multicópia para os genes ECI1 (Δ3- Δ2-enoil-CoA isomerase), SPS19 (2,4-dienoil-CoA redutase) e DCI1 (Δ3,5-Δ2,4-dienoil- CoA isomerase). As linhagens selvagens foram capazes de sintetizar PHA-MCL quando cultivadas em ácido rumênico, mas a atividade da enzima Eci1p foi essencial para a degradação deste CLA, indicando que a via dependente de isomerase é a única rota in vivo necessária para a β-oxidação do ácido rumênico em peroxissomos de S. cerevisiae. A contribuição da enzima di-isomerase (Dci1p) para a degradação do ácido 10- cis,13-cis-nonadecadienóico foi avaliada em cepas selvagens, mutantes nulos dci1Δ e linhagens de S. cerevisiae contendo os plasmídeos multicópia. De acordo com o conteúdo e a quantidade de PHA formado, a β-oxidação de ácidos graxos cisinsaturados em um carbono ímpar é, in vivo, independente da di-isomerase. Embora este resultado possa indicar o mesmo padrão de envolvimento de Dci1p na degradação de ácidos graxos cis-insaturados em um carbono ímpar em mitocôndrias de mamíferos, esta via alternativa deve ser mais bem investigada em eucariotos superiores.

As nitrorredutases compreendem uma família de proteínas conservadas evolutivamente e originalmente identificadas em eubactérias. São enzimas capazes de catalisar a redução do grupo nitro e utilizam FMN (flavina mononucleotideo) ou FAD (flavina adenina dinucleotídeo oxidado) como grupo prostético e NADPH (nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzido) ou NADH (nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido) como agentes redutores. As nitrorredutases podem ser encontradas em bactérias e em menor extensão em eucariotos. Dois subgrupos de nitrorredutases foram caracterizados em bactérias: oxigênio-insensível ou tipo I e oxigênio-sensível ou tipo II. Na levedura Saccharomyces cerevisiae duas prováveis nitrorredutases, Frm2p/Hbn1p foram identificadas. Em relação às enzimas pertencentes à família das nitrorredutases não se tem conhecimento sobre a sua função biológica, bem como em relação à sua posição filogenética. Tendo isso em vista, o objetivo deste trabalho é esclarecer a possível função das proteínas Frm2 e Hbn1 de Saccharomyces cerevisiae na resposta ao estresse oxidativo, bem como determinar a posição filogenética e a sua presença em outros organismos procariotos e eucariotos. Os resultados da análise filogenética mostram que bactérias possuem seqüências similares a Frm2p/Hbn1p (denominadas Nr1Ap) que formam um clado distinto dentro da família Frm2p/Hbn1p. Análises de agrupamentos hidrofóbicos (HCA) e modelagem tri-dimensional foram realizadas para comparar regiões conservadas entre proteínas Nr1Ap e Frm2p/Hbn1p. A nitrorredutase Frm2p possivelmente esteja atuando na via de sinalização lipídica, enquanto a função da Hbn1p é desconhecida. Entretanto, alguns estudos têm indicado que as nitrorredutases podem estar envolvidas na resposta a estresse oxidativo. Com o objetivo de esclarecer a função de Frm2p e Hbn1p, foi avaliada a sensibilidade de linhagens de levedura proficientes e deficientes em ambas proteínas ao estresse oxidativo, investigando a competência respiratória, as atividades de enzimas antioxidantes, a produção intracelular de espécies reativas de oxigênio (EROs) e a peroxidação lipídica. Os resultados mostram uma menor atividade basal de superóxido dismutase (SOD) e elevada sensibilidade a óxido de 4-nitroquinolina (4-NQO) e Nnitrosodietilamina (NDEA), indução de mutantes citoplasmáticos (petites), produção intracelular de EROs e peroxidação lipídica quando expostas a estes agentes geradores de superóxido nas linhagens frm2 , hbn1 e frm2 hbn1 . Ainda podemos observar elevada atividade basal de catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e conteúdo de glutationa (GSH) nas linhagens frm2 e frm2 hbn1. Estas linhagens possuem menor produção de EROs e peroxidação lipídica quando expostas aos agentes geradores de peróxidos H2O2 e t-BOOH. Isso sugere que a ausência da Frm2p é o fator responsável por estas alterações vistas. Portanto, neste trabalho foi mostrada a influência das nitrorredutases Frm2 e Hbn1 na resposta ao estresse oxidativo em S. cerevisiae, pela modulação da atividade das enzimas antioxidantes, SOD, CAT e GPx, bem como do conteúdo de GSH. Adicionalmente também foi constatado que as nitrorredutases Frm2p e Hbn1p provavelmente não atuam na metabolização de nitrocompostos. Estes resultados são consistentes com os dados encontrados na análise filogenética, que apontam estas proteínas como constituindo uma nova família de prováveis nitrorredutases ainda não caracterizada, encontrada em bactérias e fungos. / The nitroreductase family comprises a group of FMN (flavine mononucleotide) ou FAD (flavine adenine dinucleotíde oxidade)-dependent enzymes able to metabolize nitrosubstituted compounds using the reducing power of NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide fosfate reduzide) or NADH (nicotinamide adenine dinucleotide reduzide). The nitroreductases can be found within bacterial species and, in a less extend, in eukaryotes. Two types of nitroreductase subgroups were characterized in bacteria: oxygen-insensitive or type I and oxygen sensitive or type II. In the yeast Saccharomyces cerevisiae two putative nitroreductase proteins, Frm2p and Hbn1p, were described. A feature of the nitroreductase family is our lack of knowledge about its biological function and evolutionary history. Taking into account these considerations, the purpose of this work was to elucidate the possible participation of these enzymes in response to oxidative stress as well as to determine the phylogenetic position of Frm2p and Hbn1p and the presence of homologous sequences in other prokaryotic and eukaryotic species. In order to obtain data about the phylogenetic position of Frm2p/Hbn1p, we performed an in-depth phylogenetic analysis of these proteins. The phylogenetic analysis of these proteins showed that bacterial cells have a Frm2p/Hbn1p-like sequences (termed NrlAp) which form a distinct clade within the fungal Frm2p/Hbn1p family. Hydrophobic cluster analysis (HCA) and three-dimensional protein modeling allowed us to compare conserved regions among NrlAp and Frm2/Hbn1p proteins. While Frm2p appears to act in the lipid signaling pathway, the function of Hbn1p is unknown. However, some works suggests a possible involvement from the nitroreductases in response the stress oxidative. In order to elucidate the functions of Frm2p and Hbn1p, we evaluate the sensitivity of proficient and deficient yeast strains for both proteins for oxidative stress, considering the respiratory competence, antioxidant enzyme activities, intracellular reactive oxygen species (ROS) production and lipid peroxidation. The results showed a weaker basal activity of superoxide dismutase (SOD) and higher sensitivity for 4-nitroquinoline-oxide (4-NQO) and NNitrosodiethylamine (NDEA), induction of petites, ROS production and lipid peroxidation when exposed the these superoxide generating agents. The results showed a higher basal activity of catalase (CAT), glutathione peroxidase (Gpx) and reduced glutathione (GSH) content in the single and double mutant strains frm2 and frm2 hbn1 . These strains were less ROS-producing and lipid peroxidation when exposed to peroxides-generating agents H2O2 and t-BOOH. Thus, the absence of Frm2p may be the event responsible for these alterations. Considering the data gathered in this work, we showed the influence of nitroreductases Frm2p and Hbn1p in response to oxidative stress in S. cerevisae yeast by modulation of antioxidant enzymes activities, such as SOD, CAT, GPx and GSH content. Additionally, it was showed that the nitroreductases Frm2p and Hbn1p are not envolved in the activation of nitrocompounds. Theses results are consistent with those found in the filogenetic analysis that indicated that theses proteins belong to the new bacterial and fungal Frm2p/Hbn1p nitroreductase-like family.

A resistência ao cloreto estanoso (SnCl2) nas células eucarióticas de levedura Saccharomyces cerevisiae é um produto de vários processos metabólicos. O mutante rad52 , deficiente no mecanismo de reparação recombinacional, incapaz de reparar quebras simples e duplas no DNA, foi o mais sensível ao íon metálico Sn²+. A resistência relativa dos mutantes rad e rad4 , deficientes na reparação por excisão de nucleotídeos (NER), mostrou-se significativamente elevada, indicando a participação dessa via na reparação dos danos causados pelo SnCl2. Uma série de mutantes defectivos na via de reparação por excisão de bases (BER), combinada com mutantes defectivos em NER, foi utilizada para determinar indiretamente o tipo de lesão causada pelo SnCl2 ao DNA. A DNA N-glicosilase (Ntg2p) mostrou-se, por sua vez, indispensável à reparação das lesões ao DNA induzidas pelo íon metálico Sn²+. A ausência do fator de transcrição Yap1, responsável pela resposta ao estresse oxidativo em leveduras, ocasionou o aumento da sensibilidade ao íon metálico Sn²+. Além disso, a sensibilidade dos mutantes sod1 e sod2 revelou a importância das enzimas antioxidantes Sod1p e Sod2p na resposta aos danos gerados pelo íon metálico Sn²+. A sensibilidade mais elevada ao SnCl2 foi observada quando as células estavam na fase exponencial de crescimento (fase LOG), o que sugere que há dois sistemas independentes (um mediado pela repressão/desrepressão catabólica, e outro, pela ativação da transcrição de genes envolvidos nas vias de defesa contra espécies reativas de oxigênio (EROs)), que atuam em conjunto e contribuem para a resistência aos danos causados pelo íon metálico Sn²+. Para determinar a concentração do íon metálico Sn²+ captada nas células da levedura S. cerevisiae e correlacioná-la com a toxicidade desse íon metálico, foi determinado o conteúdo de metal intracelular pelo método de Emissão de Raios-X Induzida por Partículas Carregadas, ou Particle Induced XRay Emission (PIXE), desenvolvendo-se um protocolo para as análises. Os resultados obtidos mostraram que a linhagem diplóide XS2316 captou 60% da quantidade total do íon metálico Sn²+, captada pela linhagem haplóide XV184-14c. Isso indica que a linhagem haplóide capta maior quantidade do íon metálico Sn²+ do que a linhagem diplóide, o que pode explicar a citotoxicidade diferenciada de ambas as linhagens quando tratadas com SnCl2. Por fim, utilizando-se a mesma metodologia, foi realizada uma análise multielementar para avaliar se havia uma interação entre o íon metálico Sn²+ e outros elementos químicos essenciais para a célula. De acordo com as análises por PIXE, após tratamento com SnCl2, a linhagem haplóide XV185-14c apresentou um decréscimo significativo nas quantidades de Mg, Zn, S e Fe, e, por outro lado, um aumento na quantidade de P. Para verificar como o íon metálico Sn²+ é captado, distribuído e destoxificado, foram associadas técnicas moleculares, incluindo ensaios de citotoxicidade e RT-PCR quantitativo (qRT-PCR), com a metodologia do PIXE. Os ensaios de sobrevivência mostraram que Fet4 e Zrt2, ambas proteínas de transporte de baixa afinidade do ferro e zinco, respectivamente, podem internalizar o íon metálico Sn²+. Por sua vez, qRT-PCR mostrou um aumento da expressão gênica de CCH1 e MID1, os quais codificam as proteínas Cch1 e Mid1, envolvidas no transporte de Ca²+ na membrana plasmática, sugerindo que essas duas proteínas também podem estar envolvidas na captação do íon metálico Sn²+. Os resultados indicaram que, uma vez dentro da célula, o íon metálico Sn²+ pode ser armazenado no vacúolo através da ação da proteína P-type ATPase Pmc1 e quelado no citoplasma pela metalotioneína Crs5. Alternativamente, o íon metálico Sn²+ pode gerar EROs, em especial o ânion superóxido (O2 -), o qual pode ser dismutado pela proteína Sod1, formando peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxil (.OH). Consequentemente, as EROs podem induzir a transcrição de vários genes envolvidos na resposta ao estresse oxidativo, como SOD1, YAP1 e APN1. Para elucidar os mecanismos moleculares envolvidos na genotoxicidade do íon metálico Sn²+, foi avaliada a indução de quebras causadas pelo SnCl2 na presença de formamidopirimidina (FPG) e endonuclease III (ENDO III), bem como a interferência desse íon na reparação das lesões induzidas pelo agente alquilante metilmetanosulfonato (MMS) em células de pulmão de hamster chinês (V79) pelo ensaio cometa. Os resultados mostraram que, em concentrações tóxicas, o íon metálico Sn²+ induziu somente uma limitada elevação nos sítios sensíveis de FPG e ENDO III, sugerindo que o íon metálico Sn²+ preferencialmente não induz lesões oxidativas nas bases nitrogenadas. Embora a concentração de 50 μM de SnCl2 não tenha produzido um aumento significativo na quantidade de danos ao DNA, ela foi capaz de inibir a reparação dos danos provocados pelo agente alquilante metilmetanosulfonato (MMS) durante o período de pós-tratamento de 24h. Os resultados demonstraram o efeito genotóxico e comutagênico do SnCl2 em células V79. O efeito inibitório do íon metálico Sn²+ na reparação dos danos induzidos pelo MMS no DNA sugeriu que esse metal também pode interferir em sistemas de reparação do DNA, que contribuem para o aumento de mutações pela alteração do equilíbrio entre o processo de reparação livre de erro e o sujeito a erro. / Resistance to stannous chloride (SnCl2) of the yeast Saccharomyces cerevisiae is a product of several metabolic pathways of this unicellular eukaryote. The recombination deficient rad52 mutant, unable to repair DNA single and double strand breaks was the most sensitive. The relative resistance of mutant strains rad2 e rad, deficient in nucleotide excision repair (NER), was rather high, indicating a minor but significant contribution to repair of Sn²+ -induced DNA lesions by this repair pathway. A series of mutants defective in different base excision repair (BER) pathway, combined with NER were used to indirectly determine the type of SnCl2-produced DNA lesion. The Ntg2p DNA N-glycosylase seems to be indispensable for repair of Sn²+ -induced DNA lesions. Lack of transcription factor Yap1p, responsible for the oxidative stress response in yeast, led to increase in Sn²+ -sensitivity. In addition, sensitivity of the superoxide dismutase mutants sod1 and sod2 revealed the importance of these anti-oxidative defence enzymes against Sn²+ -imposed DNA damage. The highest SnCl2 -sensitivity, however, was observed in glucose-repressed pre-diauxic shift exponentially growing cells (LOG cells). It has been suggested that two independently acting anti-ROS protective systems (one mediated by glucose repression/de-repression, the other via ROS-inducible transcription activators) are working together, and that both contribute to Sn²+ -resistance. To determine the concentration of Sn²+ ions cells of the S. cerevisiae and to correlate their quantity with the toxicity, the intracellular metal content of yeast cells was determined by Particle Induced X-ray emission (PIXE). A thick target protocol was developed for PIXE analysis. The PIXE analysis suggested that diploid (XS2316) cells absorbed about 60% of the total amount of Sn²+ absorbed by the haploid (XV185-14c) yeast cells. This indicates that Sn²+ absorption is better in haploid yeast cells and agrees well with published toxicity results. Finally, we performed a screening in order to know the putative interactions between Sn²+ and other essential elements. According to PIXE analysis, the results for XV185-14c yeast cells indicate a significant loss of intracellular elements such as Mg, Zn, S, Fe and an increase of P levels after 1 h exposure to 25 mM SnCl2 in STAT phase. In order to verify how Sn²+ is uptaken, distributed and detoxified, we associated molecular techniques including survival assay and quantitative real time PCR (qRT-PCR) with PIXE. The survival assay showed that Fet4p and Zrt2p both low-affinity iron and zinc transporters, respectively, may internalize Sn²+. By its turn, qRT-PCR showed an increased in CCH1 and MID1 gene expression, which encode for the cytoplasmic transmembrane Ca²+ transporters Cch1p and Mid1p, suggesting that both proteins may also take up Sn²+. Our data also indicated that once inside the cell, Sn²+ may be taken up from the cytosol by a P-type ATPase to the vacuole (Pmc1p) or may be chelated by Crs5p metallothionein in the cytosol. Alternatively, Sn²+ may generate reactive oxygen species (ROS), especially O2 - which can be dismutate to form H2O2 and the highly reactive OH. In consequence, ROS can induce cellular injury and stress-generated activation of many genes, e.g., SOD1, YAP1, and APN1. In order to clarify the molecular mechanisms of Sn²+ genotoxicity, we evaluated the induction of strand breaks, FPG and ENDO III sensitive sites, and the interference with the repair of MMS-caused DNA damage in V79 Chinese hamster lung fibroblasts exposed to stannous chloride by comet assay. Our results demonstrated that Sn²+ induced only a limited elevation in FPG and ENDO III sensitive sites in toxic concentrations. This suggests that stannous ion does not preferentially induce base modifications that are the substrate of FPG and ENDO III enzymes in V79 cells. Although 50 µM SnCl2 concentration did not increase significantly the DNA migration by itself in comet assay, it was capable to inhibit the repair of MMSinduced DNA damage during the pos-treatment period of 24h. Our results demonstrate the genotoxic and comutagenic effects of stannous chloride in V79 cells. The inhibitory effect of Sn²+ on repair of MMS-induced DNA damage suggests that this metal can also interfere in DNA repair systems thus contributing to increased mutation by shifting the balance from error-free to error-prone repair processes.

Leveduras do gênero Dekkera/Brettanomyces causam sérios problemas ao vinho, afetando as propriedades sensoriais do produto final. O objetivo deste trabalho foi investigar a capacidade de duas linhagens de Saccharomyces cerevisiae em inibir a atividade de Brettanomyces custersianus na vinificação em tinto e durante a fase inicial de envelhecimento, assim como investigar a capacidade deste microrganismo (Br. custersianus) em inibir a atividade metabólica de Sacch. cerevisiae. Foram realizadas vinificações com 4 inoculações diferentes. O tratamento 1 (T1) foi inoculado com a linhagem neutra Sacch. cerevisiae EMBRAPA 1vvt/97, T2-Sacch. cerevisiae EMBRAPA 91B/84 killer, T3-EMBRAPA 1vvt/97 e Br. custersianus, T4-EMBRAPA 91B/84 killer e Br. custersianus e T5-Br. custersianus. Também foram realizados, testes de velocidade fermentação, inibição ou estímulo do metabolismo e tolerância ao SO2. Durante a fase tumultuosa realizaram-se análises de açúcares redutores totais e etanol. Observou-se que durante todo o período da fermentação, o consumo de substrato de T1 e T2 foi mais rápido, do que em T3 e T4. A velocidade de fermentação da Br. custersianus (T5) foi muito inferior às demais linhagens. Mesmo com uma velocidade de crescimento baixa, a linhagem contaminante quando inoculada juntamente com Sacch. cerevisiae retarda a fermentação tumultuosa, podendo comprometer o processo de vinificação. Br. custersianus (T5) não teve sua atividade metabólica afetada na presença de 125 mg/L de SO2, logo conclui-se que as concentrações normalmente utilizadas no processo de vinificação, 30 a 70 mg/L, não seriam suficientes para impedir sua atividade. / Dekkera/Brettanomyces yeasts cause serious problems to the wine, affecting the sensorial properties of the final product. The objective of this work was to investigate the capacity of two strains of Saccharomyces cerevisiae in inhibiting the activity of Brettanomyces custersianus in the vinification in red wine and during the early stage of aging of the wine, as well as to investigate the ability of this microorganism (Br. custersianus) to inhibit metabolic activity of Saccharomyces cerevisiae. Vinifications were performed with 4 different inoculations. Treatment 1 (T1) was inoculated with the neutral strain Sacch. cerevisiae EMBRAPA 1vvt/97, T2-killer Sacch. cerevisiae EMBRAPA 91B/84, T3-EMBRAPA 1vvt/97 and Br. custersianus, T4-EMBRAPA 91B/84 and Br. custersianus and T5-Br. custersianus. There were also carried out tests of speed fermentation, inhibition or stimulation of metabolism and tolerance to SO2. During the tumultuous phase analysis was performed of total reducing sugars and ethanol. It was observed that throughout the period of fermentation, the substrate consumption in T1 and T2 was faster than in T3 and T4. The speed of fermentation of Br custersianus (T5) was much lower than the other strains. Even with a low rate of growth, the strain contaminant when inoculated with Saccharomyces cerevisiae. delays the tumultuous fermentation, being able to compromise the vinification process. Br. custersianus (T5) did not have its metabolic activity affected in the presence of 125 mg/L of SO2, then it was concluded that the concentrations normally used in the vinification process, 30 to 70 mg/L, would not be enough to prevent their activity.

Nos últimos anos, é crescente a busca por tecnologias que permitam que a produção de álcool gerado a partir de fontes renováveis substitua os principais combustíveis utilizados atualmente, que são provenientes do petróleo. A utilização dos resíduos gerados a partir dos processos agrícolas, que são ricos em açúcares, é uma alternativa para a produção de bioetanol pela levedura Saccharomyces cerevisiae. Os processos utilizados com esse fim, como a hidrólise ácida diluída, geram uma diversidade de açúcares (pentoses e hexoses), como glicose, manose, xilose e arabinose. Além dos açúcares, ocorre a geração de compostos tóxicos às células, como furfural, 5-hidroximetilfurfural (HMF), compostos fenólicos e ácidos orgânicos, e também alta pressão osmótica. Além disso, S. cerevisiae não é capaz de utilizar pentoses como fonte de carbono para fermentação, e a viabilidade econômica desse processo depende da conversão quase total de todos os açúcares a etanol. Com isso é necessário o uso de linhagens fermentadoras de pentoses e hexoses que sejam resistentes às toxinas geradas, para que o hidrolisado seja utilizado sem um processo prévio de destoxificação. Nesse trabalho, foi obtida por engenharia evolutiva uma linhagem de de S. cerevisiae resistente ao HMF, nomeada P6H9. Foi avaliada a indução da expressão gênica na presença de HMF e observou-se que os genes ADH7 E ARI1 são responsáveis pela resistência a esse composto. Também foi possível observar que as mudanças no metabolismo dessa levedura para destoxificação do meio não possibilitam o aumento na produção de etanol. Também foi obtida uma linhagem da levedura fermentadora de pentoses Wickerhamomyces anomalus resistente a furfural e HMF, nomeada WA-HF5,5. Foi possível definir a grande importância das enzimas álcool desidrogenases na destoxificação desses compostos. Finalmente, essas duas leveduras foram avaliadas quanto à capacidade de produção de etanol em hidrolisados lignocelulósicos de casca de soja e casca de arroz, isoladamente, ou em sistemas de co-cultivos em frascos agitados. As melhores produtividades em etanol foram apresentadas em hidrolisado de casca de arroz, e os cultivos foram escalonados para sistemas de biorreatores. Foi observado que o sistema de co-cultivo possui vantagens e grande potencial para a produção de etanol de segunda geração. / In recent years, there is a crescent interest for technologies that enable the production of alcohol originated from renewable sources, in replacement of the fossil fuels. The use of waste generated from agricultural processes, which are rich in sugars, is an alternative for the production of bioethanol by the yeast Saccharomyces cerevisiae. The processes used for this purpose, such as dilute acid hydrolysis, releases a diversity of sugars (pentoses and hexoses), such as glucose, mannose, xylose and arabinose. In addition to sugars, toxic compounds to cells are also generated, such as furfural, 5-hydroxymethylfurfural (HMF), phenolic compounds, organic acids, and also high osmotic pressure. The economic feasibility of the process depends of the complete conversion of major sugars present ih the medium to ethanol. As S. cerevisiae is not able to metabolize pentoses, it is necessary to use strains that ferment pentoses and hexoses to ethanol, which are resistant to the toxins formed, in order to the hydrolyzate be fermented without previous detoxification processes.In this work, a strain of S. cerevisiae resistant to HMF, named P6H9, was obtained by evolutionary engineering. It was observed that the ARI1 and ADH7 genes are responsible for HMF resistance. It was also observed that the detoxification process causes changes in the metabolism of this yeast. Because of that, it is not possible increase the ethanol production. A strain of the fermenting pentoses yeast Wickerhamomyces anomalus was also obtained by evolutionary engineering, that is resistant to furfural and HMF. This strain is named WA-HF5, 5. On physiological evaluations, it was clear that alcohol dehydrogenase activity possesses importance in furaldehydes detoxification. Finally, the ability of these two strains produce ethanol in lignocellulosic hydrolysates was investigated. Best yields of ethanol were presented in rice hull hydrolysate. It was observed that the co-culture system shows advantages and have potential for the production of second generation ethanol.

Submitted by Haroudo Xavier Filho (haroudo.xavierfo@ufpe.br) on 2016-02-26T12:26:42Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE - Adiles Paulo de Lima.pdf: 1609682 bytes, checksum: 889f967461ad04b505907e00ea91cfab (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-26T12:26:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE - Adiles Paulo de Lima.pdf: 1609682 bytes, checksum: 889f967461ad04b505907e00ea91cfab (MD5) Previous issue date: 2015-03-12 / REUNI / CAPES / PT-31 [3-(2-cloro-6-fluorobenzil)-imidazolidina-2,4-diona] é um composto descrito com atividade analgésica e o elixir SANATIVO® (SAN e extrato de SAN, E. SAN) é um fitoterápico comum no Nordeste do Brasil. Esses produtos terapêuticos necessitam de testes adicionais antes de ter aplicabilidade humana, inclusive ensaios genéticos. Assim, dois testes de danos genéticos foram escolhidos para o presente trabalho: o Teste de Mutação e Recombinação Somática (SMART) em Drosophila melanogaster que detecta tipos diferentes de mutações e recombinação, e mutantes de recombinação e reversão de Saccharomyces cerevisiae, ambos apresentam baixo custo, confiabilidade e rapidez, visando a análise genética para o uso mais seguro dos compostos. O fármaco PT-31 foi avaliado através da técnica SMART e pelo teste com os mutantes de S. cerevisiae; com o elixir SANATIVO® foi formada uma curva de sobrevivência larval utilizando os dois tipos de cruzamentos (ST e HB) do SMART, em seguida este ensaio foi empregado; e o extrato de SAN foi analisado pelo SMART e através das linhagens de S. cerevisiae. Notou-se a possibilidade de SAN ter reduzido a toxicidade do álcool por meio da sobrevivência larval. Enquanto que o SMART de SAN e de E. SAN revelou efeito mutagênico na maioria das concentrações testadas, com ativação metabólica e efeito recombinogênico ausentes, sem alteração identificável nos testes em S. cerevisiae. O PT-31 mostrou efeito mutagênico e atividade recombinogênica no teste SMART, aumentando o efeito mutagênico pela atividade metabólica do sistema P450, e nenhuma alteração fenotípica no teste em S. cerevisiae. Esses dados contribuem para a ampliação das informações sobre os compostos terapêuticos na literatura, para que futuros experimentos possam elucidar melhor a ação em organismos vivos. / PT-31 [3-(2-chloro-6-fluorobenzyl)-imidazolidine-2,4-dione] is a compound described with analgesic activity and SANATIVO® elixir (SAN e SAN extract, E. SAN) is a common phytotherapic in the Northeast of Brazil. Those therapeutic products require additional tests before human applicability, including genetic assays. The Mutation and recombination Somatic Test (SMART) in Drosophila melanogaster provides different sorts of mutations and recombination, and recombination and reversion mutants of Saccharomyces cerevisiae, both present low cost, reliability and speed, in order the genetic analysis for a safer use of the compounds. The PT-31 drug was evaluated by SMART technique and by the test with S. cerevisiae mutants; with the SANATIVO® elixir was constructed a larval survival curve using two types of crosses (ST and HB) of SMART, then this assay was used; and the SAN extract was assessed by SMART and by S. cerevisiae strains. It was noticed the possibility of SAN have reduced toxicity of the alcohol by larval survival. While the SMART of SAN and of E. SAN revealed mutagenic effect in most of the tested concentrations, with metabolic activation and absent recombinogenic effect, without identifiable modification in the tests in S. cerevisiae. The PT-31 showed mutagenic effect and recombinagenic activity in the SMART test, increasing of mutagenic effect by the metabolic activity of P450 system, and none phenotypic change in the test in S. cerevisiae. These data contribute to the expansion of information on the therapeutic compounds in the literature, so that future experiments will be able to elucidate the action in living organisms.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5261_1.pdf: 810129 bytes, checksum: 7584c9ad246322945fe570499d25c423 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / O objetivo deste estudo foi investigar a influência de campos magnéticos estáticos, não homogêneos, na fisiologia da levedura S. cerevisiae crescendo em meio sintético a base de glicose. As fermentações foram conduzidas segundo duas condições: em biorreatores submetidos a campo magnético (com magnetos cilíndricos, constituídos da liga metálica NdFeB (Neodímio-Ferro-Boro) com ½ pol de diâmetro e ¼ pol de espessura (modelo 27DNE3208 Magnet Sales & Manufacturing Company, Inc. USA)) e em biorreatores sem magnetos. Foi aplicado campo magnético estático, não homogêneo de intensidade 220 mT. A levedura foi cedida da coleção do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco, classificada como UFPEDA 1012, em meio contendo extrato de levedura e glicose e durante 24 horas de fermentação. Foram monitoradas a pureza microbiológica do cultivo e realizadas amostragens para avaliação do crescimento por medida do peso seco e por contagem de células viáveis (UFC/mL). A velocidade específica de crescimento (μx) foi avaliada e realizadas análises de imagem, aferições dos valores de pH, determinação da concentração de etanol através de cromatografia a gás e dosagem de glicose por método enzimático. As amostras submetidas ao campo magnético obtiveram aumento na produção de biomassa a partir das 12 horas de fermentação, quando comparadas às amostras controle. Este aumento foi de até 181% em relação à amostra não magnetizada, evidenciando que o campo magnético estimula a produção de biomassa em leveduras, bem como o aumento no número de células viáveis com aumento de até quatro vezes o valor em relação à amostra controle. A análise da velocidade específica de crescimento confirmou os achados anteriores de que a curva de crescimento das amostras controle encontraram-se em fase estacionária, ao passo que a amostra magnetizada apresenta prolongamento da fase exponencial de crescimento. Esse fato pode ser interpretado como um efeito do campo magnético na aceleração do metabolismo celular e ser um instrumento de uso biotecnológico na otimização da produção de biomassa. A forma de magnetização teve influência marcante nos resultados das variáveis estudadas, mostrando que o campo magnético aplicado em S. cerevisiae, estimulou a proliferação e a biomassa, com grande potencial de aplicação na biotecnologia