Les plasmides confèrent aux bactéries qui les possèdent diverses fonctions pouvant accroître leurs chances de survie dans des environnements défavorables. C’est le cas d’Aeromonas salmonicida ssp. salmonicida, bactérie à l’origine de la furonculose chez les salmonidés. Elle possède trois petits plasmides (pAsa1, pAsa2 et pAsa3) qui sont cryptiques c’est-à-dire sans fonction connue. Pour compléter son plasmidome standard, s’ajoutent aux précédents, deux autres plasmides fréquemment retrouvés, pAsal1 et pAsa5, porteurs de gènes codant pour le système de sécrétion de type III, important facteur de virulence pour ce microorganisme. Enfin, ce ne sont pas moins de 17 plasmides porteurs de gènes de résistance aux antibiotiques et quatre supportant des facteurs de virulence qui ont été mis en évidence au cours des 30 dernières années pour cette bactérie. La propagation des gènes de résistance aux antibiotiques pose un problème dans le contexte vétérinaire puisqu’elle constitue, pour le moment, un obstacle au traitement efficace et durable contre la bactérie et conséquemment contre la furonculose. L’étude des petits plasmides d’A. salmonicida ssp. salmonicida s’inscrit dans cette démarche d’une meilleure connaissance de leur plasticité et de leur diversité. Ce projet a donc permis de mettre en évidence la présence de trois nouveaux petits plasmides : pAsa10, pAsaXI et pAsaXII. pAsa10 est la preuve supplémentaire que la propagation des gènes de résistance aux antibiotiques se poursuit, notamment par l’entremise du transposon Tn1721. L’analyse des séquences de pAsaXI et pAsaXII a permis de mettre en évidence des plasmides porteurs de nouvelles fonctionnalités pour A. salmonicida ssp. salmonicida, et des dérivés respectifs des plasmides cryptiques pAsa3 et pAsa2, très présents dans la bactérie, mais sans utilité apparente. Enfin, la haute capacité de transfert de ce microorganisme est encore démontrée, car ces plasmides sont identiques à d’autres retrouvés dans Shewanella baltica et Aeromonas bivalvium, respectivement. / Plasmids confer to the bacteria that possess them various functions that increase their chances of survival in adverse environments. This is the case with Aeromonas salmonicida ssp. salmonicida, a bacterium which causes furunculosis in salmonids. It has three small plasmids (pAsa1, pAsa2 and pAsa3) that are cryptic that is to say without a known function. To supplement its standard plasmidome, two other frequently found plasmids, pAsal1 and pAsa5, which are carriers of genes coding for the type III secretion system, an important virulence factor of this microorganism. Finally, there are no less than 17 plasmids with genes coding for antibiotic resistance and 4 bearing virulence factors that have been demonstrated over the last 30 years for this bacterium. The spread of antibiotic resistance poses a problem in the veterinary context, since it is currently an obstacle to effective and sustainable treatment against the bacterium and consequently to furunculosis. The study of the small plasmids of A. salmonicida ssp. salmonicida is part of this process of a better knowledge of their plasticity and diversity. This project highlighted the presence of three new small plasmids: pAsa10, pAsaXI and pAsaXII. pAsa10 is a new evidence that propagation of antibiotic resistance genes continues, notably through the transposon Tn1721. The analysis of pAsaXI and pAsaXII sequences allowed to identify plasmids carrying new functionalities for A. salmonicida ssp. salmonicida, and derivatives of cryptic plasmids pAsa3 and pAsa2, respectively, very present in the bacterium but without apparent utility. Finally, the high transfer capacity of this microorganism is further demonstrated because these plasmids are identical to others found in Shewanella baltica and Aeromonas bivalvium, respectively.

Aeromonas salmonicida, une bactérie pathogène du poisson, possède le système de sécrétion type trois (TTSS) essentiel à sa virulence. Il a été montré qu'une culture à 25°C de ces bactéries cause la perte du plasmide pAsa5 portant le TTSS engendrant ainsi une perte de virulence. Ce projet avait pour but de tester systématiquement l'effet de la chaleur sur certains facteurs de virulence. La thermolabilité du pAsa5 a été vérifiée par PCR pour des souches cultivées à 25°C. Leur virulence a été comparée à leur souche parentale avec l'amibe Dictyostelium discoideum. Les résultats ont montré que la perte de virulence est associée au réarrangement de pAsa5 qui s'est montré variable entre les souches et pour une même souche après différents traitements thermiques. Ce projet propose une nouvelle vision sur la thermolabilité du pAsa5. L'identification de l'origine du réarrangement permettra de contrer la virulence d'A. salmonicida lors de futurs projets.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La bactérie Aeromonas salmonicida utilise le système de sécrétion de type trois (SSTT) pour injecter des effecteurs à l'intérieur des cellules de l'hôte lors de l'infection. L'étude du génome d'A. salmonicida a révélé l'existence d'Ati2, un nouvel effecteur du SSTT. Ce projet avait pour but d'étudier la relation structure-fonction d'Ati2 afin de déterminer son rôle dans la virulence d'A. salmonicida. Des analyses biochimiques et en modélisation moléculaire ont permis de démontrer qu'Ati2 est une inositol polyphosphate 5-phosphatase qui hydrolyse les PtdIns(4,5)P₂ et les PtdIns(3,4,5)P₃. Divers mutants d'Ati2 ont été produits et clones dans des vecteurs d'expression chez l'amibe Dictyostelium discoideum. Les tests d'expression ont démontré qu'Ati2 est toxique pour l'amibe et que cela est lié à son activité catalytique. Ce projet de recherche a ainsi permis de démontrer l'existence d'un nouvel effecteur du SSTT et d'en spécifier la fonction dans la pathogénicité d'A. salmonicida.

*Aeromonas salmonicida* sous-espèce *salmonicida*, agent étiologique de la furonculose, impacte négativement les piscicultures chaque année au Québec. Dans les dernières années, une hausse de résistance aux antibiotiques chez cette bactérie a été remarquée. De la résistance contre la tétracycline chez les poissons est fréquemment observée, bien que cet antibiotique ne soit que peu utilisé par l'industrie aquacole. C'est toutefois le cas de l'industrie porcine, où la tétracycline est abondamment utilisée. En s'intéressant à l'environnement autour des piscicultures, ce présent projet établit l'hypothèse qu'il est envisageable d'observer des liens reliant la furonculose, les gènes de résistance aux antibiotiques chez *A. salmonicida* sous-espèce *salmonicida* et la contribution potentielle de l'environnement. À l'aide de méthodes de séquençage génomique et de bio-informatique, de nouveaux plasmides ont été caractérisés. Les plasmides, pAsa-2358, pAsa-2900 et pAsa-2900b, font maintenant partie du répertoire de plasmides de résistance retrouvés au Québec chez la sous-espèce *salmonicida*. Des échantillons provenant de piscicultures et de leur environnement limitrophe ont été récoltés et testés par biologie moléculaire dans le but de détecter les plasmides connus au Québec pour cette bactérie incluant les trois nouveaux plasmides. Un portrait global des plasmides retrouvés a été dressé, confirmant la présence potentielle de la bactérie sans éclosion active de furonculose. Effectivement, plusieurs plasmides problématiques de la sous-espèce, soit pSN254b et ceux de la famille des pRAS3 ont été détectés. Plus particulièrement, pSN254b confère une résistance à plusieurs antibiotiques, donnant une résistance à tous les antibiotiques autorisés au Canada pour traiter la furonculose. Sachant qu'ils sont détectés autant dans les sédiments que dans l'eau, il est possible d'envisager qu'à ces moments, une grande concentration de cet ADN était disponible dans l'environnement. Cette étude permet un premier pas vers l'analyse environnementale des milieux piscicoles au Québec. / *Aeromonas salmonicida* subspecies *salmonicida*, etiological agent of furunculosis, negatively impacts the fish farming industry every year in the province of Quebec. In the last years, a dramatic increase in the presence of antibiotic resistance genes within the bacterial strains of interest was observed. Tetracycline resistance in fish farms in Quebec is frequently observed, even though this antibiotic is rarely used against furunculosis in the industry. Moreover, it is quite overused in the swine industry. Looking more closely at the surrounding environments of fish farms, the present study establishes the hypothesis that it is possible to potentially establish links in between furunculosis, resistance genes in *A. salmonicida* subspecies *salmonicida* and the potential contribution of the environment. Working with genomic sequencing and bioinformatics, new plasmids were characterized. Plasmids pAsa-2358, pAsa-2900 and pAsa-2900b are now part of the list of known resistance-bearing plasmids in the province of Quebec for the subspecies *salmonicida*. Environmental samples were also collected and tested by molecular biology in the goal of detecting known plasmids found in Quebec in this bacterium, including the three new plasmids mentioned. A global portrait of plasmids found in them is discussed, confirming the potential presence of *Aeromonas salmonicida* subspecies *salmonicida* in the fishponds without active outbreaks of furunculosis. Problematic plasmids from the subspecies, pSN254b and those from the pRAS3 family were detected. More specifically, pSN254b confers resistance to multiple antibiotics, providing resistance to all antibiotics authorized for treatment in Canada. Knowing that these plasmids were detected both in sediment and water samples, it is possible to think that this DNA was available at a high concentration in the environment at this time. This study allows the debuts of the analysis of the environment of fish farms in Quebec.

Aeromonas salmonicida sous-espèce salmonicida, une bactérie pathogène infectant les poissons, cause une maladie nommée la furonculose qui est traitée par antibiotique. À cause des résistances aux antibiotiques, ceux-ci ne sont plus aussi efficaces. Comme les tests d'antibiogrammes nécessitent sept jours, une PCR multiplex ciblant les gènes de résistance aux antibiotiques homologués (sulfonamides et triméthoprime, tétracyclines, chloramphénicols) permettrait de détecter rapidement ces résistances. Suite à la caractérisation de séquences génomiques et l'optimisation de PCR multiplex, plusieurs souches d’A. salmonicida sous-espèce salmonicida ont été testées et leurs résultats ont été comparés avec ceux obtenus par les tests d'antibiogrammes. Il en ressort que la trousse développée est très performante voire plus que les tests d'antibiogrammes pour détecter les résistances aux sulfonamides, tétracyclines et chloramphénicols tout en étant plus rapide. Une connaissance plus approfondie sur les résistances aux sulfonamides et triméthoprime demeure d’actualité puis l'amélioration de la trousse diagnostique est à envisager. / Aeromonas salmonicida subspecies salmonicida, a pathogenic bacterium that infects fish, causes a disease named furunculosis, which is treated with antibiotics. The latters are not as effective because of antibiotic resistances. As the susceptibility tests require seven days, a multiplex PCR targeting the genes coding resistances against homologated antibiotics (sulfonamides and trimethoprim, tetracyclines, chloramphenicols) would detect resistance rapidly. Following the characterization of genomic sequences and optimization of multiplex PCR, several strains of A. salmonicida subspecies salmonicida were tested and the results were compared with those obtained by the susceptibility tests. It shows that the kit is highly efficient even more rapidly than the susceptibility tests to detect resistance to sulfonamides, tetracyclines and chloramphenicols while being faster. A deeper knowledge about sulfonamides and trimethoprim resistance and the improvement of the diagnostic kit should be considered.

Les éléments mobiles de l’ADN, des séquences capables de transfert intracellulaire ou extracellulaire, existent dans la plupart des génomes (eucaryotes ou procaryotes). Ce sont des vecteurs importants de variation génétique. Certains portent des gènes accessoires qui procurent un avantage sélectif à leur organisme-hôte. Les séquences d’insertion (IS) sont un cas spécial d’éléments mobiles bactériens. Elles sont exemptes de gènes accessoires, mais autonomes pour leur transposition. Elles peuvent donc causer des variations structurales, ce qui peut perturber les fonctions de la bactérie-hôte. Néanmoins, la plupart des génomes bactériens portent plusieurs copies de différentes familles d’IS. Plusieurs hypothèses, allant du parasitisme des IS à une forme de commensalisme IS-bactérie, ont été formulées pour expliquer la persistance de ces éléments mobiles dans les génomes. Aeromonas salmonicida ssp. salmonicida, l’agent étiologique de la furonculose chez les salmonidés, est un modèle intéressant pour étudier les IS. Son génome possède plusieurs familles d’IS présentes en différents nombres de copies. De plus, des travaux réalisés précédemment ont montré que ces éléments mobiles étaient responsables de variations structurales dans les plasmides de la bactérie et de l’inactivation de certains de ses facteurs de virulence. Bien que les évènements mentionnés ci-dessus semblent neutres ou désavantageux, il n’est pas exclu que certains évènements impliquant les IS puissent apporter un avantage adaptatif à la bactérie. L’objectif de cette thèse était donc d’explorer les éléments mobiles du génome d’A. salmonicida ssp. salmonicida, en portant une attention particulière aux IS, afin d’identifier des évènements à répercussion bénéfique pour la bactérie. La richesse d’information et l’accessibilité grandissante du séquençage à haut débit en ont fait une technique de choix pour étudier les IS et autres transposons en association avec un autre élément mobile essentiel à leur transmission intercellulaire, les plasmides. Une première étude a permis de découvrir des variants d’un grand plasmide d’A. salmonicida ssp. salmonicida, pAsa4, dont la forme de référence porte des gènes de résistance aux antibiotiques, des IS et un transposon. Les variants identifiés lors de l’étude, pAsa4b et pAsa4c, présentent des variations structurales par rapport à la référence. Elles ont des conséquences sur les gènes de résistance portés et sur la capacité de transfert des plasmides. La génomique comparative faite entre les pAsa4 suggère que les éléments mobiles tiennent un rôle primordial dans la création de certaines variations structurales, tant par leur capacité de transposition ou d’intégration que par leur propension à la recombinaison homologue. L’élargissement de la famille des pAsa4 à trois variants procure d’autres exemples de variabilité attribuable aux éléments mobiles de l’ADN. Dans une second temps, nous avons approfondi un évènement étudié précédemment : la perte du locus du système de sécrétion de type trois (SSTT). Cette région, située sur le grand plasmide pAsa5, peut être perdue lorsque A. salmonicida ssp. salmonicida est cultivée à 25°C. Dans certains cas, la recombinaison homologue d’IS flanquant les régions touchées avait été mise en cause. Dans le cadre de ce projet, le génome de la souche 01-B526, qui avait été utilisée pour générer des pAsa5 réarrangés, a été séquencé par une combinaison de technologies à courtes et à longues lectures. Un nouveau plasmide, pAsa9, ainsi qu’une nouvelle IS de pAsa5, ISAS5Z, ont été découverts. Ensemble, ces deux éléments ont permis de proposer un nouveau schéma de recombinaison homologue qui s’est avéré exact pour tous les réarrangements de pAsa5 générés lors de l’expérience précédente et considérés comme irréguliers. Ces nouveaux résultats permettent de regrouper tous les scénarios de réarrangement de pAsa5 sous un seul mécanisme, la recombinaison homologue entre IS, en plus d’ajouter une nouvelle entité au plasmidome d’A. salmonicida ssp. salmonicida. Plusieurs évènements ont donc été ajoutés au catalogue des variations structurales causées par les éléments mobiles de l’ADN d’A. salmonicida ssp. salmonicida. Dans les derniers chapitres de cette thèse, les conséquences de ces différents évènements sont discutées. Certaines variations sur pAsa4 apportent des gènes accessoires qui sont bénéfiques dans un environnement donné. Autrement, l’étude des éléments observés est limitée par le manque de connaissance sur les facteurs environnementaux qui causent ces variations et sur leur impact in vivo, chez le poisson. Quoi qu’il en soit, les IS du génome d’A. salmonicida ssp. salmonicida influencent certainement les relations hôte-pathogène de cette bactérie et participent intimement à son histoire évolutive. / Mobile genetic elements are sequences capable of intracellular and extracellular transfer. They exist in the majority of eukaryotic and prokaryotic genomes, and are important vectors of genetic variability. Some mobile genetic elements carry accessory genes that confer selective advantages to their host. Insertion sequences (IS), do not belong to the latter group, as they are exempt of accessory genes, yet they are autonomous in their transposition. ISs are thus important structural variation producers, which may endanger the host’s functions and its genomic integrity. However, most bacterial genomes carry ISs. Hypotheses ranging from parasitism to commensalism were formulated to explain how ISs persist in genomes. A. salmonicida subsp. salmonicida, the causative agent of furunculosis in salmonids, is a good model to study ISs. Its genome carries many ISs divided in different families. Moreover, previous work showed that these elements cause structural variations in plasmids and virulence factor inactivations. Even though the events observed to date seemed neutral or detrimental for the bacteria, we cannot exclude that ISs may procure an adaptative advantage in certain cases. This thesis’ objective was to explore the A. salmonicida subsp. salmonicida mobile genetic elements, especially ISs, to identify events with a positive outcome for the bacteria. ISs and transposons were studied in association with another mobile element accountable for their intercellular transfer, plasmids. High-throughput sequencing was used as a preferred method because of its growing availability and the richness of information it generates. In a first article, variants of a large plasmid that carries antibiotic resistance genes, pAsa4, were discovered. pAsa4b and pAsa4c display structural variations when compared to the reference plasmid that impact their antibiotic resistance genes and their conjugation capabilities. Comparative genomics between the three variants shows that mobile elements, either by transposition or recombination, have an important role in some variations. Adding two new members to the pAsa4 family of plasmids gave further examples of genetic diversity driven by mobile elements. In a second article, we investigated previous results concerning the type three secretion system (TTSS) loss. This is an essential virulence factor for A. salmonicida subsp. salmonicida, and its genes are mainly encoded in a single locus of the large plasmid pAsa5. The region can be lost when the bacterium is cultivated at 25°C or higher. In some cases, homologous recombinations between IS copies flanking the TTSS locus have been identified as causing the deletion. In this study, the genome of the strain 01-B526, which was used in a previous study to produce TTSS-negative mutants, was sequenced using Illumina and PacBio technologies. A new plasmid, named pAsa9, and a new pAsa5 IS, ISAS5Z, were discovered. Together, those elements permitted to build a new IS-driven homologous recombination model that was tested in the mutant strains. All TTSS-negative strains generated in previous study and that were not explained by other IS recombination patterns fitted with the new ISAS5 homologous recombination model. These results allowed to regroup all pAsa5 rearrangements under a consistent mechanism: recombination using IS copies as a template. In this thesis, more structural variation events involving ISs were uncovered. In the last chapters, their involvement in A. salmonicida subp. salmonicida fitness in vitro and in the fish host is discussed. Some variations in pAsa4 bring new resistance genes, which are beneficial for the bacteria in an aquaculture context. However, for most events, we lack situational information to properly conclude their fitness impact. Regardless, ISs of the A. salmonicida subp. salmonicida genome certainly influence host-pathogen relations and participate in the bacteria evolutive history.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

The diplomonads are a diverse group of eukaryotic flagellates found in microaerophilic and anaerobic environments. The most studied diplomonad is the intestinal parasite Giardia intestinalis, which infects a variety of mammals and cause diarrheal disease. Less is known about Spironucleus salmonicida, a parasite of salmonid fish, known to cause systemic infections with high mortality. We created a transfection system for S. salmonicida to study cellular functions and virulence in detail (Paper I). The system was applied to explore the mitochondrion-related organelle (MRO) in S. salmonicida. We showed that S. salmonicida possesses a hydrogenosome (Paper II) with a higher metabolic capacity than the corresponding MRO of Giardia, the mitosome. Evolutionary analysis of key hydrogenosomal proteins showed ancient origin, indicating their presence in the ancestral diplomonad and subsequent loss in Giardia. Annexins are of evolutionary interest since these proteins are found across all kingdoms. Annexin-like proteins are intriguingly expanded into multigene families in Giardia and Spironucleus. The annexins of S. salmonicida were characterized (Paper III) with distinct localizations to various cellular structures, including a putative adhesion structure anterior in the cell. The disease-causing Giardia trophozoites differentiate into infectious cysts, a process essential for transmission and virulence of the parasite. Cysts are often spread via contaminated water and exposed to environmental stressors, such as UV irradiation. We studied the survival and transcriptional response to this stress factor (Paper IV) and results showed the importance of active DNA replication machinery for parasite survival after DNA damage. In addition, we studied transcriptional changes along the trajectory of encystation (Paper V), which revealed a coordinated cascade of gene regulation. This was observed for the entire transcriptome as well as putative regulators. Large transcriptional changes appeared late in the process with the majority of differentially regulated genes encoding hypothetical proteins. We studied the localizations of several of these to gain information of their possible function. To conclude, the diplomonads are complex eukaryotic microbes with cellular processes adjusted to match their life styles. The work in this thesis has provided insight of their adaptations, differences and similarities, but also new interesting leads for future studies of diplomonad biology and virulence.

Thesis (Ph. D.)--Ohio State University, 2005. / Title from first page of PDF file. Document formatted into pages; contains xvi, 105 p.; also includes graphics (some col.) Includes bibliographical references (p. 95-105). Available online via OhioLINK's ETD Center