Lors du phénomène d’hémostase primaire ou de thrombose vasculaire, les plaquettes sanguines doivent adhérer aux parois afin de remplir leur fonction réparatrice ou pathologique. Pour ce faire, certains facteurs rhéologiques et hémodynamiques tels que l’hématocrite, le taux de cisaillement local et les contraintes de cisaillement pariétal, entrent en jeu afin d’exclure les plaquettes sanguines de l’écoulement principal et de les transporter vers le site endommagé ou enflammé. Cette exclusion pourrait aussi être influencée par l’agrégation de globules rouges qui est un phénomène naturel présent dans tout le système cardiovasculaire selon les conditions d’écoulement. La dérive de ces agrégats de globules rouges vers le centre des vaisseaux provoque la formation de réseaux d’agrégats dont la taille et la complexité varient en fonction de l’hématocrite et des conditions de cisaillement présentes. Il en résulte un écoulement bi-phasique avec un écoulement central composé d’agrégats de globules rouges avoisinés par une région moins dense en particules où l’on peut trouver des globules rouges singuliers, des petits rouleaux de globules rouges et une importante concentration en plaquettes et globules blancs. De ce fait, il est raisonnable de penser que plus la taille des agrégats qui occupent le centre du vaisseau augmente, plus il y aura de plaquettes expulsées vers les parois vasculaires. L'objectif du projet est de quantifier, in vitro, la migration des plaquettes sanguines en fonction du niveau d’agrégation érythrocytaire présent, en faisant varier l’hématocrite, le taux de cisaillement et en promouvant l’agrégation par l’ajout d’agents tels que le dextran à poids moléculaire élevé. Cependant, le comportement non Newtonien du sang dans un écoulement tubulaire peut être vu comme un facteur confondant à cause de son impact sur l’organisation spatiale des agrégats de globules rouges. De ce fait, les études ont été réalisées dans un appareil permettant de moduler, de façon homogène, la taille et la structure de ces agrégats et de quantifier ainsi leur effet sur la migration axiale des plaquettes. Du sang de porc anti coagulé a été ajusté à différents taux d’hématocrite et insérer dans un appareil à écoulement de Couette, à température ambiante. Les plaquettes sanguines, difficilement isolables in vitro sans en activer certains ligands membranaires, ont été remplacées par des fantômes en polystyrène ayant un revêtement de biotine. La quantification de la migration de ces fantômes de plaquettes a été réalisée grâce à l’utilisation de membranes biologiques fixées sur les parois internes de l’entrefer du rhéomètre de Couette. Ces membranes ont un revêtement de streptavidine assurant une très forte affinité d’adhésion avec les microparticules biotynilées. À 40% d’hématocrite, à un cisaillement de 2 s-1, 566 ± 53 microparticules ont été comptées pour un protocole préétabli avec du sang non agrégeant, comparativement à 1077 ± 229 pour du sang normal et 1568 ± 131 pour du sang hyper agrégeant. Les résultats obtenus suggèrent une nette participation de l’agrégation érythrocytaire sur le transport des fantômes de plaquettes puisque l’adhésion de ces derniers à la paroi du rhéomètre de Couette augmente de façon quasi exponentielle selon le niveau d’agrégation présent. / During the primary hemostatis or thrombosis phenomenon, the human blood platelets must adhere to the vascular wall in order for them to perform their repairing or pathological function. To do so, certain rheological and hemodynamic factors such as the hematocrit, local shear rate and the wall shear stress, must come into play to exclude blood platelets from the main blood stream and transport them to the vicinity of the damaged or inflamed site. This exclusion could also be influenced by red blood cell aggregation which is a natural process present throughout the entire cardiovascular system under certain flow conditions. The displacement of these rouleaux of red blood cells towards the centre of the vessel induces the formation of 3D networks of aggregates whose size and complexity vary as a function of the hematocrit and the shearing conditions present. It results in a two phase flow with an inner core composed of red blood cell aggregates surrounded by single red blood cells or small aggregates and large numbers of white blood cells and platelets. It is therefore reasonable to believe that the larger the inner core becomes, the more platelets will be expulsed towards the vascular wall. The objective of the study was to quantify, in vitro, the lateral migration of blood platelets as a function of the level of red blood cell aggregation present, by changing the hematocrit, the shear rate and by promoting red blood cell aggregation with the use of agents such as high molecular weight dextran. However, the non Newtonian behavior of blood in tube flow can be seen as a confounding factor to the understanding of the spatial organization of the red blood cell aggregates. In this study, whole blood was circulated in a simple shear flow apparatus, which allowed to homogeneously modulate the red blood cell aggregate sizes and structure, and quantify their effect on the axial migration of blood platelets. Anticoagulated porcine bloods were adjusted to different hematocrits and inserted into a Couette flow apparatus, at room temperature. Blood platelets, difficult to isolate in vitro without activating in a non reproducible manner specific membrane ligands, were replaced with biotin coated fluorescent polystyrene beads. The quantification of the migration of these platelet ghosts was conducted with the use of biological membranes fixed on the interior walls of the Couette apparatus. These streptavidin coated membranes ensure a strong adhesive affinity with the biotynilated beads. At 40% hematocrit and at a shear of 2 s-1, 566 ± 53 micro particles were counted for non aggregated erythrocytes, 1077 ± 229 for aggregating red blood cells and 1568 ± 131 for hyper aggregating blood. The results obtained suggest a strong participation of the red blood cell aggregation on the transport of platelet ghosts since the number of ghost cells fixed on the wall of the Couette rheometer increases almost exponentially with the level of aggregation present.

Lors du phénomène d’hémostase primaire ou de thrombose vasculaire, les plaquettes sanguines doivent adhérer aux parois afin de remplir leur fonction réparatrice ou pathologique. Pour ce faire, certains facteurs rhéologiques et hémodynamiques tels que l’hématocrite, le taux de cisaillement local et les contraintes de cisaillement pariétal, entrent en jeu afin d’exclure les plaquettes sanguines de l’écoulement principal et de les transporter vers le site endommagé ou enflammé. Cette exclusion pourrait aussi être influencée par l’agrégation de globules rouges qui est un phénomène naturel présent dans tout le système cardiovasculaire selon les conditions d’écoulement. La dérive de ces agrégats de globules rouges vers le centre des vaisseaux provoque la formation de réseaux d’agrégats dont la taille et la complexité varient en fonction de l’hématocrite et des conditions de cisaillement présentes. Il en résulte un écoulement bi-phasique avec un écoulement central composé d’agrégats de globules rouges avoisinés par une région moins dense en particules où l’on peut trouver des globules rouges singuliers, des petits rouleaux de globules rouges et une importante concentration en plaquettes et globules blancs. De ce fait, il est raisonnable de penser que plus la taille des agrégats qui occupent le centre du vaisseau augmente, plus il y aura de plaquettes expulsées vers les parois vasculaires. L'objectif du projet est de quantifier, in vitro, la migration des plaquettes sanguines en fonction du niveau d’agrégation érythrocytaire présent, en faisant varier l’hématocrite, le taux de cisaillement et en promouvant l’agrégation par l’ajout d’agents tels que le dextran à poids moléculaire élevé. Cependant, le comportement non Newtonien du sang dans un écoulement tubulaire peut être vu comme un facteur confondant à cause de son impact sur l’organisation spatiale des agrégats de globules rouges. De ce fait, les études ont été réalisées dans un appareil permettant de moduler, de façon homogène, la taille et la structure de ces agrégats et de quantifier ainsi leur effet sur la migration axiale des plaquettes. Du sang de porc anti coagulé a été ajusté à différents taux d’hématocrite et insérer dans un appareil à écoulement de Couette, à température ambiante. Les plaquettes sanguines, difficilement isolables in vitro sans en activer certains ligands membranaires, ont été remplacées par des fantômes en polystyrène ayant un revêtement de biotine. La quantification de la migration de ces fantômes de plaquettes a été réalisée grâce à l’utilisation de membranes biologiques fixées sur les parois internes de l’entrefer du rhéomètre de Couette. Ces membranes ont un revêtement de streptavidine assurant une très forte affinité d’adhésion avec les microparticules biotynilées. À 40% d’hématocrite, à un cisaillement de 2 s-1, 566 ± 53 microparticules ont été comptées pour un protocole préétabli avec du sang non agrégeant, comparativement à 1077 ± 229 pour du sang normal et 1568 ± 131 pour du sang hyper agrégeant. Les résultats obtenus suggèrent une nette participation de l’agrégation érythrocytaire sur le transport des fantômes de plaquettes puisque l’adhésion de ces derniers à la paroi du rhéomètre de Couette augmente de façon quasi exponentielle selon le niveau d’agrégation présent. / During the primary hemostatis or thrombosis phenomenon, the human blood platelets must adhere to the vascular wall in order for them to perform their repairing or pathological function. To do so, certain rheological and hemodynamic factors such as the hematocrit, local shear rate and the wall shear stress, must come into play to exclude blood platelets from the main blood stream and transport them to the vicinity of the damaged or inflamed site. This exclusion could also be influenced by red blood cell aggregation which is a natural process present throughout the entire cardiovascular system under certain flow conditions. The displacement of these rouleaux of red blood cells towards the centre of the vessel induces the formation of 3D networks of aggregates whose size and complexity vary as a function of the hematocrit and the shearing conditions present. It results in a two phase flow with an inner core composed of red blood cell aggregates surrounded by single red blood cells or small aggregates and large numbers of white blood cells and platelets. It is therefore reasonable to believe that the larger the inner core becomes, the more platelets will be expulsed towards the vascular wall. The objective of the study was to quantify, in vitro, the lateral migration of blood platelets as a function of the level of red blood cell aggregation present, by changing the hematocrit, the shear rate and by promoting red blood cell aggregation with the use of agents such as high molecular weight dextran. However, the non Newtonian behavior of blood in tube flow can be seen as a confounding factor to the understanding of the spatial organization of the red blood cell aggregates. In this study, whole blood was circulated in a simple shear flow apparatus, which allowed to homogeneously modulate the red blood cell aggregate sizes and structure, and quantify their effect on the axial migration of blood platelets. Anticoagulated porcine bloods were adjusted to different hematocrits and inserted into a Couette flow apparatus, at room temperature. Blood platelets, difficult to isolate in vitro without activating in a non reproducible manner specific membrane ligands, were replaced with biotin coated fluorescent polystyrene beads. The quantification of the migration of these platelet ghosts was conducted with the use of biological membranes fixed on the interior walls of the Couette apparatus. These streptavidin coated membranes ensure a strong adhesive affinity with the biotynilated beads. At 40% hematocrit and at a shear of 2 s-1, 566 ± 53 micro particles were counted for non aggregated erythrocytes, 1077 ± 229 for aggregating red blood cells and 1568 ± 131 for hyper aggregating blood. The results obtained suggest a strong participation of the red blood cell aggregation on the transport of platelet ghosts since the number of ghost cells fixed on the wall of the Couette rheometer increases almost exponentially with the level of aggregation present.

Les facteurs génétiques peuvent apporter des réponses à plusieurs questions que nous nous posons sur les traits humains, les maladies et la réaction aux médicaments, entre autres. Avec le temps, le développement continu d'outils d'analyse génétique nous a permis d'examiner ces facteurs et de trouver des explications pertinentes. Cette thèse explore plusieurs méthodes et outils génétiques, tels que le séquençage pan-exomique et le génotypage sur puce, dans un contexte d'analyse familial et populationnel pour étudier ces facteurs génétiques qui jouent un rôle dans une maladie rare, la cardiomyopathie dilatée (DCM), et dans deux traits complexes soient les globules rouges et les plaquettes. DCM est une maladie rare qui est définie par un ventricule gauche dilaté et une dysfonction systolique. Environ 30% des cas de DCM sont héréditaires, et plus de 50 gènes ont été associés à un rôle dans la pathogénicité de DCM. Le dépistage génétique est un outil de référence dans la gestion clinique de DCM familiale. Par contre, pour la majorité des patients, les tests génétiques ne parviennent pas à identifier une mutation causale dans un gène candidat. Les cellules sanguines remplissent une variété de fonctions biologiques, incluant le transport de l'oxygène, les fonctions immunologiques, ainsi que la guérison de plaies. Les niveaux de ces cellules et leurs paramètres auxiliaires sont mesurés par un test sanguin, et une différence avec les valeurs optimales peut signifier certains troubles. De plus, ces traits sont étudiés méticuleusement dans le contexte des maladies cardiovasculaires (CVD) où différents niveaux sont associés avec un risque variable de CVD ou sont des prédicteurs de complications de CVD. iii J'ai examiné la DCM et les traits sanguins avec comme objectif de découvrir des nouvelles associations de mutations génétiques. Pour la DCM, j'ai évalué la pertinence d'un séquençage pan-exomique dans un environnement clinique. Je rapporte plusieurs nouvelles mutations dans des gènes candidats (DSP, LMNA, MYH7, MYPN, RBM20, TNNT2) et des mutations nonsenses dans deux gènes nouvellement associés (TTN et BAG3), et je démontre que les mutations nonsenses influencent la maladie d'une manière différente des autres mutations causales. Je rapporte aussi une mutation dans un nouveau gène, FLNC, qui cause une forme rare et distincte de cardiomyopathie. Pour l'étude des traits complexes, dans le grand consortium Blood Cell Consortium (BCX), j'ai utilisé l’exomechip pour disséquer le rôle des variantes rares et communes dans les globules rouges et les plaquettes. J'ai identifié 16 nouvelles régions génomiques associées avec les globules rouges et 15 avec les plaquettes, parmi lesquelles se retrouvent plusieurs variantes de basses fréquences (MAP1A, HNF4A, ITGA2B, APOH), et j'ai démontré un chevauchement significatif de régions associées avec d'autres traits, incluant les lipides. Mes résultats sur la DCM ont mis en évidence le rôle de plusieurs gènes candidats, et suggèrent un traitement différent au niveau de la gestion clinique des patients qui portent des mutations dans BAG3 et FLNC. En ce qui concerne les traits sanguins, mes résultats contribuent à enrichir le répertoire de régions associées avec ces traits, soulignant l'importance de l'utilisation de grands ensembles de données pour détecter les variantes rares ou de basses fréquences. La découverte de gènes dans les maladies rares et les traits complexes contribue à la compréhension des mécanismes sous-jacents qui ultimement favorisera de meilleurs diagnostics, gestions et traitements de maladies. / Genetic factors hold within them the answers to many questions we have on human traits, disease, and drug response among others. With time, the continuously advancing genetic tools have enabled us to examine those factors and provided and continue to provide astonishing answers. This thesis utilizes various methods of genetic tools such as exome sequencing and chip-based genotyping data in the context of both family and population-based analyses to interrogate the genetic factors that play a role in a rare disease, dilated cardiomyopathy (DCM), and in two complex traits, red blood cells and platelets. DCM is a rare disease that is defined by a dilated left ventricle and systolic dysfunction. It is estimated that 30% of DCM cases are hereditary and more than 50 genes have been linked to play a role in the pathogenesis of DCM. Genetic screening of known genes is a gold standard tool in the clinical management of familial DCM. However, in the majority of probands, genetic testing fails to identify the causal mutation. Blood cells play a variety of biological functions including oxygen transport, immunological functions, and wound healing. Levels of these cells and their associated indices are measured by a blood test, and deviation from optimal values may indicate certain disorders. Additionally, these traits are heavily studied in the context of cardiovascular disease (CVD) where different levels associate with a variable risk of CVD or are predictors of CVD complications or outcomes (for example, a higher level of white blood cells or lower level of hemoglobin). I examined both DCM and blood cell traits and aimed to discover new mutations and variants that are associated with each. For DCM, I evaluated the value of whole exome vi sequencing in a clinical setting, and I report a number of novel mutations in candidate genes (DSP, LMNA, MYH7, MYPN, RBM20, TNNT2) and truncating mutations in two newly established genes, TTN and BAG3, and I demonstrate that truncating mutations in the latter influence disease differently than other causal mutations. I also report a mutation in a novel gene, FLNC that causes a rare and distinct form of cardiomyopathy. In examining complex traits, I dissected the role of common and rare variants in red blood cells and platelets within a large consortium, the Blood Cell Consortium (BCX) using the ExomeChip, and identified 16 novel loci associated with red blood cell traits and 15 with platelet traits, some of which harbored low-frequency variants (MAP1A, HNF4A, ITGA2B, APOH), and demonstrated a substantial overlap with other phenotypes predominantly lipids. My results on DCM establish the role of a number of candidate genes in this disorder and suggest a different course of clinical management for patients that carry mutations in BAG3 and FLNC. As for blood cell traits, my results contributed to expanding the repertoire of loci associated with red blood cell and platelet traits and illustrate the importance of using large datasets to discover low-frequency or rare variants. Gene discovery in rare disease and complex traits gives insight into the underlying mechanisms which ultimately contributes to a better diagnosis, management, and treatment of disease.

L’utilisation de stratégies transfusionnelles restrictives (pas de transfusion de globules rouges si hémoglobine > 70 g/L) a été démontrée comme étant sécuritaire en aiguë et celles-ci sont maintenant largement utilisées aux soins intensifs pédiatriques (SIP). En conséquence, plus de patients quittent les SIP en étant anémiques. L’anémie chronique, plus spécifiquement l’anémie ferriprive, est associée à des issues neurodéveloppementales défavorables. Peu d’études sont disponibles pour caractériser la prévalence de l’anémie au congé des SIP. Les études présentées dans ce mémoire s’intéressent à cette question en examinant d’abord le problème de l’anémie aux SIP et son traitement (revue narrative), puis sa prévalence au congé chez tous les patients ayant survécu aux SIP sur une période de 5 ans et pour finir, la prévalence de ce problème chez les nourrissons admis pour une chirurgie cardiaque (via 2 études de cohorte rétrospectives). Nous avons démontré que 50,9% des patients survivant à un séjour aux SIP sont anémiques au congé. Cette proportion varie en fonction du type d’admission (44,8% médicale, 70,3% chirurgicale non-cardiaque et 53,3% chirurgicale cardiaque). Le fait d’être anémique à l’admission aux SIP est le facteur de risque le plus souvent associé à l’anémie au congé des SIP (rapport des cotes, RC : 14,41). Chez les nourrissons ayant subi une chirurgie cardiaque, la prévalence d’anémie au congé est de 27,7%. La proportion de patients quittant les SIP anémiques est alarmante : il est primordial de déterminer la trajectoire et l’impact de ce problème chez les patients survivant à une maladie critique. / It is now clear that restrictive transfusion strategies (no red blood cell transfusion if the hemoglobin level is > 70 g/L) are safe in acute settings. Therefore, these strategies are widely being used in Pediatric Intensive Care Unit (PICU) and as a consequence, numerous children leave the PICU anemic. Prolonged anemia, especially iron-deficiency anemia, is associated with worst neurocognitive outcomes. Data regarding the true prevalence of anemia at PICU discharge is lacking. This thesis addresses this question. Etiology and management of anemia in the PICU is explored through a narrative review. Prevalence of anemia at PICU discharge is examined through two retrospective cohort studies: the first describes the prevalence of this complication in PICU survivors over a five-year period and the second one, the prevalence of anemia in infants admitted to the PICU after cardiac surgery. Through our studies, we established that the prevalence of anemia at PICU discharge was 50.9% in PICU survivors. This proportion varied depending on the type of admission (44.8%, 70.3%, and 53.3% for medical, non-cardiac surgery, and cardiac surgery respectively). Anemia at PICU admission was the most important risk factor associated with anemia at PICU discharge (odds ratio, OR 14.41). In newborns less than 6 weeks old who underwent cardiac surgery, the prevalence of anemia at PICU discharge was 27.7%. Given the alarming proportion of PICU survivors that are anemic at discharge, it is paramount that we determined the trajectory and impact of this problem in critically ill survivors.

Les cellules sanguines jouent un rôle fondamental dans le bon fonctionnement du corps et sont régulées de manière à répondre à ses besoins immédiats. Malgré leurs fonctions distinctes, plusieurs études suggèrent que les processus de régulations des globules rouges et des plaquettes sanguines interagissent entre eux, notamment par l'intervention d'hormones. On s'intéresse ici aux interactions conceptuelles entre ces deux familles de cellules sanguines à l'aide d'un modèle de deux équations différentielles à délais couplées. L'analyse de la distribution des valeurs propres de l'équation caractéristique du modèle linéarisé permet de dresser un portrait de stabilité de l'équilibre du système dans un plan de paramètre approprié. On s'intéresse notamment aux possibilités de déstabilisation et de restabilisation par le couplage des deux équations. L'analyse des diagrammes de stabilité pour ces différents cas de figure permet de mettre en évidence des dynamiques intéressantes comme des alternances de stabilité par l'action des délais et différents types de bifurcations déstabilisatrices de l'équilibre. / Blood cells play a fundamental role in the proper functioning of the body and are regulated to respond to its immediate needs. Despite their distinct functions, several studies suggest that the regulatory processes of red blood cells and blood platelets interact with each other, notably through the intervention of hormones. We aim to study the conceptual interactions between these two families of blood cells using a coupled two-delay differential equation model. The analysis of the distribution of eigenvalues of the characteristic equation of the linearized model allows us to outline a stability portrait of the system in a suitable parameter plane. We are particularly interested in exploring the possibilities of destabilization and restabilization through the coupling of the two equations. The analysis of stability diagrams for these different scenarios highlights interesting dynamics such as stability switches due to the influence of delays and various types of destabilizing bifurcations of the equilibrium.

Les rapports d’activité de l’Établissement Français du Sang (EFS) font état d’une demande croissante de produits sanguins labiles (PSL) tels les concentrés globules rouges (CGR), les plaquettes, et le plasma. Afin d’assurer la demande vitale en PSL, il est primordial d’optimiser la logistique liée aux activités de collecte du sang et de ses composants. Pour faire face à cette situation, l’EFS Auvergne-Loire mène une réflexion dans le but d’utiliser de manière plus efficiente les dispositifs de collecte en sites fixes et mobiles pour améliorer (i) la qualité de service rendue au donneur, et (ii) l’efficience de l’utilisation des ressources humaines. Dans ce contexte nous avons développé dans cette thèse des outils opérationnels pour (i) la modélisation des dispositifs de collecte, (ii) la régulation des flux de donneurs, et (iii) la planification de collectes mobiles.La méthode d'analyse des dispositifs de collecte est basée sur des techniques de simulation à événements discrets. Une modélisation préalable des flux de donneurs dans les systèmes de collecte en sites fixes et mobiles à l’aide de réseaux de Petri a été proposée. Pour la régulation de flux de donneurs, notamment pour la planification optimale des rendez-vous des donneurs et la planification de la capacité dans les systèmes de collecte au site fixe, deux approches ont été abordées: (a) Construction d'un algorithme basée sur techniques d'optimisation stochastique via simulation ; (b) Programmation mathématique: Modèle de programmation en nombres entiers non-linéaire (MINLP) basée sur réseaux de files d'attente et représentation et évaluation des systèmes à événements discrets à travers de programmation mathématique. Pour la planification de collectes mobiles. Deux types de modèles ont été développés : (a) Au niveau tactique : Modèles de programmation en nombres entiers linéaire (MIP) pour planifier les semaines de collectes pour chaque ensemble disponible sur un horizon de temps pour garantir l'autosuffisance à niveau régional des CGR. (b) Au niveau opérationnel : Modèle de programmation en nombres entiers linéaire (MIP) pour l’organisation du travail des équipes en charge de la collecte. / Activity reports of the French Blood Establishment (EFS) indicate a growing demand for Labile Blood Products (LBP) as red blood cells (RBC), platelets and plasma. To ensure the vital demand of labile blood products (LBP), it’s essential to optimize the logistics related with the collection of blood components. To deal with this situation, the EFS Auvergne-Loire carry out a reflection in order to use more efficiently the collection devices in fixed and mobile sites, to improve the quality of service offered to the donor and the efficiency of human resources. In this context we have developed in this thesis operational tools for (i) modeling of blood collection devices (ii) The regulation of flows donors (iii) Planning of bloodmobile collections.The method analysis of collection devices is based on techniques of discrete event simulation. A preliminary modeling of donors’ flow in fixed and mobile collection systems using Petri nets was conducted. For the regulation of flow of donors, i.e. the optimal capacity planning and appointment scheduling of blood collections, two approaches were considered: (a) Simulation based-optimization.(b) Mathematical Programming: Mixed integer nonlinear programming (MINLP) based on queuing networks and mathematical programming representation of discrete event systems. For planning of bloodmobile collections. Two models have been developed: (a) At the tactical level: Mixed integer linear programming (MIP) to determine the weeks in which the mobile collection must be organized in order to ensure the regional self-sufficiency of RBC. (b) At the operational level: Mixed integer linear programming (MIP) for the planning of human resources in charge of blood collections.