The Human Papillomavirus (HPV) is a virus of the Papillomaviridae family and its genome consists of DNA. It is the main cause of viral sexual transmission. Cervical cancer or uterine colon cancer is the second most common occurrence among women worldwide. Recent studies have proven that some types of HPV are mainly responsible for the development of this type of cancer. In accordance to its oncogenic activity this viral group was divided in low and high risk types. Brazil does not have a representative amount of data related to the prevalence of HPV infection. The incidence data of the virus is obtained through the analysis of carriers of the invasive carcinoma of uterine colon, cervical intraepithelial neoplasias, and others types of infections associated. Molecular assays have been showing throughout the years an excellent sensitivity and specificity in the detection of the HPV s DNA. Nowadays, in situ hybridization techniques are being used as method of choice for the detection of the viral DNA. In many studies, the Polymerase Chain Reaction (PCR) with the application of the primers MY09 and MY11 have shown efficiency in viral tracking, consequently, the development of molecular diagnostics allow monitoring of the disease, decreasing mortality rates caused by cancer of the cervix. The DNA sequencing is an efficient methodology used for the molecular characterization of the viral types, which allows the accomplishment of the alignment for similarity of the sequences obtained through others that were already identified and deposited in the GenBank. The current study s purpose was to identify the different types of HPV and the presence of co-infections through PCR and sequencing of a hyper-variable region of the L1 gene. The studied sample consisted of 515 female volunteers, which 111 (21.55%) presented the incidence of the HPV DNA. Within the acquired specimens, 50% were considered high oncogenic risk (the major incidence was types 16 and 58) and 7.21% had multiple infection. The determination of the base sequencing of the L1 gene is essential to the identification of the viral type. However, the sequencing of the complete gene and both DNA chains become financially unviable for the majority of the specialized laboratories. A practical approach applied in this study was to determine the sequencing of a specific region of the L1 gene with 450pb, where the identification of the HPV became possible by following this methodology. The techniques used showed the necessity of the application of a more sensible and specific viral diagnosis, which contributes to the viral infection control and to the reduction of the mortality rate caused by cervical cancer. / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Alagoas / O Papilomavírus Humano (HPV) é um vírus da família Papillomaviridae e possui o seu genoma constituído de DNA. É o causador da transmissão sexual viral de maior frequência. O câncer cervical ou câncer de colo de útero possui a segunda maior ocorrência nas mulheres de todo o mundo. Estudos recentes têm comprovado que alguns tipos de HPV são os principais responsáveis pelo desenvolvimento deste tipo de câncer. De acordo com a sua atividade na carninogênese esse grupo viral foi dividido em tipos de baixo e de alto risco oncogênico. O Brasil ainda não possui uma quantidade representativa de dados relacionados à prevalência de infecção por HPV, os dados de incidência do vírus são obtidos através da análise de portadores de carcinoma invasivo de colo uterino, neoplasias intraepiteliais cervicais e outros tipos de infecções associadas. Ensaios moleculares vêm mostrando ao longo dos anos uma alta sensibilidade e especificidade na detecção do DNA do HPV. Atualmente são utilizadas técnicas de hibridização como método de escolha para a detecção do DNA viral. Em muitos estudos a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) com a aplicação dos primers MY09 e MY11 demonstrou eficiência no rastreamento viral, consequentemente, o desenvolvimento desse diagnóstico molecular possibilitaria o monitoramento da doença, diminuindo as taxas de mortalidade causada pelo câncer de colo do útero. O sequenciamento de DNA é uma metodologia eficiente para a caracterização molecular dos tipos virais, permitindo a realização do alinhamento por similaridade das sequencias obtidas com outras já identificadas e depositadas no GenBank. O presente trabalho teve como propósito identificar os diferentes tipos de HPV e a presença de co-infecções, através de PCR e sequenciamento de uma região hipervariável do gene L1. A amostra estudada foi composta de 515 voluntárias das quais 111 (21,55%) apresentaram a presença do DNA do HPV. Entre os espécimes encontrados 50% são considerados de alto risco oncogênico (maior incidência dos tipos 16 e 58) e 7,21% possuíam infecção múltipla. A determinação das sequencias de base do gene L1 é fundamental para a identificação do tipo viral. Entretanto o sequenciamento do gene completo e em ambos os sentidos da cadeia de DNA se tornam inviáveis financeiramente para a maioria dos laboratórios especializados. Uma abordagem prática aplicada no estudo foi determinar a sequencia de uma região específica do gene L1 contendo 450pb, sendo possível a identificação do HPV seguindo essa metodologia. As técnicas utilizadas mostraram a necessidade da aplicação de um diagnóstico viral mais sensível e específico, contribuindo para o controle da infecção viral e para a diminuição da incidência e da mortalidade causadas pelo câncer cervical.

Orientadores: Clarice Weis Arns, Isabela Cristina Simoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T00:22:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernandes_MariaJuditeBittencourt_D.pdf: 1711625 bytes, checksum: d2876be51222b1ba7526b13ab7a72795 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A doença infecciosa da bursa (IBD), denominada também doença de Gumboro, é uma doença aguda, imunossupressora, altamente contagiosa de aves jovens e de grande importância econômica para a avicultura. O vírus da doença infecciosa da bursa (IBDV), sorotipo 1, pode ser classificado de acordo com sua antigenicidade e patogenicidade em amostras clássicas virulentas (cv), atenuadas, variantes antigênicas ou muito virulentas (vv). Estas diferenças antigênicas são encontradas na região hipervariável do gene VP2, que é responsável pela indução de anticorpos neutralizantes e também dos possíveis marcadores de virulência que ainda não estão bem estabelecidos. O gene VP1 parece também apresentar um papel na virulência do vírus. Primeiramente, o objetivo do presente trabalho foi a identificação e caracterização molecular de 66 amostras brasileiras de IBDV através da RT-PCR de um fragmento do gene VP2 seguida pela digestão por enzimas de restrição (RE) e posterior confirmação pelo sequenciamento. A análise da RT-PCR/RE classificou 25 isolados como cepas vv e 16 como cepas cv além da classificação de 6 grupo moleculares. O sequenciamento também confirmou esta classificação com a presnça dos aminoácidos (aa) típicos das amostras vv (222A, 242I, 256I e 294I). Em 3 destes amostras vv também se observou mutações únicas que mostram pequenas, mas contínuas alterações dos vvIBDV circulantes nas granjas brasileiras. A arvore filogenética confirmou a origem comum das nossas amostras vv com os isolados de outros países assim como a origem monofilética destas amostras. Posteriormente foi feito a RT-PCR de um fragmento representativo do gene VP1 das amostras positivas para IBDV e a análise das sequências e filogenética. Quatorze amostras vv e três cv tiveram êxito nas sequências analisadas. Treze amostras vv apresentaram as substituições de aa comuns para as amostras vv (145T, 146D, 147N e 242E), exceto um que apresentou a sequência das amostras cv e na filogenia agrupou-se com estas amostras. A árvore a partir da VP1 pressupõe um rearranjo genético deste gene. Esta amostra com perfil do segmento A de amostra vv e do segmento B de cv seria o primeiro relato no Brasil de um rearranjo genético natural. Estes rearranjos de segmentos que também foram observados em amostras de outros países ou que podem ser produzidos em laboratório (quimeras) mostram que o segmento B pode estar contribuindo para a patogênese deste vírus. A origem destes rearranjos pode ser de troca genética com o uso de vacinas vivas ou se aceita a hipótese de que o segmento VP1 dos vvIBDV se originaram de um rearranjo genético de fonte desconhecida, estes rearranjos com segmento vvVP2 e cvVP1, seriam descendentes dos ancentrais dos vvVP1. Apenas um seqüenciamento completo das duas sequências e estudos in vivo poderão caracterizar o papel da VP1 na virulência desta amostra. Assim, o monitoramento contínuo das amostras de IBDV através da caracterização molecular pela análise das sequências dos genes e a detecção de alterações genéticas que possam influenciar a patogenicidade do vírus são de extrema importância, pois geram informações fundamentais que possibilitam e subsidiam o controle desta doença no Brasil / Abstract: Infectious bursal disease virus (IBDV) causes a disease among young chickens of great economic importance to the poultry industry worldwide both for the both mortality as the immunosuppression. Two distinct serotypes, 1 and 2, of IBDV are recognized. Only the serotype 1 is pathogenic for chickens and classified according to the antigenicity and/or pathogenicity in classical virulent (cv) strains, very virulent (vv) strains, antigenic variant strains, and attenuated strains. This classification has been based mainly on the VP2 gene sequence, more specifically on the hypervariable region corresponding to the induction of neutralizing antibodies and the serotype specificity. However, the fundamental molecular basis for pathogenicity is not yet clear. Studies with the VP1 gene have also shown its possible role in this virulence and pathogenicity. Firstly, the aim of the present paper was the molecular characterization of sixty-six Brazilian IBDV isolates from broiler and layers flocks during the period from 1997 to 2005 by RT-PCR followed by restriction enzyme analysis of a fragment from VP2 gene variable region. Sequence and phylogenetic analysis of the positive isolates were also carried out. Twenty-five of the isolates were identified as very virulent (vv) and sixteen as classic virulent (cv). All of vv isolates had the typical amino acid (aa) residues and clustered in a phylogenetic tree with the vvIBDV strains. Three vv isolates presented four common aa substitutions and differed from other vv strains indicating that the vvIBDVs circulating on Brazilian farms are undergoing slight but continuous exchanges. Furthermore, the Brazilian IBDV isolates characterized by the VP2 sequence in cv and vv strains were analyzed by the sequence and phylogeny of the VP1 gene fragment. Our vv isolates maintained clustered with the other vvIBDVs in phylogenetic tree obtained from the VP1 gene and presented the common aa too. The same occurred with the cv isolates. However, one isolate vv showed both characters, cv and vv into VP1 sequence and clustered with the ours and other cv isolates in the tree. This isolate has similar type of a reassortment / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular