Thesis (Ph.D. in Neuroscience) -- University of Colorado Denver, 2008. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 145-165). Free to UCD affiliates. Online version available via ProQuest Digital Dissertations;

L’action du système nerveux périphérique sympathique sur le métabolisme osseux, via la sécrétion de neurotransmetteurs, comme le VIP, est clairement établie. Réciproquement, les cellules osseuses expriment des molécules possédant des propriétés chémo-attractives (NGF) ou répulsives (Sémaphorine 3a) suggérant que l’os est capable de contrôler sa propre innervation. Afin de mieux comprendre les relations entre système nerveux et cellules osseuses, notre travail s’est déroulé en deux étapes.Dans un premier temps, nous avons montré que la sympathectomie chimique à la guanéthidine monosulfatée, au niveau du périoste mandibulaire, modulait le ratio OPG/RANKL par l’intermédiaire de la voie cholinergique du système nerveux sympathique. Le traitement par du VIP des rats sympathectomisés a permis de rétablir le potentiel résorbant du système sympathique et ainsi confirmé le rôle prépondérant du VIP dans la modulation du métabolisme osseux au niveau du périoste mandibulaire. Dans un deuxième temps, nous avons évalué les variations d’expression du NGF et de la Séma3a, en fonction de la disponibilité locale en VIP. La sympathectomie, dans le compartiment ostéogène du périoste mandibulaire, a épuisé les réserves en proNGF et en Sema 3a et provoqué une migration de fibres sensorielles immunoréactives au CGRP où physiologiquement elles sont absentes. Dans compartiment non-ostéogène, la sympathectomie a induit une dégranulation des mastocytes et la libération de βNGF (forme mature) et le développement de fibres CGRP-IR.. Le traitement par le VIP10-28, un antagoniste des récepteurs du VIP, a provoqué des effets similaires à la sympathectomie. In vitro, le VIP n’a pas modifié l’expression relative des ARNm codant pour le NGF et la Séma 3a, augmenté celle de RANKL et diminué celle d’OPG. Le VIP10-28 a permis d’augmenter l’expression d’OPG, et de diminuer celle de Séma3a et de CGRP. L’ensemble de ce travail a permis de montrer que le système sympathique cholinergique, via le VIP, module à la fois le rapport OPG/RANKL et l’expression de NGF et de Sema3a au niveau des ostéoblastes et du périoste mandibulaire et renforce l’hypothèse d’une communication bidirectionnelle entre les cellules nerveuses et osseuses. / The action of the sympathetic nervous system on bone metabolism, via the secretion of neurotransmitters such as VIP, is clearly established. Conversely, bone cells express molecules with chemo-attractive properties (NGF) or -repulsive (Semaphorin3a), suggesting that bone can control its own innervation. To better understand the relationship between the nervous system and the bone cells, our work takes place in two stages. As a first step, we have shown that chemical monosulfate guanethidine sympathectomy, modulates in the mandible periosteum the OPG/RANKL ratio through the cholinergic nervous system. VIP treatment of sympathectomized rats restored to controls the resorption potential of the sympathetic system and thus confirmed the leading role of VIP in the modulation of bone metabolism in this bone envelope. In a second step, we evaluated, the variations in NGF and Sema3a expressions, according to the local availability in VIP. Sympathectomy, exhausted proNGF and Sema 3a stores in the osteogenic compartment of the periosteum and caused its invasion by CGRP immunoreactive sensory fibers, where they are physiologically absent. In the non-osteogenic compartment, sympathectomy induced mast cell degranulation and release of βNGF (the mature form) and sprouting of CGRP-IR fibers Treatment with VIP10-28, a VIP receptors antagonist, had effects similar to sympathectomy. In vitro, VIP did not alter the relative expression of mRNA encoding NGF and Sema 3a, increased RANKL and decreased OPG mRNAs. VIP10-28 increased OPG mRNA expression and decreased that of Sema3a and CGRP.In conclusion, this work showed that the cholinergic sympathetic system, via VIP, modulates the OPG/RANKL ratio and NGF and Sema3a expression in periosteal osteoblasts and strengthens the hypothesis of a bi-directional communication between nerve and bone cells.

Edema or tissue swelling is exacerbated during inflammation due to increased leukocyte infiltration and vascular permeability, after which resolution returns the tissue to homeostasis. In acute inflammatory reactions, upregulated levels of vascular endothelial growth factor (VEGF) is shown to increase vascular permeability. Vascular endothelial cells (EC) form a selective barrier regulating the degree of microvascular exchange and permeability in normal physiological and pathological settings. Vascular EC express pro-permeability VEGF receptors and neuropilin co-receptors that can mediate both stimulatory and inhibitory signals. Secreted class 3 semaphorin-3F (SEMA3F) is a high affinity ligand for the NRP2 receptor and has been shown to be anti-angiogenic through its ability to inhibit cell migration and attachment. Importantly, SEMA3F has been shown to compete for binding with VEGF to the NRP2 receptor. However, the role, if any, of SEMA3F in inflammation has yet to be fully elucidated. We hypothesize that SEMA3F reduces edema by inhibiting vascular permeability thereby promoting a quickened resolution of inflammation. To generate inflammatory lesions, delayed-type hypersensitivity cutaneous reactions were induced on the ear skin of C57BL/6 mice through topical applications of oxazolone. Total ear thickness as a readout of tissue swelling was compared to baseline (Day 0). To determine the effects of depleting SEMA3F during inflammation, ear thickness was measured after SEMA3F antibody or control IgG intraperitoneal injection into Nrp2+/- mice. To assess the effects of increased systemic SEMA3F on edema, ear thickness was measured after intravenous delivery of SEMA3F adenovirus (Ad-3F) or control adenovirus into wild-type mice. We report that SEMA3F depletion via SEMA3F antibodies led to significantly prolonged edema compared to controls. Ad-3F treated mice exhibit lower levels of inflammatory edema compared to control. We demonstrate that the SEMA3F signaling cascade is a key mediator of fluid homeostasis in inflammation. Likely, SEMA3F serves as an anti-inflammatory mechanism preventing excessive edema. / 2020-02-20T00:00:00Z

Le diabète, caractérisé notamment par une atteinte neuro-vasculaire, représente aujourd’hui un réel problème de santé publique. Cependant plus de 30% des patients, ne peuvent bénéficier des traitements actuels (chirurgie et pharmacothérapie) d’où, la nécessité de développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes. L’objectif de ce travail a été de caractériser un modèle murin de neuro-angiopathie diabétique, représentatif de la pathologie humaine puis, d’évaluer les effets des molécules guidance neuronale dans la récupération de la fonction neuro-vasculaire. Dans un premier temps, nous avons mis en place un modèle et des techniques exploratoires de l’étude de la fonction neuro-vasculaire chez les souris diabétiques. Nous avons observé que suite à l’ischémie du membre inférieur, la revascularisation est altérée chez les animaux diabétiques par comparaison aux animaux non-diabétiques. A ce défaut de la fonction vasculaire, s’ajoute également un défaut de la fonction nerveuse. En effet, les paramètres électrophysiologiques, le flux sanguin nerveux, le nombre de capillaires dans le nerf sciatique et la régénération nerveuse sont fortement impactés chez les animaux diabétiques. Afin de palier au défaut de revascularisation et/ou de régénération nerveuse, nous avons proposé que le ciblage thérapeutique des molécules de guidance neuronale, éphrine-B2 et Sémaphorine-3A (Séma-3A) améliorerait la fonction neuro-vasculaire. Après ischémie, les cellules mononuclées du sang périphérique (CM-SP) provenant de patients diabétiques ou de sujets contrôles, traitées préalablement avec l’éphrine-B2/Fc, ont été ensuite injectées aux animaux diabétiques. Une nette amélioration de la revascularisation a été observée dans les groupes d’animaux traités avec l’éphrine-B2/Fc par rapport aux animaux non-traités ou traités avec des CM-SP non stimulées. Enfin, nous avons administré un inhibiteur de Séma-3A, SM-345431 (Vinaxanthone) à des animaux contrôles et diabétiques après ischémie du membre inférieur. Ce qui nous a permis de montrer que cette inhibition améliore significativement la revascularisation et régule notamment la voie de signalisation des MAPK, Erk1/2 et p38 ainsi que, les niveaux de VEGF et de TGF-β1. Dans l’ensemble, l’effet sur la fonction nerveuse périphérique n’a pas montré de différences majeures entre les groupes traités et non-traités. En somme, nos travaux ont permis de montrer que la thérapie cellulaire utilisant les CM-SP stimulées avec l’éphrine-B2/Fc, ou bien l’injection intramusculaire d’un inhibiteur de Séma-3A, à visée pro-angiogénique et/ou pro-neurorégénérative, apparaît comme une stratégie prometteuse et susceptible d’améliorer la qualité de vie des malades atteints de diabète. / Diabetes, characterized by neuro-vascular damages, is a real public health problem. More than 30% of diabetic patients can benefit from existing therapies (surgery and drug therapy), therefore, the need to develop new innovative therapeutic approaches. The objective of this work was to characterize a diabetic neuro-angiopathy mouse model, reproducible of human pathology and to assess the effects of neuronal guidance molecules in recovery of the neuro-vascular function. Firstly, we characterized a model and exploratory techniques to study the neuro-vascular functions in diabetic mice. After hindlimb ischemia induction, we observed that revascularization were impaired in diabetic animals compared to non diabetic animals. This alteration is associated of the nerve function defect. Indeed, the electrophysiological parameters, nerve blood flow, the number of capillaries in sciatic nerve and nerve regeneration are strongly affected in diabetic animals. Then, to rescue the revascularization or nerve regeneration, we proposed that the therapeutic targeting of molecules of neuronal guidance, ephrin-B2 and Semaphorin-3A (Sema-3A) would improve neuro-vascular functions. After ischemia induction, peripheral mononuclear blood mononuclear cells (PBMNC) from diabetic patients or subjects controls, pre-treated with ephrin-B2/Fc, were then injected in diabetic animals. A significant improvement of revascularization was observed in both groups, animals treated with ephrin-B2/Fc compared to untreated animals or treaties with PBMNC unstimulated. Finally, after hindlimb ischemia, we administrated a pharmacological inhibitor of Sema-3A, the SM-345431 (Vinaxanthone) in diabetic and control animals. We showed this selective inhibition significantly improved the post-ischemic revascularization, regulates the MAPK Erk1/2 and p38 signaling pathway, increased the levels of CXCL12, VEGF and TGF-β1. In our experiment conditions, we did not observe the significant effects of SM-345431 on peripheral nerve function between treated and untreated animal groups. Finally, our work showed that cell therapy using PBMNC stimulated with ephrin-B2/Fc, or the intramuscular injection of Sema-3A inhibitor referred to pro-angiogenic and/or pro-neuroregenerative, appears as a strategy promising and likely to improve the quality of life of diabetic patients.

Le diabète, caractérisé notamment par une atteinte neuro-vasculaire, représente aujourd’hui un réel problème de santé publique. Cependant plus de 30% des patients, ne peuvent bénéficier des traitements actuels (chirurgie et pharmacothérapie) d’où, la nécessité de développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes. L’objectif de ce travail a été de caractériser un modèle murin de neuro-angiopathie diabétique, représentatif de la pathologie humaine puis, d’évaluer les effets des molécules guidance neuronale dans la récupération de la fonction neuro-vasculaire. Dans un premier temps, nous avons mis en place un modèle et des techniques exploratoires de l’étude de la fonction neuro-vasculaire chez les souris diabétiques. Nous avons observé que suite à l’ischémie du membre inférieur, la revascularisation est altérée chez les animaux diabétiques par comparaison aux animaux non-diabétiques. A ce défaut de la fonction vasculaire, s’ajoute également un défaut de la fonction nerveuse. En effet, les paramètres électrophysiologiques, le flux sanguin nerveux, le nombre de capillaires dans le nerf sciatique et la régénération nerveuse sont fortement impactés chez les animaux diabétiques. Afin de palier au défaut de revascularisation et/ou de régénération nerveuse, nous avons proposé que le ciblage thérapeutique des molécules de guidance neuronale, éphrine-B2 et Sémaphorine-3A (Séma-3A) améliorerait la fonction neuro-vasculaire. Après ischémie, les cellules mononuclées du sang périphérique (CM-SP) provenant de patients diabétiques ou de sujets contrôles, traitées préalablement avec l’éphrine-B2/Fc, ont été ensuite injectées aux animaux diabétiques. Une nette amélioration de la revascularisation a été observée dans les groupes d’animaux traités avec l’éphrine-B2/Fc par rapport aux animaux non-traités ou traités avec des CM-SP non stimulées. Enfin, nous avons administré un inhibiteur de Séma-3A, SM-345431 (Vinaxanthone) à des animaux contrôles et diabétiques après ischémie du membre inférieur. Ce qui nous a permis de montrer que cette inhibition améliore significativement la revascularisation et régule notamment la voie de signalisation des MAPK, Erk1/2 et p38 ainsi que, les niveaux de VEGF et de TGF-β1. Dans l’ensemble, l’effet sur la fonction nerveuse périphérique n’a pas montré de différences majeures entre les groupes traités et non-traités. En somme, nos travaux ont permis de montrer que la thérapie cellulaire utilisant les CM-SP stimulées avec l’éphrine-B2/Fc, ou bien l’injection intramusculaire d’un inhibiteur de Séma-3A, à visée pro-angiogénique et/ou pro-neurorégénérative, apparaît comme une stratégie prometteuse et susceptible d’améliorer la qualité de vie des malades atteints de diabète. / Diabetes, characterized by neuro-vascular damages, is a real public health problem. More than 30% of diabetic patients can benefit from existing therapies (surgery and drug therapy), therefore, the need to develop new innovative therapeutic approaches. The objective of this work was to characterize a diabetic neuro-angiopathy mouse model, reproducible of human pathology and to assess the effects of neuronal guidance molecules in recovery of the neuro-vascular function. Firstly, we characterized a model and exploratory techniques to study the neuro-vascular functions in diabetic mice. After hindlimb ischemia induction, we observed that revascularization were impaired in diabetic animals compared to non diabetic animals. This alteration is associated of the nerve function defect. Indeed, the electrophysiological parameters, nerve blood flow, the number of capillaries in sciatic nerve and nerve regeneration are strongly affected in diabetic animals. Then, to rescue the revascularization or nerve regeneration, we proposed that the therapeutic targeting of molecules of neuronal guidance, ephrin-B2 and Semaphorin-3A (Sema-3A) would improve neuro-vascular functions. After ischemia induction, peripheral mononuclear blood mononuclear cells (PBMNC) from diabetic patients or subjects controls, pre-treated with ephrin-B2/Fc, were then injected in diabetic animals. A significant improvement of revascularization was observed in both groups, animals treated with ephrin-B2/Fc compared to untreated animals or treaties with PBMNC unstimulated. Finally, after hindlimb ischemia, we administrated a pharmacological inhibitor of Sema-3A, the SM-345431 (Vinaxanthone) in diabetic and control animals. We showed this selective inhibition significantly improved the post-ischemic revascularization, regulates the MAPK Erk1/2 and p38 signaling pathway, increased the levels of CXCL12, VEGF and TGF-β1. In our experiment conditions, we did not observe the significant effects of SM-345431 on peripheral nerve function between treated and untreated animal groups. Finally, our work showed that cell therapy using PBMNC stimulated with ephrin-B2/Fc, or the intramuscular injection of Sema-3A inhibitor referred to pro-angiogenic and/or pro-neuroregenerative, appears as a strategy promising and likely to improve the quality of life of diabetic patients.

Le diabète, caractérisé notamment par une atteinte neuro-vasculaire, représente aujourd’hui un réel problème de santé publique. Cependant plus de 30% des patients, ne peuvent bénéficier des traitements actuels (chirurgie et pharmacothérapie) d’où, la nécessité de développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes. L’objectif de ce travail a été de caractériser un modèle murin de neuro-angiopathie diabétique, représentatif de la pathologie humaine puis, d’évaluer les effets des molécules guidance neuronale dans la récupération de la fonction neuro-vasculaire. Dans un premier temps, nous avons mis en place un modèle et des techniques exploratoires de l’étude de la fonction neuro-vasculaire chez les souris diabétiques. Nous avons observé que suite à l’ischémie du membre inférieur, la revascularisation est altérée chez les animaux diabétiques par comparaison aux animaux non-diabétiques. A ce défaut de la fonction vasculaire, s’ajoute également un défaut de la fonction nerveuse. En effet, les paramètres électrophysiologiques, le flux sanguin nerveux, le nombre de capillaires dans le nerf sciatique et la régénération nerveuse sont fortement impactés chez les animaux diabétiques. Afin de palier au défaut de revascularisation et/ou de régénération nerveuse, nous avons proposé que le ciblage thérapeutique des molécules de guidance neuronale, éphrine-B2 et Sémaphorine-3A (Séma-3A) améliorerait la fonction neuro-vasculaire. Après ischémie, les cellules mononuclées du sang périphérique (CM-SP) provenant de patients diabétiques ou de sujets contrôles, traitées préalablement avec l’éphrine-B2/Fc, ont été ensuite injectées aux animaux diabétiques. Une nette amélioration de la revascularisation a été observée dans les groupes d’animaux traités avec l’éphrine-B2/Fc par rapport aux animaux non-traités ou traités avec des CM-SP non stimulées. Enfin, nous avons administré un inhibiteur de Séma-3A, SM-345431 (Vinaxanthone) à des animaux contrôles et diabétiques après ischémie du membre inférieur. Ce qui nous a permis de montrer que cette inhibition améliore significativement la revascularisation et régule notamment la voie de signalisation des MAPK, Erk1/2 et p38 ainsi que, les niveaux de VEGF et de TGF-β1. Dans l’ensemble, l’effet sur la fonction nerveuse périphérique n’a pas montré de différences majeures entre les groupes traités et non-traités. En somme, nos travaux ont permis de montrer que la thérapie cellulaire utilisant les CM-SP stimulées avec l’éphrine-B2/Fc, ou bien l’injection intramusculaire d’un inhibiteur de Séma-3A, à visée pro-angiogénique et/ou pro-neurorégénérative, apparaît comme une stratégie prometteuse et susceptible d’améliorer la qualité de vie des malades atteints de diabète. / Diabetes, characterized by neuro-vascular damages, is a real public health problem. More than 30% of diabetic patients can benefit from existing therapies (surgery and drug therapy), therefore, the need to develop new innovative therapeutic approaches. The objective of this work was to characterize a diabetic neuro-angiopathy mouse model, reproducible of human pathology and to assess the effects of neuronal guidance molecules in recovery of the neuro-vascular function. Firstly, we characterized a model and exploratory techniques to study the neuro-vascular functions in diabetic mice. After hindlimb ischemia induction, we observed that revascularization were impaired in diabetic animals compared to non diabetic animals. This alteration is associated of the nerve function defect. Indeed, the electrophysiological parameters, nerve blood flow, the number of capillaries in sciatic nerve and nerve regeneration are strongly affected in diabetic animals. Then, to rescue the revascularization or nerve regeneration, we proposed that the therapeutic targeting of molecules of neuronal guidance, ephrin-B2 and Semaphorin-3A (Sema-3A) would improve neuro-vascular functions. After ischemia induction, peripheral mononuclear blood mononuclear cells (PBMNC) from diabetic patients or subjects controls, pre-treated with ephrin-B2/Fc, were then injected in diabetic animals. A significant improvement of revascularization was observed in both groups, animals treated with ephrin-B2/Fc compared to untreated animals or treaties with PBMNC unstimulated. Finally, after hindlimb ischemia, we administrated a pharmacological inhibitor of Sema-3A, the SM-345431 (Vinaxanthone) in diabetic and control animals. We showed this selective inhibition significantly improved the post-ischemic revascularization, regulates the MAPK Erk1/2 and p38 signaling pathway, increased the levels of CXCL12, VEGF and TGF-β1. In our experiment conditions, we did not observe the significant effects of SM-345431 on peripheral nerve function between treated and untreated animal groups. Finally, our work showed that cell therapy using PBMNC stimulated with ephrin-B2/Fc, or the intramuscular injection of Sema-3A inhibitor referred to pro-angiogenic and/or pro-neuroregenerative, appears as a strategy promising and likely to improve the quality of life of diabetic patients.

Les réseaux périneuronaux (PNN) sont des régulateurs clé de la plasticité et de la régénération des neurones au niveau du système nerveux central chez l’adulte. Le PNN est une matrice extracellulaire hautement organisée, qui entoure des populations spécifiques de neurones, enrichie en protéoglycanes à chondroïtine sulfate (CSPG). La chondroïtine sulfate (CS) est un polysaccharide linéaire, appartenant à la famille des glycosaminoglycanes (GAG), qui peut être sulfaté à différentes positions et donner lieu à plusieurs isoformes. Ces isoformes interagissent de manière spécifique avec de nombreuses molécules de signalisation dont la semaphorine 3A (Sema3A). Sema3A est une protéine secrétée, qui interagit avec les CS et s’accumule ainsi dans les PNN. Elle est impliquée dans la guidance des neurones sur lesquels elle agit par chemorepulsion. Les aspects structuraux et fonctionnels de l’ interaction entre Sema3A et CS sont encore mal connus, mais celle-ci pourrait être requise pour renforcer la liaison de la Sema3A avec ses récepteurs et déclencher une voie de signalisation qui aboutit à l’inhibition de la plasticité synaptique. Le but du projet est donc de caractériser biochimiquement l’interface d’interaction Sema3A-CS. Il a pour perspective d’élaborer des molécules interférant avec cette interaction qui pourraient permettre une amélioration de la plasticité neuronale après une maladie neurodégénérative ou une lésion de la moelle épinière.Pour ce faire, la Sema3A est exprimée dans un système hétérologue de cellules eucaryotes pour être purifiée. Deux formes ont été purifiées: une forme complète de 90 kDa qui reste accrochée à la surface cellulaire et une forme clivée de 65 kDa secrétée dans le milieu de culture. La Sema3A-90 interagit d’une manière sélective et avec une très haute affinité avec la CS-E (chondroitine disulfatée en position 4 et 6) et l’héparane sulfate,alors que, la forme clivée n’interagit avec aucun GAG, comme observé par résonance plasmonique de surface (SPR). Quatre sites, situés dans le domaine C-terminal de la protéine, susceptibles d’interagir avec les GAG ont été identifiés et analysés par mutagenèse. Deux d’entre eux sont impliqués dans la reconnaissance des GAG et sont nécessaires à la Sema3A pour inhiber la croissance de neurites sur des cultures de neurones issus de ganglion de la racine dorsale de rats. En parallèle, nos travaux montrent qu’un tetrasaccharide de CS-E est la taille minimale requise pour l’interaction avec la Sema 3A. Enfin, des analyses réalisées en utilisant une microbalance à cristal de quartz avec dissipation ont montré que la Sema3A pourrait réticuler les chaines de GAGs, participant ainsi à la stabilisation du réseau périneuronal. / Perineuronal nets (PNNs) are the key regulators of neuronal plasticity and regeneration in the mature central nervous system (CNS). They are a unique and highly organised extracellular matrix (ECM) structure, found around sub-population of neurons, composed mainly of chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG). Chondroitin sulfate (CS) is a linear polysaccharide belonging to glycosaminoglycans (GAGs) family. The sulphation pattern defines different types of CS, which interact with different signalling proteins including those regulating axonal outgrowth and guidance such as semaphorin 3A (Sema3A). Sema3A is a secreted chemorepulsive protein found accumulated in the PNNs through its interaction with CS. This process is believed to potentiate Sema3A signalling through plexin A1 (PlxnA1) and Neuropilin 1 (Nrp1) and regulate plasticity and regeneration. The aim of the thesis project is to characterise the interface of Sema3A- CS interaction.For this purpose, Sema3A is expressed in eukaryote cells and purified. Interestingly, two major forms were obtained: a full length Sema3A (90 kDa) which remains attached to the cell surface GAGs and a truncated form without the C-ter part (65 kDa) which is released to the culture medium. With the use of surface plasmon resonance (SPR), we observed that full length Sema3A binds selectively to CS-E (4,6-disulfated chondroitin) and heparan sulfate with a high affinity (KD in the sub pM range), while the truncated Sema3A does not bind to any GAG. Four putative GAG binding sequences were identified in the C-ter of Sema3A and mutated using site directed mutagenesis. SPR analysis then revealed that two out of these four sites are required for the binding to CS-E. The importance of these GAG-binding sequences in inhibition of neurites outgrowth of dorsal root ganglion neurons in culture was also reported, indicating thus the importance of GAG-binding in Sema3A signalling. In parallel, the minimal required sequence of Sema3A-binding of CS-E was determined as being a tetrasaccharide. The Sema3A-CS interface was thus characterized. Furthermore, quartz crystal microbalance with dissipation monitoring analysis suggested that Sema3A could crosslink GAG chains. This suggests Sema3A could be involved in stabilising the PNN network and induces mechanical changes on neuronal surface.The detail characterization of Sema3A-CS interaction may enable the design of new strategies aiming at enhancing plasticity and regeneration for neurodegenerative diseases or spinal cord injury.

The role that signaling molecules play during morphogenesis and their interactions is a field of intense study and the sea urchin represents a facile system to study these aspects of development in the early embryo. In many instances, the S. purpuratus genome contains relatively simple receptor-ligand signaling systems compared to vertebrate counterparts and this provides interesting opportunities to study their diversity of function during the morphogenetic events that shape the embryo. The Eph-Ephrin signaling components are an excellent example of this and they are represented by dozens of members in the vertebrate system with developmental functions that include axon guidance, cell migration and tissue segregation. In contrast, the sea urchin genome contains a single Eph receptor and a single Ephrin ligand and by interacting with different effectors of signal transduction, this simple, bipartite system can fulfill a variety of functional roles during morphogenesis. Studying the function of Eph-Ephrin signaling in the sea urchin embryo, I have revealed two distinct morphogenetic movements in which Eph-Ephrin signaling is necessary; apical constriction of ciliary band cells and pigment cell migration. In both examples, a functionally relevant Ephrin gradient establishes spatial information in the developing tissues, producing a reaction from cells expressing the Eph receptor. In the case of pigment cells, the distribution of migrating cells is affected and in the case of ciliary band cells, apical constriction occurs. The different outcomes of Eph-Ephrin signaling in these two tissues exemplifies signaling components communicating spatial information and initiating morphogenetic programs with outcomes dependent on cellular context. Furthermore, I have identified downstream components of Eph-Ephrin signaling that have necessary functions in both models, illustrating how different cellular programs can be induced by the same signaling iii iv components. My research contributes to understanding fundamental aspects of how complex 3 dimensional tissues arise from the genes and regulatory elements encoded in metazoan genomes. / Graduate

No description available.

Neuropilin (Nrp) is an essential cell surface receptor with dual functionality in the cardiovascular and nervous systems. The first identified Nrp-ligand family was the Semaphorin-3 (Sema3) family of axon repulsion molecules. Subsequently, Nrp was found to serve as a receptor for the vascular endothelial growth factor (VEGF) family of pro-angiogenic cytokines. In addition to its physiological role, VEGF signaling via Nrp directly contributes to cancer stemness, growth, and metastasis. Thus, the Nrp/VEGF signaling axis is a promising anti-cancer therapeutic target. Interestingly, it has recently been shown that Sema3 and VEGF are functionally opposed to one another, with Sema3 possessing potent endogenous anti-angiogenic activity and VEGF serving as an attractive cue for neuronal axons. We hypothesized that direct competition for an overlapping binding site within the Nrp extracellular domain may explain the observed functional competition between VEGF and Sema3. To test this hypothesis we have separately investigated the mechanisms of VEGF and Sema3 binding to Nrp. Utilizing structural biology coupled with biophysics and biochemistry we have identified both distinct and common mechanisms that facilitate the interaction between Nrp and these two ligand families. Specifically, we have identified an Nrp binding pocket to which these ligands competitively bind. The Sema3 family uniquely requires proteolytic activation in order to engage this overlapping binding site. These findings provide critical mechanistic insight into VEGF and Sema3 mediated physiology. Additionally, these data have informed the development of small molecules, peptides, and soluble receptor fragments that function as potent and selective inhibitors of VEGF/Nrp binding with exciting therapeutic potential for treating cancer.