Mit einer Prävalenz von 15% der Gesamtbevölkerung und sogar über 30% bei den Frauen über dem 50. Lebensjahr zählt die Osteoporose zu den Erkrankungen welcher bei steigender Lebenserwartung zunehmend sozioökonomisches Gewicht zukommt. Die Folgekosten bei Komplikationen wie Frakturen nach Stürzen übersteigen die einer Therapie um einiges. Ein Motor der Entstehung von Osteoporose ist oxidativer Stress. Dieser regt über Enzymkaskaden die Bildung und Aktivierung von Osteoklasten an, was einen erhöhten Knochenabbau zur Folge hat. Zu den körpereigenen Verteidigungstrategien gegen Oxidation gehören Selenoproteine wie Glutathionperoxidasen. In einer vorangegangenen Arbeit von Prof.Jakob und C. Becker wurde bereits ein Zusammenhang der GPx-Aktivität mit der Ausbildung von Osteoporose nachgewiesen. Osteoporotiker hatten eine signifikant verminderte Aktivität dieses Enzyms. Ein essentielles Spurenelement für die Herstellung der Gluthationperoxidasen ist Selen. Deutschland gilt diesbezüglich als Mangelversorgungsgebiet. Es ist bekannt, dass ein Mangel an Selen Krankheiten begünstigen kann. Als Beispiele seien hier die Keshan-Krankheit oder Kashin-Beck- Krankheit genannt. Auch in der Intensivmedizin wurde ein Nutzen der Selengabe bei Sepsispatienten nachgewiesen. Die Selenspiegel aller eingeschlossenen 163 Probanden wurden untersucht. Es zeigte sich durchgehend eine leichte Erniedrigung. Signifikante Unterschiede ergaben sich nicht. Ein mutmaßlicher Mangel an Selen war als Ursache für eine verminderte Gluthationperoxidaseaktivität nicht nachzuweisen. Da der Hauptproduktionsort der GPx die Niere ist, wurde als Arbeitsthese die Vermutung aufgestellt, dass eine Niereninsuffizienz über eine verminderte Produktion dieser antioxidativ wirkenden Enzyme als Ursache einer Osteoporose in Frage kommt. Berechnet wurde die Niereninsuffizienz in Form der GFR nach der Cockroft-Gault- Formel. Es ergab sich eine signifikante Reduzierung der GFR zwischen Kontrolle und Osteoporosegruppe (p<0,05) nicht aber zwischen Kontrolle und Osteopeniegruppe und Osteopenie- und Osteoporosegruppe. Bezüglich des Alters und GFR konnte eine signifikante Korrelation nachgewiesen werde. Zwischen der GPx-Aktivität und der glomerulären Filtrationsrate bestand eine signifikante Korrelation ( Korrelation nach Pearson 0.149 mit einer Signifikanz von 0.018; Spearman-Rho 0.162 mit Signifikanz 0.010 beides p< 0,05). Es bestätigt sich also die in der Literatur bekannte positive Assoziation der gestörten Nierenfunktion mit der Manifestation der Osteoporose. Mit der GPx wird in dieser ersten Arbeit ein Sekretionsprodukt der Niere identifiziert, welches über eine Verminderung der Sekretion in der gestörten Nierenfunktion die antioxidative Kapazität des Organismus einschränkt und damit die Entstehung einer Osteoporose begünstigen könnte. / Selenium deficiency and renal insufficiency as putative risk factors for osteoporosis

Les Selenoprotéines sont des protéines contenant un résidu sélénocystéine (U) dans leur séquence en acide amines. Vingt-cinq sélénoprotéines constituent le sélénoprotéome humain. Parmi elles, la sélénoprotéine N ou SelenoN ; des mutations dans le gène SELENON donnent lieu à un groupe de dystrophies musculaires congénitales appelées myopathies liées à SELENON. SelenoN est une protéine membranaire glycosylée de 72 kDa localisée dans le réticulum endoplasmique. Sa séquence en acide aminés contient le motif redox SCUG, similaire à celui des thioredoxines réductases. Elle contient de même un domaine EF-hand qui est un domaine de liaison au calcium. Des études ont récemment démontré l’implication de cette protéine dans l’établissement et la maintenance du muscle squelettique. D’autres études ont montré qu’elle joue un rôle dans la protection contre le stress oxydatif et l’homéostasie du calcium. Cependant, le mécanisme catalytique de SelenoN reste inconnu à ce jour. Le projet décrit dans cette thèse s’intéresse à la caractérisation, la cristallisation et la comparaison des SelenoNs d’une bactérie, Candidatus poribacteriae, et du poisson zèbre. Les études bio-informatiques ont démontré que SelenoN bactérienne et du poisson zèbre partagent 37% d’identité et un domaine commun correspondant à un repliement de type thioredoxine de fonction inconnue, contenant le motif redox. Les caractérisations biophysiques ont démontré que les deux protéines sont naturellement bien repliées et riche en hélices α. La protéine bactérienne comportant en C-terminal de sa séquence en acide aminé un domaine thioredoxine additionnel, présente une forme étendue et est sous forme monomérique tandis que la protéine du poisson zèbre est un dimère compact. Des caractérisations biochimiques ont montré que le Ca2+ influence l’oligomérisation ou la conformation de SelenoN du poisson zèbre. Des cristaux initiaux de la protéine eucaryote sous sa forme déglycosylée ont pu être obtenus. La cristallisation de la protéine bactérienne a permis d’obtenir des cristaux appartenant à deux groupes d’espaces, avec des paramètres de cellule différents. Néanmoins, un modèle partiel à 2.3 Å couvrant le domaine C-terminal thioredoxine additionnel de SelenoN bactérienne a été obtenu. L’ensemble de ces résultats permettent de poser les bases de l’étude structure-fonction de SelenoN. L’expression, la purification et la cristallisation ont été optimisées et une stratégie pour résoudre la structure 3D de la protéine est proposée. / Selenoproteins are proteins containing a selenocysteine residue (U) in their amino acid sequence. Twenty-five proteins constitute the human selenoproteome. Among them is Selenoprotein N or SelenoN; mutations in the SELENON gene can lead to a group of congenital dystrophies now designated as SELENON-related myopathies. SelenoN is a 72 kDa membrane and glycosylated protein of the endoplasmic reticulum. It handles in its amino acid sequence a redox motif SCUG like the one of thioredoxin reductases, and an EF-hand domain which is a calcium binding site. Recent studies showed the implication of SelenoN in muscle development and maintenance, and position its function at the crossroad between oxidative stress control and calcium homeostasis. However, its catalytic function remains elusive. The research project presented in this thesis concerns the crystallization, characterization and comparison of one bacterial and the zebrafish SelenoNs. Bioinformatics analyses revealed that the two proteins share 37% degree of identity and a common domain which corresponds to a thioredoxin fold of unknown function which includes the redox motif SCUG. From the biophysical characterization, both recombinant proteins are found to be naturally well-folded and enriched in α-helical domains. The bacterial SelenoN which handles an additional C-terminal thioredoxin domain is an extended monomer whereas zebrafish SelenoN is a compact dimer. Biochemical characterization indicated that Ca2+ binding mediates zSelenoN oligomerization. Initial crystals of the zSelenoN in its deglycosylated form were obtained. Bacterial SelenoN crystallization yielded crystals belonging to two different space groups with different cell parameters. An initial partial model covering the C-terminal thioredoxin domain of the bacterial SelenoN was obtained at 2.3Å. Together, these results lay a foundation for the structure-function studies of SelenoN. Conditions for recombinant bacterial and zebrafish SelenoNs expression, purification and crystallization were optimized and strategies for solving the structure are being proposed.

Se ist ein essentielles Spurenelement, das seine biologische Aktivität als Selenocystein in den katalytischen Untereinheiten von Selenoproteinen entfaltet. Es wird als Supplement in der Prävention und Therapie einiger Volkskrankheiten wie Autoimmunerkrankungen und Krebs eingesetzt. Die verfügbaren Ergebnisse der klinischen Studien deuten auf geschlechtsspezifische Unterschiede in der Wirksamkeit von Se. Aus diesem Grunde sollte in der vorliegenden Arbeit die Biosynthese von Selenoproteinen in männlichen und weiblichen Mäusen als Modellorganismus für höhere Säugetiere analysiert und verglichen werden. Die gewonnenen Ergebnisse belegen eindeutig, dass die mRNA Konzentrationen von Selenoprotein P, der 5''-Iodothyronin-Deiodase Typ 1 und der extrazellulären Glutathion-Peroxidase 3 geschlechtsspezifische Unterschiede aufweisen. Dieser Dimorphismus ist jedoch nicht konstant, sondern variiert von Gewebe zu Gewebe und zeigt überdies auch eine Abhängigkeit vom Se-Status der Tiere und dem untersuchten Mausstamm. Überraschenderweise korrelieren die resultierenden Proteinmengen nicht linear mit den Unterschieden der mRNA Konzentrationen. Besonders die 5''-Iodothyronin-Deiodase Typ 1 zeigt ausgeprägte Unterschiede in Leber und Niere, wobei sich die Geschlechtsdimorphismen auf mRNA- und Protein-Ebene unterschiedlich stark ausprägen und vom Se-Status beeinflusst werden. Zusammengenommen zeigt diese Arbeit, dass die Expression von Selenoproteinen auf zwei Kontrollebenen geschlechtsspezifisch reguliert wird: über steroidabhängige Gentranskription werden unterschiedliche mRNA Konzentrationen abhängig vom Mausstamm, Alter und Se-Status in den Geweben exprimiert, und über noch nicht eindeutig identifizierte Mechanismen wird die Effektivität, mit der diese Transkripte in die entsprechenden Selenoproteine übersetzt werden, geschlechtsspezifisch kontrolliert. Diese Se-abhängige Regulation der Biosyntheserate, die vermutlich über eine veränderte Translationseffizienz erfolgt, stellt ein sehr überraschendes Ergebnis dar. Sollte es sich in menschlichen Proben bestätigen, so könnten diese Ergebnisse helfen, die geschlechtsspezifischen Befunde in den klinischen Supplementationsstudien zu verstehen und entsprechend abgestimmte Empfehlungen für eine unterschiedliche Supplementation von Mann und Frau zu erarbeiten. / Selenium is an essential trace element and acts as Selenocystein in the catalytic entity of selenoproteins. It is currently in use as supplement in the prevention and therapy of a variety of diseases including autoimmune diseases and cancer. The epidemiological and clinical data indicate that the effectiveness of Se supplementations is sex-specific. Therefore, this thesis was initiated to analyse and compare the expression of selenoproteins in male and female mice as a suitable model organism for higher mammals. The experimental data clearly indicate that selenoprotein P, type I 5'' iodothyronine deiodinase and the secreted glutathione peroxidase 3 display sex-specific differences in mRNA concentrations. The sexual dimorphic expression patterns of these selenoproteins are not constant but depend on the tissue, the Se-status of the animals and the specific mouse strain analysed. Surprisingly, no direct correlation is observed when mRNA levels and expressed protein concentrations are compared. This becomes very obvious in the case of type I 5'' iodothyronine deiodinase in liver and kidney. Both mRNA and protein levels differ between the sexes in a discordant and Se-dependent manner. Taken together, this thesis indicates that selenoprotein expression is regulated in a sex-specific manner by two different mechanisms. First of all, steroid-dependent gene transcription gives rise to sexually dimorphic mRNA levels in the different tissues. Mouse strain, age and Se-status influence this process. Secondly, the sexes differ profoundly with respect to the efficiency of selenoprotein biosynthesis from a given number of transcripts. Presumably, this process involves Se-dependent translational control mechanisms that have not been described before. Under the assumption that these results can be verified with human samples, it is conceivable that this new mechanism might help to explain some of the enigmatic sex-specific effects observed in human supplementary studies and that sex-specific supplementation regimen need to be worked out in the long run.

Das ITC SFN und der Mikronährstoff Se sind bekannt als chemopräventive Inhaltsstoffe von Gemüse der Brassica-Familie, welcher auch Brokkoli angehört. Die Wirkungen von sowohl SFN als auch Se beruhen auf zahlreichen verschiedenen Mechanismen. Es existieren jedoch Schnittstellen, an welchen Interaktionen beider Substanzen möglich sind. Basierend auf diesem Wissen wurden in dieser Arbeit Wechselwirkungen zwischen SFN und Se auf die Aktivität sowie Expression von Phase II Enzymen und Selenoproteinen untersucht. Der Einfluss der Kombination von SFN und Se auf die unter physiologischen Bedingungen stattfindende Proliferation und Apoptose war ebenso Gegenstand der Arbeit wie die Modulation von Entzündungsprozessen sowie der Tumorentstehung während der entzündungsverstärkten Colonkanzerogenese im Mausmodell. Das hinsichtlich seiner Wirksamkeit mit aus GRA hydrolysiertem SFN zunächst als vergleichbar befundene synthetische SFN wurde für die Untersuchung im AOM/DSS-induzierten Colontumormodell gewählt und in Kombination mit 3 verschiedenen Selendiäten verabreicht. Der Einfluss von SFN und Se auf Phase II Enzyme und Selenoproteine entlang des GIT war organabhängig und nach 4 Wochen geringer als nach 7 Tagen. Die schwächere Induktion deutet auf eine Anpassung des Organismus hin. Ein SFN-vermittelter Effekt auf NQO1 war im Selenmangel am deutlichsten. Die Aktivität des Selenoproteins TrxR wurde hingegen erst bei ausreichender Selenversorgung durch SFN beeinflusst. Die als Nrf2-Zielgen bekannte und in der Hierarchie der Selenoproteine einen hohen Rang einnehmende GPx2 konnte in bestimmten Organen bereits unter selenarmen Bedingungen durch SFN induziert werden. Eine Überexpression des Enzyms war jedoch nicht möglich. SFN steigerte, unabhängig vom Selenstatus, im oberen Abschnitt des GIT und im Colon die Aktivität der GST. Eine Induktion des eigenen Metabolismus wäre somit denkbar. Im Falle eines Mangels an GPx2 wurde GPx1 bei hinreichender Selenversorgung stärker exprimiert, allerdings konnte sie die Funktion von GPx2 nicht völlig erset-zen. Im Selenmangel kann die Aktivitätssteigerung der TrxR im Dünndarm, dem Ab-schnitt der Selenabsorption, als ein Versuch der GPx2-Kompensation angesehen werden. SFN war nicht in der Lage, über eine Aktivierung des Nrf2/ARE-Signalweges kompensatorische Effekte zu induzieren. Apoptotische Prozesse wurden unter physiologischen Bedingungen nur marginal durch SFN und Se moduliert. Das elektrophile ITC konnte lediglich im Selenmangel Apoptose im luminalen Bereich der Colonkrypten induzieren. Die durch supranutritive Selenkonzentration induzierte Apoptose im Kryptengrund wurde nicht durch SFN beeinflusst. Einer bei Abwesenheit der GPx2 erhöhten Apoptoserate im Kryptengrund wirkte SFN bei adäquater Selenversorgung entgegen, war indessen proapoptotisch unter selendefizienten Konditionen. Der Einfluss von SFN auf die Entzündung war deutlich abhängig vom Selenstatus. Während SFN im Selenmangel anscheinend prooxidative Prozesse induzierte und die Entzündungssymptome verschlimmerte, wirkte es unter adäquatem Selenstatus an-tiinflammatorisch. Den vergleichsweise milden Grad der Entzündung im selensupplementierten Status konnte SFN nicht zusätzlich beeinflussen. SFN veränderte die Inzi-denz colorektaler Tumore nicht. Ein, die Tumorinitiation blockierender SFN-Effekt durch direkte Hemmung der metabolischen Aktivierung des Prokanzerogens im selenadäquaten Zustand scheint offensichtlich. Eine Überversorgung mit Se kann protektiv im Hinblick auf Entzündung oder Colonkanzerogenese sein, jedoch bewirkt SFN keinen zusätzlichen Schutz. Kombinationseffekte von SFN und Se in Bezug auf Phase II Enzyme, Selenoproteine und Apoptose sowie die entzündungsverstärkte Colonkanzerogenese sind nicht eindeutiger Natur und können, abhängig vom Endpunkt, synergistische oder antagonistische Züge aufweisen. Eine bei Selendefizienz deutlichere Wirkung von SFN kann mit Hilfe der gesteigerten Aktivierung von Nrf2 erklärt werden, dies muss jedoch nicht von Vorteil sein. Bei adäquater Selenversorgung kann SFN kurzfristig antiinflammatorische und antikanzerogene Prozesse induzieren. Von einer längerfristigen ständigen SFN-Aufnahme in Form von GRA-reichen Brassicacea ist jedoch abzuraten, da von einer Adaptation auszugehen ist. Die Wirkung von SFN innerhalb der komplexen Pflanzenmatrix bleibt Gegenstand zukünftiger Untersuchungen. / Sulforaphane (SFN), a versatile actor derived from broccoli or other brassicaceae, is proposed to be a dietary anticarcinogen. Together with an adequate selenium status, it has been associated with a decreased risk for developing certain forms of cancer. In our mouse model, we investigate the influence of SFN and Se on the expression and activity of selenoproteins and phase II enzymes as well as the effects on inflammation triggered colon carcinogenesis. SFN increased NQO1 activity and protein expression significantly in the ileum, in both, Se-deficiently and Se-adequately fed animals. TrxR activity was increased in Se-adequately compared to Se-deficiently fed mice, SFN positively affected TrxR activity only in the former ones. An increase of GPx2 protein expression by SFN was observed in the ileum of mice of both diets. GPx1 reacts sensitively on Se supply. GST was the only enzyme analyzed being significantly increased by SFN on activity level in the colon. All AOM/DSS treated animals showed an inflammation, which was attenuated by SFN within Se-adequacy. In contrast, Se-deficient animals showed a more severe inflammation. The administration of SFN therefore seemed to enhance this even more and to be not beneficial in this case. SFN inhibited colon carcinogenesis in Se-adequate mice when being administered together with AOM. To summarize, both, GPx2 and TrxR, require selenium in order to be synthesized. In contrast to TrxR, the SFN-mediated induction of GPx2, the highest ranking selenoprotein, does not depend on additional selenium supply. Whereas distinct effects by SFN were observed in the ileum, only GST was influenced by SFN in the colon. SFN seems to induce its own metabolism. In conclusion, SFN and Se attenuate inflammation and colon carcinogenesis, preferably by means of up-regulating the endogenous defense system and inhibiting the metabolic activation of AOM.

Les maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington sont des pathologies progressives qui affectent le système nerveux, conduisant à la mort de certaines cellules nerveuses. Toutes ces maladies se caractérisent par la perte progressive de neurones dans des régions plus ou moins localisées du système nerveux, entraînant des complications cognitives, motrices ou perceptives. La MP est caractérisée par une dégénérescence sélective et progressive des neurones dopaminergiques situés dans la substance noire pars compacta (SNc), et de leurs terminaisons nerveuses qui normalementlibèrent la dopamine dans le striatum. Bien que les causes exactes de la MP soient inconnues, de nombreuses études ont démontré le rôle important du stress oxydatif dans la dégénérescence des neurones dopaminergiques. D’ailleurs, un niveau élevé de radicaux libres est observé dans le cerveau de patients post-mortem. Ces observations suggèrent que les protéines qui jouent un rôle dans la protection des neurones contre les effets du stress oxydatif peuvent représenter des cibles thérapeutiques intéressantes. En effet, pour maintenir l'équilibre d'oxydo-réduction, les cellules recrutent plusieurs enzymes réductrices dont des membres de la famille des sélénoprotéines. Des résultats obtenus dans notre laboratoire ont montré que la sélénoprotéine T (SelT), une nouvelle sélénoprotéine identifiée dans les cellules nerveuses dans notre laboratoire, est fortement exprimée dans les conditions de dégénérescence des neurones suite à un stress oxydant, et exerce un rôle neuroprotecteur. Ce rôle est assuré par son site actif contenant une cystéine et une sélénocystéine. Le but de ce travail de thèse était de valider l’utilisation d’un peptide nommé PSELT contenant le coeur actif de la SelT en tant que traitement neuroprotecteur dans la MP. Le traitement des cellules de neuroblastome SH-SY5Ypar le peptide PSELT réduit significativement les niveaux des radicaux libres et stimule la survie cellulaire en inhibant l’apoptose. Le PSELT semble traverser la membrane plasmique pour exercer son effet. In vivo, l’administration intranasale du PSELT protège les neurones et les fibres dopaminergiques dans un modèle de la MP chez la souris traitée par le 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP). Le peptide PSELT augmente le taux de la tyrosine hydroxylase et inhibe l’apoptose, ce qui aboutit à une amélioration des troubles moteurs induits par le MPTP chez les animaux. L’ensemble de ces résultats montrent pour la première fois qu’un peptide issu de la SELT, le PSELT, est capable de protéger les neurones dopaminergiquesin vitro et in vivo et d’améliorer l’activité motrice des animaux modèles de la MP, ouvrant la voie au développement d’une nouvelle thérapie de neuroprotection pour la MP. / Résumé en anglais non fourni