Orientador: Maria Helena Andrade Santana / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-08T14:24:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Torre_LucimaraGazioladela_D.pdf: 28769884 bytes, checksum: 485f026c87d2f5b4fb99e642474200d0 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Este trabalho visa o desenvolvimento tecnológico de uma vacina gênica, destinada ao combate à tuberculose, na qual o DNA encontra-se veiculado em lipossomas. Foram enfocados três aspectos principais: 1.A preparação e caracterização de estruturas lipídicas funcionais veiculando o DNA, projetadas para atenderem aos requisitos de imunização contra a tuberculose; 2. Complexação do DNA com peptídio sintético promotor de transporte nuclear e veiculação na estrutura lipossomal que se mostrou mais promissora nos ensaios in vitro e in vivo realizados no CPT-RP. 3. Análise do escalonamento da produção da estrutura lipossomal mais promissora para subsequente veiculação do DNA. Duas estruturas lipossomais foram compostas por lipídios com as seguintes funcionalidades: estrutural, de incorporação do DNA e atração eletrostática com a superfície das células, de intensificação da liberação do DNA no citoplasma celular. Foram preparadas pelo método da desidratação-rehidratação, gerando DRVs (¿dehydrated-hydrated vesicles¿). O DNA foi associado à essas estruturas, localizando-se no interior, [DRV(DNA)] ou prefencialmente na sua superfície [DRV-DNA]. A terceira estrutura, um agregado lipídico não lipossomal designado por lipoplexo, foi preparado na ausência do lipídio estrutural, contendo o DNA associado em toda a sua superfície. As estruturas foram caracterizadas através do seu diâmetro hidrodinâmico e distribuição de tamanhos, razão de cargas para completa incorporação do DNA, carga superficial, transição de fases, acessibilidade de sonda de fluorescência ao DNA e morfologia. O peptídio sintético com seqüência não convencional foi associado à estrutura DRV-DNA. O escalonamento da produção de lipossomas foi analisado através de dados experimentais e simulação matemática da cinética de produção de lipossomas em sistema multitubular. Dos resultados conclui-se que a estrutura DRV-DNA é promissora para a produção de vacina contra a tuberculose tanto pela sua efetividade biológica quanto do ponto de vista tecnológico / Abstract: This work contributes to the technological development of a gene vaccine against tuberculosis, where DNA is transported within liposomes. The three main aspects focused on were: 1. Functional lipid structures for DNA delivery were prepared and characterized in the attempt to obtain immunization standards against tuberculosis; 2. The best lipid structure was chosen from in vitro and in vivo assays performed in the ¿Centro de Pesquisas em Tuberculose de Ribeirão Preto¿ ¿ CPT-RP. A synthetic peptide that promotes nuclear transport was complexed to DNA and included into the best lipid structure. 3. Scale up analysis for the production of the best lipid structure that was used for DNA delivery. Two types of liposomes were composed by lipids with the following properties: (i) structure, (ii) DNA incorporation and electrostatic attraction with cell surface, and (iii) helper, that facilitates the DNA release to the citosol. These structures were prepared by the dehydrated-hydrated method, generating DRVs (dehydrated-hydrated vesicles). The DNA was associated in the inner compartment, [DRV(DNA)], or mostly at the surface [DRV-DNA] of these structures. The third structure, a lipid aggregate that does not form liposomes and was named lipoplex, was prepared in the absence of the structural lipid, used in previous preparations, which contained DNA associated with all of the aggregate¿s surface. The physico-chemical characterization of the structures were based on the hydrodynamic diameter and size distribution of the lipid particles, charge ratio for DNA incorporation into the lipid structure, surface charge, phase transition temperatures, the fluorescent probe accessibility to DNA and morphology of the particles. A synthetic peptide, with non-conventional sequence was associated to the DRV-DNA structure. The scale up for the liposome production was analyzed through the acquisition of experimental data and mathematical simulation of the liposomes production in a multitubular system. The results demonstrate that the incorporation of DNA into a lipid structure is very promising as a tuberculosis vaccine, especially in regards to the complexation of DNA with empty DRVs. The technological aspects of scaling up also confirm the viability of preformed liposomes production / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

Orientadores: Ana Maria Frattini Fileti, Galba Maria de Campos Takaki / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-06T21:06:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Albuquerque_ClarissaDaisydaCosta_D.pdf: 8871218 bytes, checksum: 55101c854d0f7293da9222f2518c7c15 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Entre as técnicas convencionais usadas para desenvolvimento de software sensores, redes neurais artificiais têm mostrado ser um instrumento poderoso em modelagem e controle de bioprocessos complexos. O objetivo geral do presente trabalho é o desenvolvimento de software sensores baseados em redes neurais para estimação e previsão em tempo real da concentração de biomassa e da atividade de emulsificação no processo de produção de bioemulsificante por Cândida lipolytica. Bioemulsificantes normalmente apresentam vantagens como biodegradabilidade, baixa toxicidade e biocompatibilidade em relação a emulsifícantes sintetizados quimicamente. Adicionalmente, eles apresentam potencial para serem sintetizados a partir de substratos de baixo custo e são normalmente efetivos em condições extremas de pH, temperatura e salinidade. Consequentemente, bioemulsificantes têm sido aplicados com sucesso em áreas como biorremediaçào e recuperação de óleos. Contudo, os bioemulsificantes não são ainda largamente empregados por conta do seu alto custo de produção, resultante primeiramente da baixa produtividade dos microrganismos empregados e do alto custo de recuperação. Entretanto, neste trabalho foi mostrado que o desenvolvimento de softsensores neurais juntamente com otimização de componentes de meio de produção e ampliação de escala do processo podem contribuir para tomar a produção de bioemulsificante mais eficiente e econômica. O modelo quadrático obtido na otimização dos componentes do meio usando planejamento composto central com três fatores e metodologia de superfície de resposta mostrou significância estatística e capacidade preditiva. A máxima atividade de emulsificação para emulsões água-em-hexadecano obtida foi de 4,415 UAE e as concentrações ótimas de uréia, sulfato de amónio e fosfato monobásico de potássio foram respectivamente iguais a 0,544 % (w/v), 2,131 % (w/v) and 2,628 % (w/v). O rendimento do processo foi otimizado em 272%. A ampliação do processo da escala de frascos para a escala de fermentador de bancada foi realizada com sucesso e os efeitos e interações da temperatura e velocidade de agitação sobre a atividade de emulsificação do bioemulsificante produzido por Cândida lipolytica foram investigados. Os conjuntos de dados necessários para o treinamento, validação e teste dos softsensores foram obtidos de experimentos de produção de bioemulsificante realizados em biorreator de 5L, sob diferentes condições de temperatura e agitação. Os conjuntos de treinamento, validação e teste dos softsensores foram suavizados e expandidos usando interpolação com spline cúbica. Várias topologias de redes neurais com uma camada escondida foram testadas. As variáveis de entrada do processo incluíram pH, oxigênio dissolvido, densidade ótica e salinidade do liquido metabólico livre de células. O algoritmo de treinamento usado foi o algoritmo de retropropagação baseado em Levenberg-Marquardt em conjunção com regularização bayesiana. A raiz do erro quadrático médio (RMSE) e o coeficiente de determinação global (Rg2) foram usados entre outros índices para comparar o desempenho dos modelos. Os resultados mostram que softsensores neurais fornecem estimação e previsão on-line de concentração de biomassa e de atividade de emulsificação dentro de uma variação aceitável de 5% dos valores experimentais. Coeficientes de determinação global superiores a 0,90 indicam o excelente ajuste dos modelos de redes neurais com os valores experimentais testados, obtidos para concentração de biomassa e atividade de emulsificação / Abstract: Among conventional techniques used for development of 'software sensors', artificial neural networks have showed to be a powerful tool for modelling and control of complex bioprocess. The present work deals with the development of neural network based software sensors for real time estimation and prediction of biomass concentration and emulsification activity in a bioemulsifier production process by Candida lipolytics Bioemulsifiers commonly have the advantages of biodégradation, low toxicity, and biocompability over chemically synthesized emulsifiers. In addition, they can potentially be synthesized from cheap subtrates and are commonly effective at extremes of pH, temperature, and salinity. As a result, bioemulsifiers have found successful application in areas such as bioremediation and oil recovery. However, bioemulsifiers are not widely available because of their high production costs, which results primarily from low strain productivities and high recovery expenses. Therefore, in this work was showed that on-iine neural softsensor development jointly with media optimization and scale up of the process can make bioemulsifier production more efficient and more economical.The second order model obtained in the optimization of the medium components using three-factor central composite design and response surface methodology showed statistical significance and predictive ability. It was found that the maximum emulsification activity to water-in-hexadecane emulsion produced was 4,415 UEA and the optimum levels of urea, ammonium sulfate and potassium dihydrogen orthophosphate were, respectively, 0,544 % (w/v), 2,131 % (w/v) and 2,628 % (w/v). The emulsifier production process yield was optimized in 272 %. Successful scale-up from flasks to laboratory scale bioreactor was attained and the effects and interactions of the temperature and agitation rate on the emulsification activity of the bioemulsifier produced by Candida lipolytica were investigated. The data sets required to training, validation and test the neural software sensors were obtained from bioemulsifier production experiments carried out using com oil and sea water based media in a 5L bioreactor, under different temperature and agitation conditions. The training, validation and test sets were smoothed and expanded by interpolation using a piecewise smoothing cubic spline. Several neural network topologies with one hidden layer were tested. The input process variables included pH, dissolved oxygen, optic density and free cell metabolic liquid salinity. The training algorithm used was the Levenberg-Marquardt based backpropagation algorithm, in conjunction with Bayesian regularization. The root mean square error (RMSE) and the global determination coefficient (Rg2) among others index were used to compare model performances. The results showed that neural 'software sensors' supplied for biomass concentration and emulsification activity on-line estimation and prediction within an acceptable variation of 5% of the experimental values. Global coefficients of determination higher than 0.90 indicated excellent agreement of the neural network models with experimental test values, obtained for biomass concentration and emulsification activity / Doutorado / Sistemas de Processos Quimicos e Informatica / Doutor em Engenharia Química