O objetivo deste trabalho foi comparar a utilização de diluentes comerciais à base de gema de ovo de galinha com os mesmos diluentes, nos quais se substituiu a gema de galinha pela de ovo de ema (Rhea americana). Foram utilizados Seis garanhões da raça Crioula, comprovadamente férteis e no período fora da estação de monta e utilizados seis ejaculados de cada garanhão. O sêmen foi avaliado macroscopicamente quanto ao volume, aspecto e coloração, a seguir avaliou-se a motilidade progressiva e total. Posteriormente o sêmen foi dividido em quatro alíquotas e diluído na proporção 1:1 com o diluente, Equimix (Nutricell Nutrientes Celulares) para centrifugação. Para adição do diluente de congelamento foram utilizados: diluente A (FR-5, Nutricell Nutrientes Celulares) e diluente B (Botu-crio, Biotech Botucatu S.A.) adicionados de 20 % de gema de ovo de ema, ou de 20 % de gema de ovo de galinha. As amostras foram envasadas, identificadas e submetidas a congelamento conforme o protocolo. As palhetas foram descongeladas, após um período mínimo de 7 dias e examinadas para os seguintes quesitos: motilidade total e progressiva, e integridade física e funcional da membrana plasmática do espermatozoide. Os diluentes comerciais com ou sem adição de gema de ovo de ema não apresentaram diferenças em relação à motilidade total e progressiva, porém observou-se diferença nos parâmetros quando comparados os diluentes comerciais. Houve diferença na funcionalidade da membrana apenas quando comparado diluente A e B com gema de ovo de ema. No quesito integridade de membrana não foi observado diferença estatística. Estes resultados demonstram que a gema de ovo de ema (Rhea americana) pode ser uma alternativa para produção de diluentes para congelamento de sêmen de equinos. / The aim of this study was to compare the use of two commercial extenders using chicken egg yolk with the same extenders, to which ema (Rhea americana) egg yolk was added. Six Criollo breed stallions were used during the off-breeding season period. Six collections per stallion were used. The ejaculate aspect, total and progressive motility were evaluated with a microscope; concentration was determined with a Neubauer counting chamber. After evaluation, semen samples were divided in two aliquots and diluted 1:1 in each of the centrifugation extender Equimix (Nutricell Nutrientes Celulares). For freeze that semen we used two commercial extenders: A (extender with glycerol) or B (extender with methylformamide) and was added 20% rhea egg yolk or 20% chicken egg yolk . Semen samples were examined at least 1 week after freezing, for total and progressive motility, physical and functional membrane integrity (HOST test and CFDA-PI fluorescence) (Lagares et al. 1998; Harrison & Vickers, 1990). The extenders of a given brand with or without rhea egg yolk had no significant difference according to total and progressive motility, although there was difference (p = 0,05) between extenders when different brands were compared, no matter if they were added Rhea egg yolk or not. Membrane functionality showed difference only when compared Extender A and B with Rhea egg yolk. Membrane integrity had no significant difference between all the treatments. These results show that Rhea egg yolk might be an alternative to making an equine semen extender.

Nesse estudo comparou-se o efeito tamponante do HEPES e Bicarbonato de Sódio em manter o pH e a viabilidade do sêmen resfriado de pôneis da raça Brasileira. As alterações no pH ocasionadas por diferentes diluições com diluente a base de leite desnatado em pó sem tampão a 5 e a 15°C também foram medidas. No experimento 1 avaliou-se o efeito da diluição e da temperatura de resfriamento sobre a motilidade, integridade de membrana, pH e atividade mitocondrial do sêmen pré e pós resfriamento. O sêmen de nove pôneis da raça Brasileira (dois ejaculados/pônei) foi diluído em diluente a base de leite desnatado (em pó) sem tampão e refrigerado a 5 ou 15°C por 48h em três diferentes diluições (1+1, 1+2, 1+3). As três diluições não alteraram os parâmetros avaliados após a diluição a fresco. A diluição 1+1 resultou em valores maiores de pH (7,63 e 7,57, respectivamente) e menor percentual de motilidade progressiva (MP) a 5 e a 15°C. O maior percentual de células íntegras (1+1=44,16; 1+2=48,16; 1+3=50,05) foi detectado a 15°C (P < 0,01), independente da diluição. A MP foi maior nas 48h de resfriamento (39,72%; P < 0,05) quando o sêmen foi diluído a 1+3 e refrigerado a 15°C. A atividade mitocondrial (P > 0,05) em função do tempo e temperatura foi similar entre as diluições. No experimento 2 avaliou-se o efeito tampão do bicarbonato de sódio e do HEPES em diluentes sobre a viabilidade de espermatozoides resfriados a 5°C durante 48h. Os diluentes testados compunham-se de leite desnatado em pó com bicarbonato de sódio (A), HEPES (B) ou diluente sem tampão (C). O sêmen de sete pôneis da raça Brasileira (três ejaculados/pônei) foi utilizado e a motilidade progressiva foi similar entre os diluentes (P > 0,05) após a diluição. Nas 24 e 48h, a MP foi, respectivamente, para A (44,76%; 25,23%), B (51,42%; 38,09%) e C (54,05%; 41,66%). A integridade da membrana plasmática foi similar após a exposição aos três diluentes. A fresco, a atividade mitocondrial foi maior (P < 0,05) no sêmen exposto ao diluente A (A=1,05nm, B=0,81nm, C=0,79nm) e após 24h A e B foram similares (0,83nm; 0,73nm), enquanto que no diluente C observou-se menor atividade (0,64nm). Nas 48h não houve diferença (A=0,72; B=0,69; C=0,63; P > 0,05). O pH do diluente e sua osmolaridade, assim como o pH do sêmen diluído foi maior no diluente A (8; 382; 7,9), intermediário (7,5; 362; 7,32) no B e menor no C (7,16; 350; 7,07). A peroxidação lipídica e a indução da peroxidação foram similares em todos os grupos. Sugere-se que, quando da utilização do sêmen a fresco, qualquer das diluições aqui testadas pode ser utilizada com segurança. O resfriamento do sêmen por 48h modifica e eleva o pH do sêmen. Os melhores resultados foram observados com o resfriamento do sêmen a 15°C por 48h e com a diluição 1+3 em um diluente a base de leite em pó desnatado sem tampão. O bicarbonato de sódio (A) reduz a MP e aumenta o pH do sêmen. O diluente sem tampão foi considerado o mais apropriado para uso imediato na IA. Tanto o diluente com HEPES, quanto o diluente sem tampão foram adequados para o resfriamento do sêmen equino a 5°C durante 48h. / This study compared the buffering effect of HEPES and sodium bicarbonate on pH and viability of Brazilian pony semen cooled at 5°C. pH changes caused by different dilutions using skim milk powder semen extender without buffer were also measured. In experiment 1, the effect of dilution and cooling temperature on semen motility, membrane integrity, mitochondrial activity and pH pre and post cooling was investigated. Ejaculates of nine Brazilian ponies (two ejaculates per pony) were diluted, of a non buffered powder milk extender and cooled at 5°C or 15°C during 48h in three different dilutions (1+1, 1+2 and 1+3). Dilutions did not change the parameters evaluated before cooling. Samples diluted 1+1 resulted in higher pH values (7.63 and 7.57, respectively) and lowest percentage of progressive motility (PM) at 5 and 15°C. All samples cooled at 15°C showed a lower incidence of abnormal spermatozoa (1+1 = 55.84%; 1+2 = 51.84%; 1+3 = 49.95%) (P < 0.01) independent of dilution. Progressive motility was higher when semen was cooled during 48h in 1+3 dilution at 15°C (39.72%; P < 0.05). Mitochondrial activity despite of time and temperature was similar (P > 0.05) among dilutions. In experiment 2, the buffer effect of sodium bicarbonate and HEPES on extenders were evaluated considering the maintenance of sperm viability after cooling at 5°C during 24 and 48h. A non-buffered milk powder extender (C = control) and the same extender buffered with Sodium Bicarbonate (A) and HEPES (B) was used. Semen from 7 Brazilian ponies (three ejaculates / pony) was used. Immediately after dilution sperm motility was evaluated and progressive motility was similar with all extenders (P > 0.05). At 24 and 48h after cooling at 5oC sperm motility was evaluated, respectively, on groups A (44.76%; 25.23%), B (51.42%; 38.09%) and C (54.05%; 41.66%). Plasma membrane integrity was similar after exposure to the three extenders. Before cooling, mitochondrial activity was higher (P <0.05) in extender A (A = 1.05nm, B = 0.81nm, C = 0.79nm). Mitochondrial activity after cooling for 24h was 0.83nm (A), 0.73nm (B) and 0.64nm (C). After 48h it decreased to 0.72nm (A), 0.69nm (B) and 0.63nm (C) (P > 0.05), respectively. The extenders pH, osmolarity and pH of diluted semen was higher in A (8; 382; 7.9), intermediate in B (7.5; 362; 7.32) and lower in C (7.16; 350; 7.07). Lipid peroxidation and its induction were similar in all groups. It was concluded that all dilution grades in fresh semen were adequate and that pH was affected and increased when semen was extended and cooled for 48h. The best results were observed when semen was diluted at 1+3 and cooled at 15°C for 48h in a non buffered powder milk extender. Sodium bicarbonate (A) reduces progressive motility and increases semen pH. The non buffered (C) semen extender was considered more appropriated for semen dilution for immediate use in artificial insemination. The non buffered and HEPES buffered semen extenders were considered appropriated for cooling equine semen at 5°C during 48h.

Dois experimentos foram conduzidos para verificar a viabilidade do uso do leite UHT como diluente para sêmen equino refrigerado. O objetivo principal deste estudo foi avaliar o uso de leite UHT nas apresentações desnatado, semidesnatado e integral como diluente de sêmen e posteriormente foi avaliada a viabilidade espermática com o uso de leite como diluente comparado a outros dois diluentes industrializados. No experimento I foram utilizados 31 ejaculados de 3 garanhões, as amostras de cada ejaculado foram diluídas em leite UHT nas apresentações integral, semidesnatado e desnatado, numa proporção de 3:1 (3 ml de diluente e 1ml de sêmen). Foram realizadas análises de viabilidade espermática com testes de motilidade espermática, vigor espermático, integridade de membrana (CFDA/PI) e funcionalidade de membrana espermática (HOST) pós-diluição, os quais foram repetidos nas amostras refrigeradas a 4ºC após 24 e 48h. Neste experimento, não foram observadas diferenças significativas entre os 3 diluentes, quanto a motilidade espermática, vigor, CFDA/PI e HOST. No entanto, houve uma diminuição na qualidade do sêmen armazenado por 48h (P < 0,01), sendo mais acentuada entre 24 e 48h de refrigeração. No experimento II foram utilizados 30 ejaculados de 3 garanhões onde, logo após a coleta do sêmen, as amostras de cada ejaculado foram diluídas com leite UHT desnatado (LD), Botusemen® (BS) e Botusemen Special® (BSP). As amostras foram examinadas a fresco, após a diluição (0h) e em resfriamento de 24h e 48h a 4°C. Foram realizados os mesmos testes de análise espermática do primeiro experimento para avaliação comparativa dos diluentes. As amostras de sêmen refrigeradas com BSP obtiveram maior porcentagem de motilidade total (51,1%) após 24h de refrigeração quando comparado aos outros dois diluentes testados, LD (45,8%) e BS (47,3%). Com base nos resultados obtidos nos dois experimentos, o leite UHT, independente da apresentação, pode ser utilizado como diluente de sêmen para as primeiras 24h de refrigeração, mantendo a viabilidade espermática adequada, sendo também de fácil acesso e manuseio. Se for necessário a manutenção do sêmen por mais de 24h, o BSP se mostrou superior em manter a qualidade do sêmen até 48h. / Two experiments were conducted to verify the feasibility of the use of UHT milk as an extender for chilled equine semen. The main objective of this study was to evaluate the use of UHT milk in skimmed, semi-skimmed and whole milk as extender for semen and subsequently assess sperm viability using milk as a diluent compared to two other industrial extenders. In the first experiment were used 31 ejaculates from 3 stallions of known fertility, samples of each ejaculate were diluted in the whole UHT milk, semi-skimmed milk and skim milk shows a ratio of 3:1 (3ml diluent and 1ml of semen). Sperm viability analyzes were performed, including sperm motility, sperm vigor, membrane integrity (CFDA/PI) functionality and sperm membrane (HOST) post-dilution tests which were repeated in the samples cooled to 4°C after 24 and 48h. In this experiment, no significant differences in sperm motility, vigor, CFDA/IP and HOST were observed among the 3 extenders. However, there was a decrease in the quality of semen stored for 48h (P < 0.01), being more pronounced between 24 and 48h of cooling. In the second experiment, 30 ejaculates from 3 stallions were used soon after collection of semen samples, each ejaculate was diluted with UHT skim milk (LD), Botusemen® (BS) and Botusemen Special® (BSP). The samples were analyzed fresh, immediately after the dilution (0h) and after cooling for 24h and 48h at 4°C. The same tests of sperm analysis used in the first experiment for comparative evaluation of extenders were performed. Semen samples cooled with BSP obtained the highest percentage of total motility (51.1%) after 24h of cooling when compared to the two other extenders tested, LD (45.8%) and BS (47.3%). Based on the results from the two experiments, UHT milk, regardless of the presentation, can be used as a diluent of semen during the first 24h of cooling maintaining adequate sperm viability and is easy to access and handle. If maintenance of semen for more than 24h is required, the BSP was superior in maintaining the quality of semen until 48h.

O objetivo deste trabalho foi comparar a utilização de diluentes comerciais à base de gema de ovo de galinha com os mesmos diluentes, nos quais se substituiu a gema de galinha pela de ovo de ema (Rhea americana). Foram utilizados Seis garanhões da raça Crioula, comprovadamente férteis e no período fora da estação de monta e utilizados seis ejaculados de cada garanhão. O sêmen foi avaliado macroscopicamente quanto ao volume, aspecto e coloração, a seguir avaliou-se a motilidade progressiva e total. Posteriormente o sêmen foi dividido em quatro alíquotas e diluído na proporção 1:1 com o diluente, Equimix (Nutricell Nutrientes Celulares) para centrifugação. Para adição do diluente de congelamento foram utilizados: diluente A (FR-5, Nutricell Nutrientes Celulares) e diluente B (Botu-crio, Biotech Botucatu S.A.) adicionados de 20 % de gema de ovo de ema, ou de 20 % de gema de ovo de galinha. As amostras foram envasadas, identificadas e submetidas a congelamento conforme o protocolo. As palhetas foram descongeladas, após um período mínimo de 7 dias e examinadas para os seguintes quesitos: motilidade total e progressiva, e integridade física e funcional da membrana plasmática do espermatozoide. Os diluentes comerciais com ou sem adição de gema de ovo de ema não apresentaram diferenças em relação à motilidade total e progressiva, porém observou-se diferença nos parâmetros quando comparados os diluentes comerciais. Houve diferença na funcionalidade da membrana apenas quando comparado diluente A e B com gema de ovo de ema. No quesito integridade de membrana não foi observado diferença estatística. Estes resultados demonstram que a gema de ovo de ema (Rhea americana) pode ser uma alternativa para produção de diluentes para congelamento de sêmen de equinos. / The aim of this study was to compare the use of two commercial extenders using chicken egg yolk with the same extenders, to which ema (Rhea americana) egg yolk was added. Six Criollo breed stallions were used during the off-breeding season period. Six collections per stallion were used. The ejaculate aspect, total and progressive motility were evaluated with a microscope; concentration was determined with a Neubauer counting chamber. After evaluation, semen samples were divided in two aliquots and diluted 1:1 in each of the centrifugation extender Equimix (Nutricell Nutrientes Celulares). For freeze that semen we used two commercial extenders: A (extender with glycerol) or B (extender with methylformamide) and was added 20% rhea egg yolk or 20% chicken egg yolk . Semen samples were examined at least 1 week after freezing, for total and progressive motility, physical and functional membrane integrity (HOST test and CFDA-PI fluorescence) (Lagares et al. 1998; Harrison & Vickers, 1990). The extenders of a given brand with or without rhea egg yolk had no significant difference according to total and progressive motility, although there was difference (p = 0,05) between extenders when different brands were compared, no matter if they were added Rhea egg yolk or not. Membrane functionality showed difference only when compared Extender A and B with Rhea egg yolk. Membrane integrity had no significant difference between all the treatments. These results show that Rhea egg yolk might be an alternative to making an equine semen extender.

Nesse estudo comparou-se o efeito tamponante do HEPES e Bicarbonato de Sódio em manter o pH e a viabilidade do sêmen resfriado de pôneis da raça Brasileira. As alterações no pH ocasionadas por diferentes diluições com diluente a base de leite desnatado em pó sem tampão a 5 e a 15°C também foram medidas. No experimento 1 avaliou-se o efeito da diluição e da temperatura de resfriamento sobre a motilidade, integridade de membrana, pH e atividade mitocondrial do sêmen pré e pós resfriamento. O sêmen de nove pôneis da raça Brasileira (dois ejaculados/pônei) foi diluído em diluente a base de leite desnatado (em pó) sem tampão e refrigerado a 5 ou 15°C por 48h em três diferentes diluições (1+1, 1+2, 1+3). As três diluições não alteraram os parâmetros avaliados após a diluição a fresco. A diluição 1+1 resultou em valores maiores de pH (7,63 e 7,57, respectivamente) e menor percentual de motilidade progressiva (MP) a 5 e a 15°C. O maior percentual de células íntegras (1+1=44,16; 1+2=48,16; 1+3=50,05) foi detectado a 15°C (P < 0,01), independente da diluição. A MP foi maior nas 48h de resfriamento (39,72%; P < 0,05) quando o sêmen foi diluído a 1+3 e refrigerado a 15°C. A atividade mitocondrial (P > 0,05) em função do tempo e temperatura foi similar entre as diluições. No experimento 2 avaliou-se o efeito tampão do bicarbonato de sódio e do HEPES em diluentes sobre a viabilidade de espermatozoides resfriados a 5°C durante 48h. Os diluentes testados compunham-se de leite desnatado em pó com bicarbonato de sódio (A), HEPES (B) ou diluente sem tampão (C). O sêmen de sete pôneis da raça Brasileira (três ejaculados/pônei) foi utilizado e a motilidade progressiva foi similar entre os diluentes (P > 0,05) após a diluição. Nas 24 e 48h, a MP foi, respectivamente, para A (44,76%; 25,23%), B (51,42%; 38,09%) e C (54,05%; 41,66%). A integridade da membrana plasmática foi similar após a exposição aos três diluentes. A fresco, a atividade mitocondrial foi maior (P < 0,05) no sêmen exposto ao diluente A (A=1,05nm, B=0,81nm, C=0,79nm) e após 24h A e B foram similares (0,83nm; 0,73nm), enquanto que no diluente C observou-se menor atividade (0,64nm). Nas 48h não houve diferença (A=0,72; B=0,69; C=0,63; P > 0,05). O pH do diluente e sua osmolaridade, assim como o pH do sêmen diluído foi maior no diluente A (8; 382; 7,9), intermediário (7,5; 362; 7,32) no B e menor no C (7,16; 350; 7,07). A peroxidação lipídica e a indução da peroxidação foram similares em todos os grupos. Sugere-se que, quando da utilização do sêmen a fresco, qualquer das diluições aqui testadas pode ser utilizada com segurança. O resfriamento do sêmen por 48h modifica e eleva o pH do sêmen. Os melhores resultados foram observados com o resfriamento do sêmen a 15°C por 48h e com a diluição 1+3 em um diluente a base de leite em pó desnatado sem tampão. O bicarbonato de sódio (A) reduz a MP e aumenta o pH do sêmen. O diluente sem tampão foi considerado o mais apropriado para uso imediato na IA. Tanto o diluente com HEPES, quanto o diluente sem tampão foram adequados para o resfriamento do sêmen equino a 5°C durante 48h. / This study compared the buffering effect of HEPES and sodium bicarbonate on pH and viability of Brazilian pony semen cooled at 5°C. pH changes caused by different dilutions using skim milk powder semen extender without buffer were also measured. In experiment 1, the effect of dilution and cooling temperature on semen motility, membrane integrity, mitochondrial activity and pH pre and post cooling was investigated. Ejaculates of nine Brazilian ponies (two ejaculates per pony) were diluted, of a non buffered powder milk extender and cooled at 5°C or 15°C during 48h in three different dilutions (1+1, 1+2 and 1+3). Dilutions did not change the parameters evaluated before cooling. Samples diluted 1+1 resulted in higher pH values (7.63 and 7.57, respectively) and lowest percentage of progressive motility (PM) at 5 and 15°C. All samples cooled at 15°C showed a lower incidence of abnormal spermatozoa (1+1 = 55.84%; 1+2 = 51.84%; 1+3 = 49.95%) (P < 0.01) independent of dilution. Progressive motility was higher when semen was cooled during 48h in 1+3 dilution at 15°C (39.72%; P < 0.05). Mitochondrial activity despite of time and temperature was similar (P > 0.05) among dilutions. In experiment 2, the buffer effect of sodium bicarbonate and HEPES on extenders were evaluated considering the maintenance of sperm viability after cooling at 5°C during 24 and 48h. A non-buffered milk powder extender (C = control) and the same extender buffered with Sodium Bicarbonate (A) and HEPES (B) was used. Semen from 7 Brazilian ponies (three ejaculates / pony) was used. Immediately after dilution sperm motility was evaluated and progressive motility was similar with all extenders (P > 0.05). At 24 and 48h after cooling at 5oC sperm motility was evaluated, respectively, on groups A (44.76%; 25.23%), B (51.42%; 38.09%) and C (54.05%; 41.66%). Plasma membrane integrity was similar after exposure to the three extenders. Before cooling, mitochondrial activity was higher (P <0.05) in extender A (A = 1.05nm, B = 0.81nm, C = 0.79nm). Mitochondrial activity after cooling for 24h was 0.83nm (A), 0.73nm (B) and 0.64nm (C). After 48h it decreased to 0.72nm (A), 0.69nm (B) and 0.63nm (C) (P > 0.05), respectively. The extenders pH, osmolarity and pH of diluted semen was higher in A (8; 382; 7.9), intermediate in B (7.5; 362; 7.32) and lower in C (7.16; 350; 7.07). Lipid peroxidation and its induction were similar in all groups. It was concluded that all dilution grades in fresh semen were adequate and that pH was affected and increased when semen was extended and cooled for 48h. The best results were observed when semen was diluted at 1+3 and cooled at 15°C for 48h in a non buffered powder milk extender. Sodium bicarbonate (A) reduces progressive motility and increases semen pH. The non buffered (C) semen extender was considered more appropriated for semen dilution for immediate use in artificial insemination. The non buffered and HEPES buffered semen extenders were considered appropriated for cooling equine semen at 5°C during 48h.

Dois experimentos foram conduzidos para verificar a viabilidade do uso do leite UHT como diluente para sêmen equino refrigerado. O objetivo principal deste estudo foi avaliar o uso de leite UHT nas apresentações desnatado, semidesnatado e integral como diluente de sêmen e posteriormente foi avaliada a viabilidade espermática com o uso de leite como diluente comparado a outros dois diluentes industrializados. No experimento I foram utilizados 31 ejaculados de 3 garanhões, as amostras de cada ejaculado foram diluídas em leite UHT nas apresentações integral, semidesnatado e desnatado, numa proporção de 3:1 (3 ml de diluente e 1ml de sêmen). Foram realizadas análises de viabilidade espermática com testes de motilidade espermática, vigor espermático, integridade de membrana (CFDA/PI) e funcionalidade de membrana espermática (HOST) pós-diluição, os quais foram repetidos nas amostras refrigeradas a 4ºC após 24 e 48h. Neste experimento, não foram observadas diferenças significativas entre os 3 diluentes, quanto a motilidade espermática, vigor, CFDA/PI e HOST. No entanto, houve uma diminuição na qualidade do sêmen armazenado por 48h (P < 0,01), sendo mais acentuada entre 24 e 48h de refrigeração. No experimento II foram utilizados 30 ejaculados de 3 garanhões onde, logo após a coleta do sêmen, as amostras de cada ejaculado foram diluídas com leite UHT desnatado (LD), Botusemen® (BS) e Botusemen Special® (BSP). As amostras foram examinadas a fresco, após a diluição (0h) e em resfriamento de 24h e 48h a 4°C. Foram realizados os mesmos testes de análise espermática do primeiro experimento para avaliação comparativa dos diluentes. As amostras de sêmen refrigeradas com BSP obtiveram maior porcentagem de motilidade total (51,1%) após 24h de refrigeração quando comparado aos outros dois diluentes testados, LD (45,8%) e BS (47,3%). Com base nos resultados obtidos nos dois experimentos, o leite UHT, independente da apresentação, pode ser utilizado como diluente de sêmen para as primeiras 24h de refrigeração, mantendo a viabilidade espermática adequada, sendo também de fácil acesso e manuseio. Se for necessário a manutenção do sêmen por mais de 24h, o BSP se mostrou superior em manter a qualidade do sêmen até 48h. / Two experiments were conducted to verify the feasibility of the use of UHT milk as an extender for chilled equine semen. The main objective of this study was to evaluate the use of UHT milk in skimmed, semi-skimmed and whole milk as extender for semen and subsequently assess sperm viability using milk as a diluent compared to two other industrial extenders. In the first experiment were used 31 ejaculates from 3 stallions of known fertility, samples of each ejaculate were diluted in the whole UHT milk, semi-skimmed milk and skim milk shows a ratio of 3:1 (3ml diluent and 1ml of semen). Sperm viability analyzes were performed, including sperm motility, sperm vigor, membrane integrity (CFDA/PI) functionality and sperm membrane (HOST) post-dilution tests which were repeated in the samples cooled to 4°C after 24 and 48h. In this experiment, no significant differences in sperm motility, vigor, CFDA/IP and HOST were observed among the 3 extenders. However, there was a decrease in the quality of semen stored for 48h (P < 0.01), being more pronounced between 24 and 48h of cooling. In the second experiment, 30 ejaculates from 3 stallions were used soon after collection of semen samples, each ejaculate was diluted with UHT skim milk (LD), Botusemen® (BS) and Botusemen Special® (BSP). The samples were analyzed fresh, immediately after the dilution (0h) and after cooling for 24h and 48h at 4°C. The same tests of sperm analysis used in the first experiment for comparative evaluation of extenders were performed. Semen samples cooled with BSP obtained the highest percentage of total motility (51.1%) after 24h of cooling when compared to the two other extenders tested, LD (45.8%) and BS (47.3%). Based on the results from the two experiments, UHT milk, regardless of the presentation, can be used as a diluent of semen during the first 24h of cooling maintaining adequate sperm viability and is easy to access and handle. If maintenance of semen for more than 24h is required, the BSP was superior in maintaining the quality of semen until 48h.

O objetivo deste trabalho foi comparar a utilização de diluentes comerciais à base de gema de ovo de galinha com os mesmos diluentes, nos quais se substituiu a gema de galinha pela de ovo de ema (Rhea americana). Foram utilizados Seis garanhões da raça Crioula, comprovadamente férteis e no período fora da estação de monta e utilizados seis ejaculados de cada garanhão. O sêmen foi avaliado macroscopicamente quanto ao volume, aspecto e coloração, a seguir avaliou-se a motilidade progressiva e total. Posteriormente o sêmen foi dividido em quatro alíquotas e diluído na proporção 1:1 com o diluente, Equimix (Nutricell Nutrientes Celulares) para centrifugação. Para adição do diluente de congelamento foram utilizados: diluente A (FR-5, Nutricell Nutrientes Celulares) e diluente B (Botu-crio, Biotech Botucatu S.A.) adicionados de 20 % de gema de ovo de ema, ou de 20 % de gema de ovo de galinha. As amostras foram envasadas, identificadas e submetidas a congelamento conforme o protocolo. As palhetas foram descongeladas, após um período mínimo de 7 dias e examinadas para os seguintes quesitos: motilidade total e progressiva, e integridade física e funcional da membrana plasmática do espermatozoide. Os diluentes comerciais com ou sem adição de gema de ovo de ema não apresentaram diferenças em relação à motilidade total e progressiva, porém observou-se diferença nos parâmetros quando comparados os diluentes comerciais. Houve diferença na funcionalidade da membrana apenas quando comparado diluente A e B com gema de ovo de ema. No quesito integridade de membrana não foi observado diferença estatística. Estes resultados demonstram que a gema de ovo de ema (Rhea americana) pode ser uma alternativa para produção de diluentes para congelamento de sêmen de equinos. / The aim of this study was to compare the use of two commercial extenders using chicken egg yolk with the same extenders, to which ema (Rhea americana) egg yolk was added. Six Criollo breed stallions were used during the off-breeding season period. Six collections per stallion were used. The ejaculate aspect, total and progressive motility were evaluated with a microscope; concentration was determined with a Neubauer counting chamber. After evaluation, semen samples were divided in two aliquots and diluted 1:1 in each of the centrifugation extender Equimix (Nutricell Nutrientes Celulares). For freeze that semen we used two commercial extenders: A (extender with glycerol) or B (extender with methylformamide) and was added 20% rhea egg yolk or 20% chicken egg yolk . Semen samples were examined at least 1 week after freezing, for total and progressive motility, physical and functional membrane integrity (HOST test and CFDA-PI fluorescence) (Lagares et al. 1998; Harrison & Vickers, 1990). The extenders of a given brand with or without rhea egg yolk had no significant difference according to total and progressive motility, although there was difference (p = 0,05) between extenders when different brands were compared, no matter if they were added Rhea egg yolk or not. Membrane functionality showed difference only when compared Extender A and B with Rhea egg yolk. Membrane integrity had no significant difference between all the treatments. These results show that Rhea egg yolk might be an alternative to making an equine semen extender.

Nesse estudo comparou-se o efeito tamponante do HEPES e Bicarbonato de Sódio em manter o pH e a viabilidade do sêmen resfriado de pôneis da raça Brasileira. As alterações no pH ocasionadas por diferentes diluições com diluente a base de leite desnatado em pó sem tampão a 5 e a 15°C também foram medidas. No experimento 1 avaliou-se o efeito da diluição e da temperatura de resfriamento sobre a motilidade, integridade de membrana, pH e atividade mitocondrial do sêmen pré e pós resfriamento. O sêmen de nove pôneis da raça Brasileira (dois ejaculados/pônei) foi diluído em diluente a base de leite desnatado (em pó) sem tampão e refrigerado a 5 ou 15°C por 48h em três diferentes diluições (1+1, 1+2, 1+3). As três diluições não alteraram os parâmetros avaliados após a diluição a fresco. A diluição 1+1 resultou em valores maiores de pH (7,63 e 7,57, respectivamente) e menor percentual de motilidade progressiva (MP) a 5 e a 15°C. O maior percentual de células íntegras (1+1=44,16; 1+2=48,16; 1+3=50,05) foi detectado a 15°C (P < 0,01), independente da diluição. A MP foi maior nas 48h de resfriamento (39,72%; P < 0,05) quando o sêmen foi diluído a 1+3 e refrigerado a 15°C. A atividade mitocondrial (P > 0,05) em função do tempo e temperatura foi similar entre as diluições. No experimento 2 avaliou-se o efeito tampão do bicarbonato de sódio e do HEPES em diluentes sobre a viabilidade de espermatozoides resfriados a 5°C durante 48h. Os diluentes testados compunham-se de leite desnatado em pó com bicarbonato de sódio (A), HEPES (B) ou diluente sem tampão (C). O sêmen de sete pôneis da raça Brasileira (três ejaculados/pônei) foi utilizado e a motilidade progressiva foi similar entre os diluentes (P > 0,05) após a diluição. Nas 24 e 48h, a MP foi, respectivamente, para A (44,76%; 25,23%), B (51,42%; 38,09%) e C (54,05%; 41,66%). A integridade da membrana plasmática foi similar após a exposição aos três diluentes. A fresco, a atividade mitocondrial foi maior (P < 0,05) no sêmen exposto ao diluente A (A=1,05nm, B=0,81nm, C=0,79nm) e após 24h A e B foram similares (0,83nm; 0,73nm), enquanto que no diluente C observou-se menor atividade (0,64nm). Nas 48h não houve diferença (A=0,72; B=0,69; C=0,63; P > 0,05). O pH do diluente e sua osmolaridade, assim como o pH do sêmen diluído foi maior no diluente A (8; 382; 7,9), intermediário (7,5; 362; 7,32) no B e menor no C (7,16; 350; 7,07). A peroxidação lipídica e a indução da peroxidação foram similares em todos os grupos. Sugere-se que, quando da utilização do sêmen a fresco, qualquer das diluições aqui testadas pode ser utilizada com segurança. O resfriamento do sêmen por 48h modifica e eleva o pH do sêmen. Os melhores resultados foram observados com o resfriamento do sêmen a 15°C por 48h e com a diluição 1+3 em um diluente a base de leite em pó desnatado sem tampão. O bicarbonato de sódio (A) reduz a MP e aumenta o pH do sêmen. O diluente sem tampão foi considerado o mais apropriado para uso imediato na IA. Tanto o diluente com HEPES, quanto o diluente sem tampão foram adequados para o resfriamento do sêmen equino a 5°C durante 48h. / This study compared the buffering effect of HEPES and sodium bicarbonate on pH and viability of Brazilian pony semen cooled at 5°C. pH changes caused by different dilutions using skim milk powder semen extender without buffer were also measured. In experiment 1, the effect of dilution and cooling temperature on semen motility, membrane integrity, mitochondrial activity and pH pre and post cooling was investigated. Ejaculates of nine Brazilian ponies (two ejaculates per pony) were diluted, of a non buffered powder milk extender and cooled at 5°C or 15°C during 48h in three different dilutions (1+1, 1+2 and 1+3). Dilutions did not change the parameters evaluated before cooling. Samples diluted 1+1 resulted in higher pH values (7.63 and 7.57, respectively) and lowest percentage of progressive motility (PM) at 5 and 15°C. All samples cooled at 15°C showed a lower incidence of abnormal spermatozoa (1+1 = 55.84%; 1+2 = 51.84%; 1+3 = 49.95%) (P < 0.01) independent of dilution. Progressive motility was higher when semen was cooled during 48h in 1+3 dilution at 15°C (39.72%; P < 0.05). Mitochondrial activity despite of time and temperature was similar (P > 0.05) among dilutions. In experiment 2, the buffer effect of sodium bicarbonate and HEPES on extenders were evaluated considering the maintenance of sperm viability after cooling at 5°C during 24 and 48h. A non-buffered milk powder extender (C = control) and the same extender buffered with Sodium Bicarbonate (A) and HEPES (B) was used. Semen from 7 Brazilian ponies (three ejaculates / pony) was used. Immediately after dilution sperm motility was evaluated and progressive motility was similar with all extenders (P > 0.05). At 24 and 48h after cooling at 5oC sperm motility was evaluated, respectively, on groups A (44.76%; 25.23%), B (51.42%; 38.09%) and C (54.05%; 41.66%). Plasma membrane integrity was similar after exposure to the three extenders. Before cooling, mitochondrial activity was higher (P <0.05) in extender A (A = 1.05nm, B = 0.81nm, C = 0.79nm). Mitochondrial activity after cooling for 24h was 0.83nm (A), 0.73nm (B) and 0.64nm (C). After 48h it decreased to 0.72nm (A), 0.69nm (B) and 0.63nm (C) (P > 0.05), respectively. The extenders pH, osmolarity and pH of diluted semen was higher in A (8; 382; 7.9), intermediate in B (7.5; 362; 7.32) and lower in C (7.16; 350; 7.07). Lipid peroxidation and its induction were similar in all groups. It was concluded that all dilution grades in fresh semen were adequate and that pH was affected and increased when semen was extended and cooled for 48h. The best results were observed when semen was diluted at 1+3 and cooled at 15°C for 48h in a non buffered powder milk extender. Sodium bicarbonate (A) reduces progressive motility and increases semen pH. The non buffered (C) semen extender was considered more appropriated for semen dilution for immediate use in artificial insemination. The non buffered and HEPES buffered semen extenders were considered appropriated for cooling equine semen at 5°C during 48h.

Dois experimentos foram conduzidos para verificar a viabilidade do uso do leite UHT como diluente para sêmen equino refrigerado. O objetivo principal deste estudo foi avaliar o uso de leite UHT nas apresentações desnatado, semidesnatado e integral como diluente de sêmen e posteriormente foi avaliada a viabilidade espermática com o uso de leite como diluente comparado a outros dois diluentes industrializados. No experimento I foram utilizados 31 ejaculados de 3 garanhões, as amostras de cada ejaculado foram diluídas em leite UHT nas apresentações integral, semidesnatado e desnatado, numa proporção de 3:1 (3 ml de diluente e 1ml de sêmen). Foram realizadas análises de viabilidade espermática com testes de motilidade espermática, vigor espermático, integridade de membrana (CFDA/PI) e funcionalidade de membrana espermática (HOST) pós-diluição, os quais foram repetidos nas amostras refrigeradas a 4ºC após 24 e 48h. Neste experimento, não foram observadas diferenças significativas entre os 3 diluentes, quanto a motilidade espermática, vigor, CFDA/PI e HOST. No entanto, houve uma diminuição na qualidade do sêmen armazenado por 48h (P < 0,01), sendo mais acentuada entre 24 e 48h de refrigeração. No experimento II foram utilizados 30 ejaculados de 3 garanhões onde, logo após a coleta do sêmen, as amostras de cada ejaculado foram diluídas com leite UHT desnatado (LD), Botusemen® (BS) e Botusemen Special® (BSP). As amostras foram examinadas a fresco, após a diluição (0h) e em resfriamento de 24h e 48h a 4°C. Foram realizados os mesmos testes de análise espermática do primeiro experimento para avaliação comparativa dos diluentes. As amostras de sêmen refrigeradas com BSP obtiveram maior porcentagem de motilidade total (51,1%) após 24h de refrigeração quando comparado aos outros dois diluentes testados, LD (45,8%) e BS (47,3%). Com base nos resultados obtidos nos dois experimentos, o leite UHT, independente da apresentação, pode ser utilizado como diluente de sêmen para as primeiras 24h de refrigeração, mantendo a viabilidade espermática adequada, sendo também de fácil acesso e manuseio. Se for necessário a manutenção do sêmen por mais de 24h, o BSP se mostrou superior em manter a qualidade do sêmen até 48h. / Two experiments were conducted to verify the feasibility of the use of UHT milk as an extender for chilled equine semen. The main objective of this study was to evaluate the use of UHT milk in skimmed, semi-skimmed and whole milk as extender for semen and subsequently assess sperm viability using milk as a diluent compared to two other industrial extenders. In the first experiment were used 31 ejaculates from 3 stallions of known fertility, samples of each ejaculate were diluted in the whole UHT milk, semi-skimmed milk and skim milk shows a ratio of 3:1 (3ml diluent and 1ml of semen). Sperm viability analyzes were performed, including sperm motility, sperm vigor, membrane integrity (CFDA/PI) functionality and sperm membrane (HOST) post-dilution tests which were repeated in the samples cooled to 4°C after 24 and 48h. In this experiment, no significant differences in sperm motility, vigor, CFDA/IP and HOST were observed among the 3 extenders. However, there was a decrease in the quality of semen stored for 48h (P < 0.01), being more pronounced between 24 and 48h of cooling. In the second experiment, 30 ejaculates from 3 stallions were used soon after collection of semen samples, each ejaculate was diluted with UHT skim milk (LD), Botusemen® (BS) and Botusemen Special® (BSP). The samples were analyzed fresh, immediately after the dilution (0h) and after cooling for 24h and 48h at 4°C. The same tests of sperm analysis used in the first experiment for comparative evaluation of extenders were performed. Semen samples cooled with BSP obtained the highest percentage of total motility (51.1%) after 24h of cooling when compared to the two other extenders tested, LD (45.8%) and BS (47.3%). Based on the results from the two experiments, UHT milk, regardless of the presentation, can be used as a diluent of semen during the first 24h of cooling maintaining adequate sperm viability and is easy to access and handle. If maintenance of semen for more than 24h is required, the BSP was superior in maintaining the quality of semen until 48h.