Submitted by Gizele Lima (gizele.lima@inpa.gov.br) on 2016-09-01T18:24:26Z No. of bitstreams: 2 TesePedroMartinsFinal.pdf: 958191 bytes, checksum: 3e28b170996bc7e61bbaba660c3be6c7 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-01T18:24:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TesePedroMartinsFinal.pdf: 958191 bytes, checksum: 3e28b170996bc7e61bbaba660c3be6c7 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-04-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The best way to understand biological processes that occur in humans is to use other species as comparative models. One of the areas that best uses model species are studies on senescence. Birds are of special interest in these studies since they are longer lived than its size and metabolic rates would predict. Although initially birds were considered immune to actuarial senescence, the accumulation of information in the second half of twentieth century on the variation in survival rates with age in birds changed this paradigm. The senescence studies , however, are limited, especially due the difficulty in collecting data on age of death in birds. This work use new methods of measuring age in birds and calculate senescence rates in Pithys albifrons, a neotropical passerine. The results demonstrate that actuarial senescence in P. albifrons is non-existent or negligible. The estimated demographic parameters for P. albifrons demonstrate that low senescence rate does not guarantee this species a high longevity. The longevity of this species is similar to the species of the same weight from temperate region. The low longevity of this species is more related to the small size and the low annual survival rate. This article presents evidence of a species of neotropical bird that shows no signs of actuarial senescence and that the longevity of the species is more related to their survival rates than it is with senescence rates. / Dentre as áreas de estudos que melhor se utilizam desta máxima estão os estudos sobre senescência. Aves são de especial interesse nestes estudos por serem mais longevas do que seu tamanho e taxas metabólicas prediriam. Apesar de inicialmente terem sido consideradas imunes à senescência atuarial, a partir da segunda metade do século XX, o acúmulo de informação sobre a variação das taxas de sobrevivência com a idade em aves mudou este paradigma. Os estudos sobre senescência em aves, no entanto, são limitadao, especialmente pela dificuldade em coletar dados sobre idade em aves. Este trabalho usa novos métodos de aferir idade em aves e de calcular taxas de senescência em Pithys albifrons, um passeriforme neotropical especializado em forragear seguindo formigas de correição. Os resultados demonstram que a senescência atuarial em P. albifrons é inexistente ou negligenciável. Os parâmetros demográficos estimados para P. albifrons demonstram que a baixa taxa de senescência não garante a essa espécie uma alta longevidade. A longevidade desta espécie é similar a espécies do mesmo peso. A baixa longevidade desta espécie está mais relacionada com o pequeno porte e com a baixa taxa de sobrevivência anual. Este trabalho apresenta evidências de ausência de sinais de senescência atuarial e de que a longevidade das espécies em passeriformes neotropicais. está mais relacionada com suas taxas de sobrevivência do que com as taxas de senescência. Estudos comparativos mais abrangentes similares ao desenvolvido para P. albifrons são necessários para um entendimento da senescência em aves neotropicais

Autofagia é um processo de degradação fisiológico aumentado em diferentes condições de estresse, em que proteínas e organelas não funcionais são direcionadas ao lisossomo, onde são degradadas e os produtos da degradação reutilizados pela célula. Senescência é o processo em que as células param de dividir e entram em um estado de parada celular irreversível. Os dois processos, autofagia e senescência, podem ser induzidos na presença de dano no DNA, porém a maquinaria molecular que realiza a intermediação neste processo ainda é incerta. Temozolomida (TMZ) é um agente alquilante, usado para tratar pacientes com Glioblastoma, que induz dano no DNA. Lesões produzidas por TMZ ativam a resposta ao dano no DNA (DDR), uma sinalização complexa que medeia as respostas celulares, tais como a dinâmica do ciclo celular, autofagia, senescência e morte celular, ao dano genotóxico. Dada a importância desses mecanismos, esse trabalho objetiva avaliar o impacto da inibição da cinase Ataxia Telangiectasia mutada dependente de Rad3 (ATR), reguladora chave da DDR, na proliferação, autofagia e senescência em células de glioblastoma tratadas com TMZ. Para tal, nós utilizamos um inibidor farmacológico para ATR (VE-821), bem como shRNA para ATR com vetor lentiviral em células U87. A inibição farmacológica da proteína ATR não alterou o estado autofágico e de senescência em comparação com as células tratadas somente com TMZ. Esses resultados foram obtidos usando o método Laranja de Acridina (AO) e a ferramenta de Análise Morfométrica Nuclear (NMA). Na ausência de uma sinalização dependente de ATR, obtida pelas células shATR tratadas com TMZ, também não observamos alteração significativa em relação a esses processos. No entanto, nós observamos um acúmulo da proteína SQSTM1/p62, substrato da autofagia, nas células silenciadas para ATR. Esta alteração não se refletiu em aumento de foci intracelulares da proteína SQSTM1/p62. Em conclusão, ATR não parece participar diretamente da ativação da Autofagia e da Senescência induzidas por TMZ. / Autophagy is a catabolic process, that shows increased levels in stressful situations, whereby dysfunctional proteins and organelles are engulfed and targeted to lysosomes for degradation and recycled back to the cell. Senescence is the process by which cells stop dividing and enter a state of growth arrest. Both processes, autophagy and senescence, can be induced by DNA damage, however, the molecular machinery that mediates this process is still uncertain. Temozolomide (TMZ) is an alkylating agent, used to treat patients with Glioblastoma, that drives DNA damage. Lesions produced by TMZ activate the DNA damage response (DDR), a complex signalling pathway, that mediates cellular outcomes such as cell cycle distribution, autophagy, senescence and cellular death, to genotoxic damage. Given the importance of such mechanisms, this work aims to evaluate the impact of inhibiting the Ataxia telangiectasia and Rad3 related (ATR) kinase, key regulator of the DDR, on cellular proliferation, autophagy and senescence, on Glioblastoma (GBM) cells treated with TMZ. In order to do that, we used a pharmacological inhibitor for ATR (VE-821) as well as shRNA to ATR, in U87 cells using lentiviral vectors. The pharmacological inhibition of ATR did not alter the autophagic or senescence status in comparison with the cells treated with TMZ only. Such results were obtained by Acridine Orange (AO) assessment and Nuclear Morphometric Analysis (NMA) tool. In the absence of an ATR dependent signalling, assessed through shATR cells treated with TMZ, no significant alteration in relation to such processes was seen. However, we observed an accumulation of the SQSTM1/p62 protein, a selective autophagy substrate, on cells silenced for ATR. This accumulation did not reflect in increased intracellular foci formation of SQSTM1/p62 protein. In conclusion, ATR doesn't seem to play a direct role in the Autophagy and Senescence induced by TMZ.

Os gliomas representam a maioria dos tumores do sistema nervoso central, sendo o glioblastoma o mais maligno entre eles. O tratamento destes tumores ainda é ineficiente e a sobrevida média dos pacientes é de aproximadamente um ano após o diagnóstico. A remoção cirúrgica, quando possível, acompanhada de radioterapia e quimioterapia é o tratamento padrão. A tendência é que a quimioterapia assuma um papel mais importante, uma vez que possibilita a ativação de mecanismos endógenos antitumorais, como senescência celular. Este mecanismo possui potencial de induzir a perda irreversível da capacidade da divisão de células tumorais. O resveratrol e a quercetina, dois polifenóis naturais, induzem senescência em diferentes linhagens tumorais, incluindo os glioblastomas. Ambos têm efeitos pleiotrópicos e induzem a ativação de vários alvos moleculares, sendo SIRT1, um desses alvos. SIRT1 é uma histona desacetilase (HDAC) associada ao desenvolvimento de vários tipos de tumores. Por este motivo, foi avaliada a indução de senescência em células de glioblastomas pelo resveratrol e quercetina combinados com butirato de sódio, um inibidor de HDAC classe I e II. Os resultados mostram um efeito combinado do butirato de sódio e estes polifenóis para induzir a senescência nas linhagens celulares U87 e C6, mas não em astrócitos normais de ratos. Os co-tratamentos induzem perda de capacidade proliferativa e aumento do número de células positivas para β-galactosidase, um marcador de senescência. Estes resultados foram acompanhados de parada no ciclo celular na fase G2 na linhagem U87, mas nenhum efeito foi observado sobre o ciclo de células C6. A análise por Western Blot sugere o aumento do supressor tumoral p21 após co-tratamentos. Além disso, o co-tratamento com quercetina e butirato de sódio aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio, mas não os níveis de gama-H2AX (um marcador de dano). Estes dados sugerem que o butirato de sódio em combinação com os polifenóis tem potencial terapêutico para a supressão de glioblastomas. Por outro lado, um dos problemas em biologia e medicina é entender como células pré-cancerosas e cancerosas entram em senescência ou conseguem evitá-la. A chave para a compreensão da indução da senescência e do seu bypass é a ativação da enzima telomerase (TERT), presente em 85 % dos tumores. Na segunda parte desta tese, ferramentas de biologia de sistemas foram utilizadas para projetar uma rede câncer e senescência humana com o objetivo de estudar a relação entre senescência e câncer (incluindo glioblastoma). Os resultados mostram uma interação direta entre TERT e oncogenes como MYC, E2F1, AKT1 e ABL1, que podem induzir a senescência. Além disso, uma associação metabólica forte entre estes oncogenes e sua capacidade de induzir senescência foi mostrada através de análise por ontologia gênica. Estes oncogenes também atuam como reguladores da transcrição e/ou pós-transcrição da subunidade catalítica de TERT. Resultados obtidos a partir da análise de centralidade da rede juntamente com dados de microarranjos derivados de tumores foram utilizados para conceber um modelo dinâmico da regulação de TERT em câncer. Com base nestes resultados, foi gerado um modelo hipotético no qual a expressão de TERT pode ser transitória ou induzida por espécies reativas de oxigênio, aumentando a sobrevivência de diferentes tipos de tumores, como o glioblastoma. Este estudo fornece novas evidências para a relação entre senescência e câncer. Além disso, esta hipótese, se verificada experimentalmente, pode permitir a formulação de novas abordagens quimioterapêuticas para o tratamento de gliobastomas. / Gliomas are the majority of central nervous system tumours, being glioblastoma the most malign among them. The treatment for these tumors is still inefficient and survival average of patients is approximately one year after diagnosis. Surgical removal, if possible, followed by radiotherapy and chemotherapy is the standard treatment. The trend is that chemotherapy assumes a greater role, since it allows the activation of antitumour mechanisms, such as cellular senescence. This mechanism has potential to induce irreversible loss of division ability in tumor cells. Resveratrol and quercetin, two natural polyphenols, are able to induce senescence in different cancer models, including glioblastoma. Resveratrol and quercetine are molecules with pleiotropic effects and leads to SIRT1 activation. SIRT1 is a histone deacetylase (HDAC) which has been linked positively to cancer development. Therefore, we analyzed the ability of sodium butyrate, a HDAC class I and II inhibitor combined with resveratrol or quercetin to induce senescence in glioblastoma cell lines. Results show a combined effect of sodium butyrate and these polyphenols to induce senescence in U87 and C6 cell lines, but not in normal rat astrocytes. Co-treatments induce a loss of proliferative capacity and increase the number of positive cells for β-galactosidase, a senescence marker. These results were accompanied with cell cycle arrest in G2 checkpoint in U87, but no effect on cell cycle phase‟s distribution in C6 was observed. Western blott analysis suggests that these arrests are result of tumour suppressor p21 increase. Moreover, co-treatments increased reactive oxygen species, but not gamma-H2AX levels (a damage marker). The data underline that tumor cells can be driven towards cellular senescence by sodium butyrate combined with polyphenols, which may further arise as a possibility for tumor suppression. On the other hand, one of the challenging problems in biology and medicine is to understand how pre-cancerous or cancer cells enter in senescence or can avoid it. The key to understanding senescence induction and its bypass is the telomerase (TERT), which is present in 85 % of tumors. In a second part of this thesis, system biology tools were used to design a human cancer-senescence network with the aim to study the relationship between senescence and cancer (included glioblastoma). The results show a direct interaction between TERT and oncogenes such as MYC, E2F1, AKT1 and ABL1, which can induce senescence. Moreover, a strong metabolic association between these oncogenes and their ability to induce senescence was shown by gene ontology analysis. These oncogenes also act as transcriptional and/or post-transcriptional regulators of TERT catalytic subunit. Results obtained from centrality analysis and microarray data derived from tumors were used to design a dynamic model for TERT regulation in cancer. Based on these results, a hypothetical model was generated in which TERT expression may be transient or induced by reactive oxygen species, increasing the survival of different tumor types, such as glioblastoma. This study provides new evidence for the relationship between senescence and cancer. Furthermore, this hypothesis, if experimental verified, can enable the development of new chemotherapy approaches to glioblastoma treatment. and ABL1, which can induce senescence. Moreover, a strong metabolic association between these oncogenes and their ability to induce senescence was shown by gene ontology analysis. These oncogenes also act as transcriptional and/or post-transcriptional regulators of TERT catalytic subunit. Based on these results, a hypothetical model was generated in which TERT expression may be transient or induced by reactive oxygen species, increasing the survival of different tumor types, such as glioblastoma. This study provides new evidence for the relationship between senescence and cancer. Furthermore, this hypothesis, if experimental verified, can enable the development of new chemotherapy approaches.

Autofagia é um processo de degradação fisiológico aumentado em diferentes condições de estresse, em que proteínas e organelas não funcionais são direcionadas ao lisossomo, onde são degradadas e os produtos da degradação reutilizados pela célula. Senescência é o processo em que as células param de dividir e entram em um estado de parada celular irreversível. Os dois processos, autofagia e senescência, podem ser induzidos na presença de dano no DNA, porém a maquinaria molecular que realiza a intermediação neste processo ainda é incerta. Temozolomida (TMZ) é um agente alquilante, usado para tratar pacientes com Glioblastoma, que induz dano no DNA. Lesões produzidas por TMZ ativam a resposta ao dano no DNA (DDR), uma sinalização complexa que medeia as respostas celulares, tais como a dinâmica do ciclo celular, autofagia, senescência e morte celular, ao dano genotóxico. Dada a importância desses mecanismos, esse trabalho objetiva avaliar o impacto da inibição da cinase Ataxia Telangiectasia mutada dependente de Rad3 (ATR), reguladora chave da DDR, na proliferação, autofagia e senescência em células de glioblastoma tratadas com TMZ. Para tal, nós utilizamos um inibidor farmacológico para ATR (VE-821), bem como shRNA para ATR com vetor lentiviral em células U87. A inibição farmacológica da proteína ATR não alterou o estado autofágico e de senescência em comparação com as células tratadas somente com TMZ. Esses resultados foram obtidos usando o método Laranja de Acridina (AO) e a ferramenta de Análise Morfométrica Nuclear (NMA). Na ausência de uma sinalização dependente de ATR, obtida pelas células shATR tratadas com TMZ, também não observamos alteração significativa em relação a esses processos. No entanto, nós observamos um acúmulo da proteína SQSTM1/p62, substrato da autofagia, nas células silenciadas para ATR. Esta alteração não se refletiu em aumento de foci intracelulares da proteína SQSTM1/p62. Em conclusão, ATR não parece participar diretamente da ativação da Autofagia e da Senescência induzidas por TMZ. / Autophagy is a catabolic process, that shows increased levels in stressful situations, whereby dysfunctional proteins and organelles are engulfed and targeted to lysosomes for degradation and recycled back to the cell. Senescence is the process by which cells stop dividing and enter a state of growth arrest. Both processes, autophagy and senescence, can be induced by DNA damage, however, the molecular machinery that mediates this process is still uncertain. Temozolomide (TMZ) is an alkylating agent, used to treat patients with Glioblastoma, that drives DNA damage. Lesions produced by TMZ activate the DNA damage response (DDR), a complex signalling pathway, that mediates cellular outcomes such as cell cycle distribution, autophagy, senescence and cellular death, to genotoxic damage. Given the importance of such mechanisms, this work aims to evaluate the impact of inhibiting the Ataxia telangiectasia and Rad3 related (ATR) kinase, key regulator of the DDR, on cellular proliferation, autophagy and senescence, on Glioblastoma (GBM) cells treated with TMZ. In order to do that, we used a pharmacological inhibitor for ATR (VE-821) as well as shRNA to ATR, in U87 cells using lentiviral vectors. The pharmacological inhibition of ATR did not alter the autophagic or senescence status in comparison with the cells treated with TMZ only. Such results were obtained by Acridine Orange (AO) assessment and Nuclear Morphometric Analysis (NMA) tool. In the absence of an ATR dependent signalling, assessed through shATR cells treated with TMZ, no significant alteration in relation to such processes was seen. However, we observed an accumulation of the SQSTM1/p62 protein, a selective autophagy substrate, on cells silenced for ATR. This accumulation did not reflect in increased intracellular foci formation of SQSTM1/p62 protein. In conclusion, ATR doesn't seem to play a direct role in the Autophagy and Senescence induced by TMZ.

Autofagia é o processo de degradação de componentes próprios celulares e parece modular senescência e apoptose induzidas por diferentes tipos de injúria, incluindo dano ao DNA. Populacionalmente, autofagia ocorre logo após o dano ao genoma, enquanto senescência é a resposta crônica das células que resistem à morte celular. Até o momento, nenhum trabalho demonstrou o papel da autofagia na senescência de fato, principalmente considerando uma análise integrada com morte celular e a ocorrência destes mecanismos a nível de células únicas. Inicialmente, desenvolvemos uma metodologia para avaliação do tamanho e forma de núcleos de células eucarióticas em cultura, a Análise Morfométrica Nuclear, a qual foi validada para análise de apoptose, senescência e irregularidades nucleares. O segundo objetivo foi avaliar o papel da autofagia na senescência e morte celular induzidas por dano ao DNA em células de glioblastoma, e os mecanismos moleculares por trás desta relação. Para isso, células expressando estavelmente o marcador de autofagia GFP-LC3 foram tratadas com o indutor de dano ao DNA Temozolomida (TMZ), droga de escolha contra glioblastomas, por 3h seguido do replaqueamento em meio livre de droga. TMZ induziu autofagia transiente e ativação de AMPK-ULK1 e p38 MAPK, acompanhado da supressão crônica da via PI3K/Akt/mTOR. O tratamento com TMZ induziu aumento de vários marcadores de senescência celular a longo prazo, cuja cinética foi analisada de maneira integrada e correlativa, bem como aumentou níveis de ROS, os quais mediaram, ao menos parcialmente, a indução de autofagia e senescência. Considerando a relação entre autofagia e senescência, observamos uma correlação negativa forte entre os mecanismos a nível populacional. Por outro lado, a nível de células únicas esta correlação não foi observada. Através do acompanhamento de células únicas nós observamos também uma redução orquestrada da autofagia independente da aquisição de fenótipo senescente. Esta redução ocorreu antes, durante ou após o aumento da área celular que caracteriza senescência celular, mostrando que a redução da autofagia não é necessária para aquisição do fenótipo senescente. Finalmente, a ativação da autofagia aumentou o efeito pró-senescente da TMZ, enquanto a supressão da autofagia induziu apoptose e reduziu a senescência, sugerindo que a autofagia protege as células da morte celular e permite a entrada das células em estado senescente após tratamento com TMZ. Neste sentido, também discutimos aqui a importância da análise completa e integrada das alterações em mecanismos de proliferação e morte celular induzidas pela inibição da autofagia. Em conclusão, autofagia e senescência parecem ser repostas induzidas por um mesmo sinal mas com cinéticas diferentes nas células expostas a dano ao DNA, estabelecendo uma correlação negativa a nível populacional que não se confirma a nível de células únicas. / Autophagy is the process of degradation of own cellular components and appears to modulate senescence and apoptosis induced by different types of injury, including DNA damage. At a population level, autophagy occurs soon after the damage to the genome, while senescence is chronic response of cells that resist to cell death. To date , no study has demonstrated the role of autophagy in senescence indeed, especially considering an integrated analysis with cell death and the occurrence of these mechanisms at the level of single cells. This thesis consists of two main objectives. Initially, we developed a method to evaluate the shape and size of nuclei of eukaryotic cells in culture, called Morphometric Analysis Nuclear, which was validated for the analysis of apoptosis, senescence and nuclear irregularities. The second objective was to evaluate the role of autophagy in senescence and cell death induced by DNA damage in glioblastoma cells, and the molecular mechanisms behind this relationship. For this, cells stably expressing the autophagy marker GFP- LC3 were treated for 3h with the DNA alkylating agent Temozolomide (TMZ), the drug of choice against glioblastomas, followed by replating in drug-free medium. TMZ induced autophagy and transient activation of AMPK-ULK1 axis and p38 MAPK, accompanied by chronic suppression of the PI3K/Akt/mTOR pathway. The treatment with TMZ induced an increase of several markers of cellular senescence at long term, whose kinetics was analyzed and integrated correlative manner. TMZ also increased ROS levels which mediated, at least in part, the induction of senescence and autophagy . Considering the relationship between autophagy and senescence, we observed a strong negative correlation between the mechanisms at the population level. On the other hand, at a single cell level this correlation was not observed. Through the monitoring of single cells we also observed an orchestrated reduction of autophagy, independently of the senescent phenotype acquisition. This reduction occured before, during or after increasing the cell area featuring cellular senescence, showing that the reduction of autophagy is not required for the acquisition of the senescent phenotype. Finally , activation of the autophagy increased pro- senescent effect of TMZ, while autophagy inhibition triggered apoptosis and reduced senescence, suggesting that autophagy protects cells from cell death and allows senescence entry after treatment with TMZ. In this sense, we also discuss here the importance of comprehensive and integrated analysis of changes in mechanisms of proliferation and cell death induced by autophagy inhibition. In conclusion , autophagy and senescence responses appear to be induced by the same signal but with different kinetics after DNA damage, establishing a negative correlation at a population level that is not confirmed at the level of single cells.

Autofagia é um processo de degradação fisiológico aumentado em diferentes condições de estresse, em que proteínas e organelas não funcionais são direcionadas ao lisossomo, onde são degradadas e os produtos da degradação reutilizados pela célula. Senescência é o processo em que as células param de dividir e entram em um estado de parada celular irreversível. Os dois processos, autofagia e senescência, podem ser induzidos na presença de dano no DNA, porém a maquinaria molecular que realiza a intermediação neste processo ainda é incerta. Temozolomida (TMZ) é um agente alquilante, usado para tratar pacientes com Glioblastoma, que induz dano no DNA. Lesões produzidas por TMZ ativam a resposta ao dano no DNA (DDR), uma sinalização complexa que medeia as respostas celulares, tais como a dinâmica do ciclo celular, autofagia, senescência e morte celular, ao dano genotóxico. Dada a importância desses mecanismos, esse trabalho objetiva avaliar o impacto da inibição da cinase Ataxia Telangiectasia mutada dependente de Rad3 (ATR), reguladora chave da DDR, na proliferação, autofagia e senescência em células de glioblastoma tratadas com TMZ. Para tal, nós utilizamos um inibidor farmacológico para ATR (VE-821), bem como shRNA para ATR com vetor lentiviral em células U87. A inibição farmacológica da proteína ATR não alterou o estado autofágico e de senescência em comparação com as células tratadas somente com TMZ. Esses resultados foram obtidos usando o método Laranja de Acridina (AO) e a ferramenta de Análise Morfométrica Nuclear (NMA). Na ausência de uma sinalização dependente de ATR, obtida pelas células shATR tratadas com TMZ, também não observamos alteração significativa em relação a esses processos. No entanto, nós observamos um acúmulo da proteína SQSTM1/p62, substrato da autofagia, nas células silenciadas para ATR. Esta alteração não se refletiu em aumento de foci intracelulares da proteína SQSTM1/p62. Em conclusão, ATR não parece participar diretamente da ativação da Autofagia e da Senescência induzidas por TMZ. / Autophagy is a catabolic process, that shows increased levels in stressful situations, whereby dysfunctional proteins and organelles are engulfed and targeted to lysosomes for degradation and recycled back to the cell. Senescence is the process by which cells stop dividing and enter a state of growth arrest. Both processes, autophagy and senescence, can be induced by DNA damage, however, the molecular machinery that mediates this process is still uncertain. Temozolomide (TMZ) is an alkylating agent, used to treat patients with Glioblastoma, that drives DNA damage. Lesions produced by TMZ activate the DNA damage response (DDR), a complex signalling pathway, that mediates cellular outcomes such as cell cycle distribution, autophagy, senescence and cellular death, to genotoxic damage. Given the importance of such mechanisms, this work aims to evaluate the impact of inhibiting the Ataxia telangiectasia and Rad3 related (ATR) kinase, key regulator of the DDR, on cellular proliferation, autophagy and senescence, on Glioblastoma (GBM) cells treated with TMZ. In order to do that, we used a pharmacological inhibitor for ATR (VE-821) as well as shRNA to ATR, in U87 cells using lentiviral vectors. The pharmacological inhibition of ATR did not alter the autophagic or senescence status in comparison with the cells treated with TMZ only. Such results were obtained by Acridine Orange (AO) assessment and Nuclear Morphometric Analysis (NMA) tool. In the absence of an ATR dependent signalling, assessed through shATR cells treated with TMZ, no significant alteration in relation to such processes was seen. However, we observed an accumulation of the SQSTM1/p62 protein, a selective autophagy substrate, on cells silenced for ATR. This accumulation did not reflect in increased intracellular foci formation of SQSTM1/p62 protein. In conclusion, ATR doesn't seem to play a direct role in the Autophagy and Senescence induced by TMZ.

Os gliomas representam a maioria dos tumores do sistema nervoso central, sendo o glioblastoma o mais maligno entre eles. O tratamento destes tumores ainda é ineficiente e a sobrevida média dos pacientes é de aproximadamente um ano após o diagnóstico. A remoção cirúrgica, quando possível, acompanhada de radioterapia e quimioterapia é o tratamento padrão. A tendência é que a quimioterapia assuma um papel mais importante, uma vez que possibilita a ativação de mecanismos endógenos antitumorais, como senescência celular. Este mecanismo possui potencial de induzir a perda irreversível da capacidade da divisão de células tumorais. O resveratrol e a quercetina, dois polifenóis naturais, induzem senescência em diferentes linhagens tumorais, incluindo os glioblastomas. Ambos têm efeitos pleiotrópicos e induzem a ativação de vários alvos moleculares, sendo SIRT1, um desses alvos. SIRT1 é uma histona desacetilase (HDAC) associada ao desenvolvimento de vários tipos de tumores. Por este motivo, foi avaliada a indução de senescência em células de glioblastomas pelo resveratrol e quercetina combinados com butirato de sódio, um inibidor de HDAC classe I e II. Os resultados mostram um efeito combinado do butirato de sódio e estes polifenóis para induzir a senescência nas linhagens celulares U87 e C6, mas não em astrócitos normais de ratos. Os co-tratamentos induzem perda de capacidade proliferativa e aumento do número de células positivas para β-galactosidase, um marcador de senescência. Estes resultados foram acompanhados de parada no ciclo celular na fase G2 na linhagem U87, mas nenhum efeito foi observado sobre o ciclo de células C6. A análise por Western Blot sugere o aumento do supressor tumoral p21 após co-tratamentos. Além disso, o co-tratamento com quercetina e butirato de sódio aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio, mas não os níveis de gama-H2AX (um marcador de dano). Estes dados sugerem que o butirato de sódio em combinação com os polifenóis tem potencial terapêutico para a supressão de glioblastomas. Por outro lado, um dos problemas em biologia e medicina é entender como células pré-cancerosas e cancerosas entram em senescência ou conseguem evitá-la. A chave para a compreensão da indução da senescência e do seu bypass é a ativação da enzima telomerase (TERT), presente em 85 % dos tumores. Na segunda parte desta tese, ferramentas de biologia de sistemas foram utilizadas para projetar uma rede câncer e senescência humana com o objetivo de estudar a relação entre senescência e câncer (incluindo glioblastoma). Os resultados mostram uma interação direta entre TERT e oncogenes como MYC, E2F1, AKT1 e ABL1, que podem induzir a senescência. Além disso, uma associação metabólica forte entre estes oncogenes e sua capacidade de induzir senescência foi mostrada através de análise por ontologia gênica. Estes oncogenes também atuam como reguladores da transcrição e/ou pós-transcrição da subunidade catalítica de TERT. Resultados obtidos a partir da análise de centralidade da rede juntamente com dados de microarranjos derivados de tumores foram utilizados para conceber um modelo dinâmico da regulação de TERT em câncer. Com base nestes resultados, foi gerado um modelo hipotético no qual a expressão de TERT pode ser transitória ou induzida por espécies reativas de oxigênio, aumentando a sobrevivência de diferentes tipos de tumores, como o glioblastoma. Este estudo fornece novas evidências para a relação entre senescência e câncer. Além disso, esta hipótese, se verificada experimentalmente, pode permitir a formulação de novas abordagens quimioterapêuticas para o tratamento de gliobastomas. / Gliomas are the majority of central nervous system tumours, being glioblastoma the most malign among them. The treatment for these tumors is still inefficient and survival average of patients is approximately one year after diagnosis. Surgical removal, if possible, followed by radiotherapy and chemotherapy is the standard treatment. The trend is that chemotherapy assumes a greater role, since it allows the activation of antitumour mechanisms, such as cellular senescence. This mechanism has potential to induce irreversible loss of division ability in tumor cells. Resveratrol and quercetin, two natural polyphenols, are able to induce senescence in different cancer models, including glioblastoma. Resveratrol and quercetine are molecules with pleiotropic effects and leads to SIRT1 activation. SIRT1 is a histone deacetylase (HDAC) which has been linked positively to cancer development. Therefore, we analyzed the ability of sodium butyrate, a HDAC class I and II inhibitor combined with resveratrol or quercetin to induce senescence in glioblastoma cell lines. Results show a combined effect of sodium butyrate and these polyphenols to induce senescence in U87 and C6 cell lines, but not in normal rat astrocytes. Co-treatments induce a loss of proliferative capacity and increase the number of positive cells for β-galactosidase, a senescence marker. These results were accompanied with cell cycle arrest in G2 checkpoint in U87, but no effect on cell cycle phase‟s distribution in C6 was observed. Western blott analysis suggests that these arrests are result of tumour suppressor p21 increase. Moreover, co-treatments increased reactive oxygen species, but not gamma-H2AX levels (a damage marker). The data underline that tumor cells can be driven towards cellular senescence by sodium butyrate combined with polyphenols, which may further arise as a possibility for tumor suppression. On the other hand, one of the challenging problems in biology and medicine is to understand how pre-cancerous or cancer cells enter in senescence or can avoid it. The key to understanding senescence induction and its bypass is the telomerase (TERT), which is present in 85 % of tumors. In a second part of this thesis, system biology tools were used to design a human cancer-senescence network with the aim to study the relationship between senescence and cancer (included glioblastoma). The results show a direct interaction between TERT and oncogenes such as MYC, E2F1, AKT1 and ABL1, which can induce senescence. Moreover, a strong metabolic association between these oncogenes and their ability to induce senescence was shown by gene ontology analysis. These oncogenes also act as transcriptional and/or post-transcriptional regulators of TERT catalytic subunit. Results obtained from centrality analysis and microarray data derived from tumors were used to design a dynamic model for TERT regulation in cancer. Based on these results, a hypothetical model was generated in which TERT expression may be transient or induced by reactive oxygen species, increasing the survival of different tumor types, such as glioblastoma. This study provides new evidence for the relationship between senescence and cancer. Furthermore, this hypothesis, if experimental verified, can enable the development of new chemotherapy approaches to glioblastoma treatment. and ABL1, which can induce senescence. Moreover, a strong metabolic association between these oncogenes and their ability to induce senescence was shown by gene ontology analysis. These oncogenes also act as transcriptional and/or post-transcriptional regulators of TERT catalytic subunit. Based on these results, a hypothetical model was generated in which TERT expression may be transient or induced by reactive oxygen species, increasing the survival of different tumor types, such as glioblastoma. This study provides new evidence for the relationship between senescence and cancer. Furthermore, this hypothesis, if experimental verified, can enable the development of new chemotherapy approaches.

Autofagia é o processo de degradação de componentes próprios celulares e parece modular senescência e apoptose induzidas por diferentes tipos de injúria, incluindo dano ao DNA. Populacionalmente, autofagia ocorre logo após o dano ao genoma, enquanto senescência é a resposta crônica das células que resistem à morte celular. Até o momento, nenhum trabalho demonstrou o papel da autofagia na senescência de fato, principalmente considerando uma análise integrada com morte celular e a ocorrência destes mecanismos a nível de células únicas. Inicialmente, desenvolvemos uma metodologia para avaliação do tamanho e forma de núcleos de células eucarióticas em cultura, a Análise Morfométrica Nuclear, a qual foi validada para análise de apoptose, senescência e irregularidades nucleares. O segundo objetivo foi avaliar o papel da autofagia na senescência e morte celular induzidas por dano ao DNA em células de glioblastoma, e os mecanismos moleculares por trás desta relação. Para isso, células expressando estavelmente o marcador de autofagia GFP-LC3 foram tratadas com o indutor de dano ao DNA Temozolomida (TMZ), droga de escolha contra glioblastomas, por 3h seguido do replaqueamento em meio livre de droga. TMZ induziu autofagia transiente e ativação de AMPK-ULK1 e p38 MAPK, acompanhado da supressão crônica da via PI3K/Akt/mTOR. O tratamento com TMZ induziu aumento de vários marcadores de senescência celular a longo prazo, cuja cinética foi analisada de maneira integrada e correlativa, bem como aumentou níveis de ROS, os quais mediaram, ao menos parcialmente, a indução de autofagia e senescência. Considerando a relação entre autofagia e senescência, observamos uma correlação negativa forte entre os mecanismos a nível populacional. Por outro lado, a nível de células únicas esta correlação não foi observada. Através do acompanhamento de células únicas nós observamos também uma redução orquestrada da autofagia independente da aquisição de fenótipo senescente. Esta redução ocorreu antes, durante ou após o aumento da área celular que caracteriza senescência celular, mostrando que a redução da autofagia não é necessária para aquisição do fenótipo senescente. Finalmente, a ativação da autofagia aumentou o efeito pró-senescente da TMZ, enquanto a supressão da autofagia induziu apoptose e reduziu a senescência, sugerindo que a autofagia protege as células da morte celular e permite a entrada das células em estado senescente após tratamento com TMZ. Neste sentido, também discutimos aqui a importância da análise completa e integrada das alterações em mecanismos de proliferação e morte celular induzidas pela inibição da autofagia. Em conclusão, autofagia e senescência parecem ser repostas induzidas por um mesmo sinal mas com cinéticas diferentes nas células expostas a dano ao DNA, estabelecendo uma correlação negativa a nível populacional que não se confirma a nível de células únicas. / Autophagy is the process of degradation of own cellular components and appears to modulate senescence and apoptosis induced by different types of injury, including DNA damage. At a population level, autophagy occurs soon after the damage to the genome, while senescence is chronic response of cells that resist to cell death. To date , no study has demonstrated the role of autophagy in senescence indeed, especially considering an integrated analysis with cell death and the occurrence of these mechanisms at the level of single cells. This thesis consists of two main objectives. Initially, we developed a method to evaluate the shape and size of nuclei of eukaryotic cells in culture, called Morphometric Analysis Nuclear, which was validated for the analysis of apoptosis, senescence and nuclear irregularities. The second objective was to evaluate the role of autophagy in senescence and cell death induced by DNA damage in glioblastoma cells, and the molecular mechanisms behind this relationship. For this, cells stably expressing the autophagy marker GFP- LC3 were treated for 3h with the DNA alkylating agent Temozolomide (TMZ), the drug of choice against glioblastomas, followed by replating in drug-free medium. TMZ induced autophagy and transient activation of AMPK-ULK1 axis and p38 MAPK, accompanied by chronic suppression of the PI3K/Akt/mTOR pathway. The treatment with TMZ induced an increase of several markers of cellular senescence at long term, whose kinetics was analyzed and integrated correlative manner. TMZ also increased ROS levels which mediated, at least in part, the induction of senescence and autophagy . Considering the relationship between autophagy and senescence, we observed a strong negative correlation between the mechanisms at the population level. On the other hand, at a single cell level this correlation was not observed. Through the monitoring of single cells we also observed an orchestrated reduction of autophagy, independently of the senescent phenotype acquisition. This reduction occured before, during or after increasing the cell area featuring cellular senescence, showing that the reduction of autophagy is not required for the acquisition of the senescent phenotype. Finally , activation of the autophagy increased pro- senescent effect of TMZ, while autophagy inhibition triggered apoptosis and reduced senescence, suggesting that autophagy protects cells from cell death and allows senescence entry after treatment with TMZ. In this sense, we also discuss here the importance of comprehensive and integrated analysis of changes in mechanisms of proliferation and cell death induced by autophagy inhibition. In conclusion , autophagy and senescence responses appear to be induced by the same signal but with different kinetics after DNA damage, establishing a negative correlation at a population level that is not confirmed at the level of single cells.

Autofagia é o processo de degradação de componentes próprios celulares e parece modular senescência e apoptose induzidas por diferentes tipos de injúria, incluindo dano ao DNA. Populacionalmente, autofagia ocorre logo após o dano ao genoma, enquanto senescência é a resposta crônica das células que resistem à morte celular. Até o momento, nenhum trabalho demonstrou o papel da autofagia na senescência de fato, principalmente considerando uma análise integrada com morte celular e a ocorrência destes mecanismos a nível de células únicas. Inicialmente, desenvolvemos uma metodologia para avaliação do tamanho e forma de núcleos de células eucarióticas em cultura, a Análise Morfométrica Nuclear, a qual foi validada para análise de apoptose, senescência e irregularidades nucleares. O segundo objetivo foi avaliar o papel da autofagia na senescência e morte celular induzidas por dano ao DNA em células de glioblastoma, e os mecanismos moleculares por trás desta relação. Para isso, células expressando estavelmente o marcador de autofagia GFP-LC3 foram tratadas com o indutor de dano ao DNA Temozolomida (TMZ), droga de escolha contra glioblastomas, por 3h seguido do replaqueamento em meio livre de droga. TMZ induziu autofagia transiente e ativação de AMPK-ULK1 e p38 MAPK, acompanhado da supressão crônica da via PI3K/Akt/mTOR. O tratamento com TMZ induziu aumento de vários marcadores de senescência celular a longo prazo, cuja cinética foi analisada de maneira integrada e correlativa, bem como aumentou níveis de ROS, os quais mediaram, ao menos parcialmente, a indução de autofagia e senescência. Considerando a relação entre autofagia e senescência, observamos uma correlação negativa forte entre os mecanismos a nível populacional. Por outro lado, a nível de células únicas esta correlação não foi observada. Através do acompanhamento de células únicas nós observamos também uma redução orquestrada da autofagia independente da aquisição de fenótipo senescente. Esta redução ocorreu antes, durante ou após o aumento da área celular que caracteriza senescência celular, mostrando que a redução da autofagia não é necessária para aquisição do fenótipo senescente. Finalmente, a ativação da autofagia aumentou o efeito pró-senescente da TMZ, enquanto a supressão da autofagia induziu apoptose e reduziu a senescência, sugerindo que a autofagia protege as células da morte celular e permite a entrada das células em estado senescente após tratamento com TMZ. Neste sentido, também discutimos aqui a importância da análise completa e integrada das alterações em mecanismos de proliferação e morte celular induzidas pela inibição da autofagia. Em conclusão, autofagia e senescência parecem ser repostas induzidas por um mesmo sinal mas com cinéticas diferentes nas células expostas a dano ao DNA, estabelecendo uma correlação negativa a nível populacional que não se confirma a nível de células únicas. / Autophagy is the process of degradation of own cellular components and appears to modulate senescence and apoptosis induced by different types of injury, including DNA damage. At a population level, autophagy occurs soon after the damage to the genome, while senescence is chronic response of cells that resist to cell death. To date , no study has demonstrated the role of autophagy in senescence indeed, especially considering an integrated analysis with cell death and the occurrence of these mechanisms at the level of single cells. This thesis consists of two main objectives. Initially, we developed a method to evaluate the shape and size of nuclei of eukaryotic cells in culture, called Morphometric Analysis Nuclear, which was validated for the analysis of apoptosis, senescence and nuclear irregularities. The second objective was to evaluate the role of autophagy in senescence and cell death induced by DNA damage in glioblastoma cells, and the molecular mechanisms behind this relationship. For this, cells stably expressing the autophagy marker GFP- LC3 were treated for 3h with the DNA alkylating agent Temozolomide (TMZ), the drug of choice against glioblastomas, followed by replating in drug-free medium. TMZ induced autophagy and transient activation of AMPK-ULK1 axis and p38 MAPK, accompanied by chronic suppression of the PI3K/Akt/mTOR pathway. The treatment with TMZ induced an increase of several markers of cellular senescence at long term, whose kinetics was analyzed and integrated correlative manner. TMZ also increased ROS levels which mediated, at least in part, the induction of senescence and autophagy . Considering the relationship between autophagy and senescence, we observed a strong negative correlation between the mechanisms at the population level. On the other hand, at a single cell level this correlation was not observed. Through the monitoring of single cells we also observed an orchestrated reduction of autophagy, independently of the senescent phenotype acquisition. This reduction occured before, during or after increasing the cell area featuring cellular senescence, showing that the reduction of autophagy is not required for the acquisition of the senescent phenotype. Finally , activation of the autophagy increased pro- senescent effect of TMZ, while autophagy inhibition triggered apoptosis and reduced senescence, suggesting that autophagy protects cells from cell death and allows senescence entry after treatment with TMZ. In this sense, we also discuss here the importance of comprehensive and integrated analysis of changes in mechanisms of proliferation and cell death induced by autophagy inhibition. In conclusion , autophagy and senescence responses appear to be induced by the same signal but with different kinetics after DNA damage, establishing a negative correlation at a population level that is not confirmed at the level of single cells.

Os gliomas representam a maioria dos tumores do sistema nervoso central, sendo o glioblastoma o mais maligno entre eles. O tratamento destes tumores ainda é ineficiente e a sobrevida média dos pacientes é de aproximadamente um ano após o diagnóstico. A remoção cirúrgica, quando possível, acompanhada de radioterapia e quimioterapia é o tratamento padrão. A tendência é que a quimioterapia assuma um papel mais importante, uma vez que possibilita a ativação de mecanismos endógenos antitumorais, como senescência celular. Este mecanismo possui potencial de induzir a perda irreversível da capacidade da divisão de células tumorais. O resveratrol e a quercetina, dois polifenóis naturais, induzem senescência em diferentes linhagens tumorais, incluindo os glioblastomas. Ambos têm efeitos pleiotrópicos e induzem a ativação de vários alvos moleculares, sendo SIRT1, um desses alvos. SIRT1 é uma histona desacetilase (HDAC) associada ao desenvolvimento de vários tipos de tumores. Por este motivo, foi avaliada a indução de senescência em células de glioblastomas pelo resveratrol e quercetina combinados com butirato de sódio, um inibidor de HDAC classe I e II. Os resultados mostram um efeito combinado do butirato de sódio e estes polifenóis para induzir a senescência nas linhagens celulares U87 e C6, mas não em astrócitos normais de ratos. Os co-tratamentos induzem perda de capacidade proliferativa e aumento do número de células positivas para β-galactosidase, um marcador de senescência. Estes resultados foram acompanhados de parada no ciclo celular na fase G2 na linhagem U87, mas nenhum efeito foi observado sobre o ciclo de células C6. A análise por Western Blot sugere o aumento do supressor tumoral p21 após co-tratamentos. Além disso, o co-tratamento com quercetina e butirato de sódio aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio, mas não os níveis de gama-H2AX (um marcador de dano). Estes dados sugerem que o butirato de sódio em combinação com os polifenóis tem potencial terapêutico para a supressão de glioblastomas. Por outro lado, um dos problemas em biologia e medicina é entender como células pré-cancerosas e cancerosas entram em senescência ou conseguem evitá-la. A chave para a compreensão da indução da senescência e do seu bypass é a ativação da enzima telomerase (TERT), presente em 85 % dos tumores. Na segunda parte desta tese, ferramentas de biologia de sistemas foram utilizadas para projetar uma rede câncer e senescência humana com o objetivo de estudar a relação entre senescência e câncer (incluindo glioblastoma). Os resultados mostram uma interação direta entre TERT e oncogenes como MYC, E2F1, AKT1 e ABL1, que podem induzir a senescência. Além disso, uma associação metabólica forte entre estes oncogenes e sua capacidade de induzir senescência foi mostrada através de análise por ontologia gênica. Estes oncogenes também atuam como reguladores da transcrição e/ou pós-transcrição da subunidade catalítica de TERT. Resultados obtidos a partir da análise de centralidade da rede juntamente com dados de microarranjos derivados de tumores foram utilizados para conceber um modelo dinâmico da regulação de TERT em câncer. Com base nestes resultados, foi gerado um modelo hipotético no qual a expressão de TERT pode ser transitória ou induzida por espécies reativas de oxigênio, aumentando a sobrevivência de diferentes tipos de tumores, como o glioblastoma. Este estudo fornece novas evidências para a relação entre senescência e câncer. Além disso, esta hipótese, se verificada experimentalmente, pode permitir a formulação de novas abordagens quimioterapêuticas para o tratamento de gliobastomas. / Gliomas are the majority of central nervous system tumours, being glioblastoma the most malign among them. The treatment for these tumors is still inefficient and survival average of patients is approximately one year after diagnosis. Surgical removal, if possible, followed by radiotherapy and chemotherapy is the standard treatment. The trend is that chemotherapy assumes a greater role, since it allows the activation of antitumour mechanisms, such as cellular senescence. This mechanism has potential to induce irreversible loss of division ability in tumor cells. Resveratrol and quercetin, two natural polyphenols, are able to induce senescence in different cancer models, including glioblastoma. Resveratrol and quercetine are molecules with pleiotropic effects and leads to SIRT1 activation. SIRT1 is a histone deacetylase (HDAC) which has been linked positively to cancer development. Therefore, we analyzed the ability of sodium butyrate, a HDAC class I and II inhibitor combined with resveratrol or quercetin to induce senescence in glioblastoma cell lines. Results show a combined effect of sodium butyrate and these polyphenols to induce senescence in U87 and C6 cell lines, but not in normal rat astrocytes. Co-treatments induce a loss of proliferative capacity and increase the number of positive cells for β-galactosidase, a senescence marker. These results were accompanied with cell cycle arrest in G2 checkpoint in U87, but no effect on cell cycle phase‟s distribution in C6 was observed. Western blott analysis suggests that these arrests are result of tumour suppressor p21 increase. Moreover, co-treatments increased reactive oxygen species, but not gamma-H2AX levels (a damage marker). The data underline that tumor cells can be driven towards cellular senescence by sodium butyrate combined with polyphenols, which may further arise as a possibility for tumor suppression. On the other hand, one of the challenging problems in biology and medicine is to understand how pre-cancerous or cancer cells enter in senescence or can avoid it. The key to understanding senescence induction and its bypass is the telomerase (TERT), which is present in 85 % of tumors. In a second part of this thesis, system biology tools were used to design a human cancer-senescence network with the aim to study the relationship between senescence and cancer (included glioblastoma). The results show a direct interaction between TERT and oncogenes such as MYC, E2F1, AKT1 and ABL1, which can induce senescence. Moreover, a strong metabolic association between these oncogenes and their ability to induce senescence was shown by gene ontology analysis. These oncogenes also act as transcriptional and/or post-transcriptional regulators of TERT catalytic subunit. Results obtained from centrality analysis and microarray data derived from tumors were used to design a dynamic model for TERT regulation in cancer. Based on these results, a hypothetical model was generated in which TERT expression may be transient or induced by reactive oxygen species, increasing the survival of different tumor types, such as glioblastoma. This study provides new evidence for the relationship between senescence and cancer. Furthermore, this hypothesis, if experimental verified, can enable the development of new chemotherapy approaches to glioblastoma treatment. and ABL1, which can induce senescence. Moreover, a strong metabolic association between these oncogenes and their ability to induce senescence was shown by gene ontology analysis. These oncogenes also act as transcriptional and/or post-transcriptional regulators of TERT catalytic subunit. Based on these results, a hypothetical model was generated in which TERT expression may be transient or induced by reactive oxygen species, increasing the survival of different tumor types, such as glioblastoma. This study provides new evidence for the relationship between senescence and cancer. Furthermore, this hypothesis, if experimental verified, can enable the development of new chemotherapy approaches.