Orientador: Prof. Dr. Sergio Daishi Sasaki / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2015. / Embora a doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC)seja uma das maiores causas de morbidade e mortalidade no mundo, ainda não há tratamento que reverta àdestruição do parênquima pulmonarobservadas nestes pacientes. O desenvolvimento de modelos experimentais,que mimetizam as características e os mecanismos fisiopatológicos envolvidos no enfisema,por meioda instilação de uma protease,éde extrema relevância uma vez que podem contribuirpara o desenvolvimento de futuras estratégias terapêuticas. Uma das causas atribuídas para o aparecimento da doença éo tabagismo, no entanto, fatores genéticose fatoresambientais como a poluição também estão envolvidos com o aparecimento da doença em humanos. Algumas enzimas estão envolvidas no processo de instalação da doença como as metaloproteases 9 e 12 e as serinoproteases, especificamente a elastase de neutrófilos humana. Em um projeto anterior,utilizando o inibidor de serinoproteases recombinante rBmTI-Ano modelo de indução deenfisema pulmonar em camundongos,foi observado que esta molécula é capaz de interferir na progressão do enfisema pulmonar, o rBmTI-A é um inibidor pertencente à família Kunitz-BPTI e possui dois domínios inibitórios com atividade sobre tripsina, calicreína plasmática humana e elastase de neutrófilos humana. Neste projeto,foi utilizadooinibidor rBmTI-6,também pertencente à família Kunitz-BPTI,porém contendo três domínios inibitórios com atividade sobre tripsina bovinae plasmina. Uma amostra de rBmTI-6 previamente purificada por cromatografia de afinidadeem tripsina-sepharosefoiaplicada emuma cromatografia de troca iônica, coluna Resource Q,que separou osdomínios inibitóriosem domínio 1 (rBmTI-6-d1)e domínios 2e 3 (rBmTI-6-d2/3). O rBmTI-6-d1teve suaconcentraçãoativa determinada em 1,5µMe a constante de inibição (Ki)sobre tripsina bovina determinado em 1,95nM, este domínio purificado apresentou 77% de atividade específica (inibidor ativo em relação à proteína total da amostra). O rBmTI-6-d1 foi utilizado em um experimentono modelo experimental de enfisema pulmonar.Neste experimento o enfisema foi induzido utilizando a instilação por via nasal de elastase pancreática porcina(PPE)e 1 hora depois da instilaçãocom PPEfoi feito o tratamento coma instilaçãorBmTI-6-d1. Vinte e um dias após a instilação de PPEe rBmTI-6-d1 foi feita a analise da função respiratória para os14 parâmetros de elastância tecidual (Htis),resistência tecidual (Gtis)eresistência das vias aéreas (Raw). Animais induzidos ao enfisema e tratados com o rBmTI-6-d1apresentaram valores de elastância tecidual (Htis)e resistência tecidual (Gtis) próximasaosvalores dosgrupos controles, cujos animais não foram induzidos ao enfisema, os animais não tratados com rBmTI-6-d1 apresentaram aumento de Htis e Gtis. Para o parâmetro de resistência das vias aéreas o resultado mostra uma tendência de redução deste parâmetro para animais tratados com rBmTI-6-d1. Os resultados da medida do intercepto linear médio (Lm), apontam uma tendência ao grupo que foi induzido ao enfisema e tratado com rBmTI-6-d1 de redução da Lm em comparação com o grupo induzido ao enfisema e não tratado.Estes resultados sugerem que o inibidor teve papel de prevenir a instalação do enfisema pulmonar nos animais tratados com rBmTI-6-d1. / Although chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is a major cause of morbidity and mortality worldwide, there is no treatment to reverse the destruction of the lung parenchymaobserved in these patients. The development of experimental models that mimic the characteristics and pathophysiological mechanisms of emphysema by instillationone protease is extremely important since it can contribute to the development of future therapeutic strategies. One of the causes associated with the onset of the disease is smoking, however, genetic factors and environmental factors such as pollutionare also involved in disease in humans. Some enzymes are involved in the installation process of the disease like metalloproteases 9 and 12 and serineproteases, specifically human neutrophil elastase. In a previous study using recombinant serineprotease inhibitor rBmTI-A in a pulmonary emphysema model with mice was observed that this molecule is capable of interfering with the progression of the disease, rBmTI-A is an inhibitor belongingto the Kunitz-BPTI family and has two inhibitory domains with activity towardtrypsin, human plasmakallikreinand human neutrophil elastase. In this project, a sample of rBmTI-6 inhibitor also belongs to the Kunitz-BPTI family, previously purified by affinity chromatography on trypsin-sepharose was used, the sample was purified again using an ion exchange chromatography with Resource Q column, where it was observed a separation of the inhibitory domains. The domain 1 (rBmTI-6-d1) had their active concentration determined in 1,5?M. The rBmTI-6-d1 had a Ki on certain bovine trypsin in 1,95nM this purified domain had 77% specific activity (active inhibitor in the total protein of the sample). The rBmTI-6-d1 was selectedfor the experiments with an experimental model of pulmonary emphysema. In these experiments emphysema was induced by intranasal instillation of porcine pancreatic elastase (PPE) and 1 hour after PPE instillation, the treatment with rBmTI-6-d1. Twenty-one days after instillation of PPE and rBmTI-6-d1 was made the analysis of respiratory function to tissue elastance parameters (Htis), tissue resistance (Gtis) and airway resistance (Raw). Animals induced emphysema and treated with rBmTI-6-d1 showedtissue elastance values (Htis) and tissue resistance (Gtis) close to the values of the control groups, whose animals were not induced emphysema, untreated animals with rBmTI-6-d1 increased by Htis and Gtis. For the air way resistance the result shows a tendency to decrease in this parameter for animals treated with rBmTI-6-d1. The results of measuring the mean linear intercept (Lm), show a tendency to emphysema group that was induced and treated with -rBmTI6-d1 Lm reduced in comparison with the experimental group and the untreated emphysema. These results suggest that the inhibitory role was to prevent the development of pulmonary emphysema in animals treated with rBmTI6-d1.

Amblyomin-X é um inibidor de serinoprotease do tipo kunitz obtido de uma biblioteca de cDNA das glândulas salivares do carrapato Amblyomma cajannense. Dados preliminares mostraram que a injeção in vivo de Amblyomin-X reduziu a formação de massa tumoral induzida por células de melanoma B16F10 em camundongos. Com base neste dado e na ação de inibidores de serinoproteases sobre a angiogênese, este projeto foi delineado para caracterizar as ações do Amblyomin-X sobre a angiogênese in vivo e sobre funções da célula endotelial in vitro na vigência do fator de crescimento VEGF-A. Os efeitos do Amblyomin-X sobre a cinética de formação de novos vasos na rede microcirculatória in vivo foram investigados no modelo de câmara dorsal em camundongos e na membrana corioalantóica. Empregando cultura de células endoteliais de linhagem de microcirculação (t-End), foram avaliados os efeitos do Amblyomin-X sobre viabilidade e citoproteção celular (anexina e iodeto de propídio - PI), proliferação celular (incorporação do fluoróforo diacetato de carboxi-fluoresceína succinimidil éster) e ciclo celular, além da expressão das moléculas de adesão PECAM-1, ICAM-1, VCAM-1, β1 e β3 integrinas em ensaios de citometria de fluxo. A aderência celular em Matrigel foi quantificada por espectrofotometria, a formação de tubos foi mensurada por microscopia óptica e a expressão gênica das moléculas de adesão PECAM-1, ICAM-1 e VCAM-1 por RT-PCR. Os dados obtidos mostraram que a aplicação tópica do Amblyomin-X (100ng/10µL) reduziu a formação de novos vasos no tecido subcutâneo dorsal de camundongos, quando o tratamento foi iniciado anterior ou concomitantemente, mas não posteriormente ao tratamento ao VEGF (10ng/10µL) e, reduziu a formação de novos vasos na membrana corioalantóica, quando administrado concomitantemente com o VEGF (0,25ng/10µL). O Amblyomin-X não alterou a viabilidade de células t-End (1000ng/mL, 72 horas); inibiu a apoptose e apoptose tardia causada por meio de cultura carenciado (100ng/mL); inibiu a proliferação (10, 100 ou 1000ng/mL de Amblyomin-X, 48 e 72 horas); induziu parada nas fases G1/G0 do ciclo celular; diminuiu a aderência e a formação de tubos das células endoteliais; não alterou a expressão basal de PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1, β1 e β3 integrinas, mas reduziu a expressão de PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1 induzida pelo VEGF-A. A redução da expressão protéica da PECAM-1 e ICAM-1 parece não ser dependente de ação do Amblyomin-X na expressão gênica, já que os níveis de RNAm não foram afetados pela ação do Amblyomin-X. Em conjunto, os dados obtidos neste trabalho mostram que o Amblyomin-X inibe a formação de novos vasos in vivo, por interferir, possivelmente, em mecanismos relacionados a sinalização da célula endotelial induzida pelo VEGF-A, em especial com a proliferação, adesão , tubulogênese e expressão de moléculas de adesão da família das imunoglobulinas. / Amblyomin-X is a type-kunitz serineprotease inhibitor obtained from a cDNA library of the Amblyomma cajannense salivary glands. Preliminary data showed that in vivo injection of the protein reduced the formation of tumor-induced B16F10 melanoma cells in mice. Based on this data and on actions of serinorpoteases inhibitors on angiogenesis, this project aimed to characterize the actions of Amblyomin-X on angiogenesis in vivo and on in vitro endothelial cells functions in the presence of the growth factor VEGF. The effects of Amblyomin-X on the in vivo formation of microcirculatory new vessels were investigated in the dorsal chamber model in mice and in the chorioallantoic membrane assay. Mice microvascular endothelial cell lineage (t-End) was employed to evaluate the effects of Amblyomin-X on cytoprotection and cell viability (Annexin-V and propidium iodide-PI), cell proliferation (incorporation of the fluorophore fluorescein diacetate carboxy-succinimidil ester), cell cycle, membrane expression of PECAM-1, ICAM-1, VCAM-1, β1 and β3 integrins adhesion molecules using flow cytometry. Cell adhesion was assessed in matrigel by spectrophotometry, the formation of tubes was measured by optical microscopy and adhesion molecules PECAM-1, ICAM-1 and VCAM-1 gene expression was evaluated by RT-PCR. Data obtained showed that topical application of Amblyomin-X (100ng/10µL) reduced the formation of new vessels, only when Amblyomin-X treatment started before or simultaneously to VEGF-A stimulation (10ng/10µL). Amblyomin-X (100ng/10µL) also reduced the formation of new vessels in the chorioallantoic membrane assay, when coadministered with VEGF (0.25ng/10µL). The Amblyomin-X did not alter the viability of t-End (1000ng/mL, 72 hours), inhibited apoptosis and late apoptosis caused by deprivated serum (100ng/mL), inhibited proliferation (10, 100 or 1000ng/mL, 48 and 72 hours), induced G1/G0 arrest in cell cycle phases, decreased the cell adhesion and tube formation (100ng/mL), did not alter the basal expression of PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1, β1 or β3 integrin, but reduced the PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1 induced by VEGF-A. Impaired PECAM-1 and ICAM-1 expression seems not be dependent on gene expression, as, mRNA levels were not affected by the action of Amblyomin-X. Together, the data obtained shows that the Amblyomin-X inhibits new vessel formation in vivo, by interfering, possibly, with mechanisms related to VEGF-A induced endothelial cell signaling, especially with the proliferation, adhesion, tubulogenesis and expression of adhesion molecules.

A proteína P21 do Trypanosoma cruzi participa no processo de infecção da célula hospedeira, desse modo é de grande importância: elucidar as vias de sinalização induzidas pela proteína, bem como caracterizar a nível molecular e estrutural a P21. O que vai auxiliar no entendimento da função biológica da P21 e sua participação no processo de infecção. A P21 recombinante é expressa Escherichia coli em sua maioria na fração insolúvel. Visando aumento de proteína na fração solúvel, foi realizada a clonagem do gene da P21 em vetor pSMT3, bem como testes de expressão subsequentes em diferentes cepas de expressão de E. coli, em vetor pET-28 e pSMT3 e variadas condições de expressão e lise celular. Desse modo obtiveram-se as condições que permitissem uma maior concentração da P21 na fração solúvel. A expressão foi realizada no vetor pET-28, cepa BL21, a 37°C com meio 2xYT a 0.5 mM de IPTG, utilizando a técnica de sonicação como lise. A P21 foi purificada em cromatografia de afinidade e posteriormente em coluna de exclusão molecular. Foram realizados estudos de modelagem por homologia levaram a elaborar a hipótese de que a P21 tem a função de inibidor de serinoprotease do tipo kunitz. Posteriormente essa hipótese foi confirmada com ensaios de avaliação da atividade inibitória da P21 frente à tripsina, quimiotripsina e elastase neutrofílica, o qual a P21 mostrou capaz de inibir a elastase neutrofílica. Estudos com espalhamento dinâmico da luz (DLS) revelaram que as amostras testadas de P21 contém diferentes concentrações de agregados de alto peso molecular em todos os pHs avaliados. Outras medidas foram realizadas para avaliar o estado de agregação da P21 de acordo com a temperatura e verificou-se que entre 32-52 °C, a proteína apresenta menor raio hidrodinâmico, indicando menor agregação nesse intervalo. Estudos de dicroísmo circular revelaram que a P21 apresenta por volta de 20% de α hélice, 32% de folha-β, 22% de volta e 23 % estrutura randômica. De acordo com a curva de desnaturação referente ao espectro de CD obtido, a P21 se mostra desnaturada a partir de 64°C. / The Trypanosoma cruzi protein P21 participates in the host cell infection process, but its specific function is poorly described. Thus it is important to elucidate the signaling pathways induced by the protein and characterize the P21 at the structural and molecular levels, as a contribution towards the understanding of the P21 biological function and its role in the infection process. The Escherichia coli recombinant P21 is expressed mostly in the insoluble fraction. Aiming to increase protein in the soluble fraction, we performed the cloning of the P21 gene in pSMT3 vector and subsequent expression tests in different expression strains of E. coli in pET-28 and pSMT3 vectors and varied expression conditions and cell lysis. Thus we obtained conditions that allow a greater concentration of the P21 in the soluble fraction. The expression vector was performed using vector pET-28, in Bl21 strain at 37°C in 2xYT culture medium with 0.5 mM IPTG, using the sonication technique in cell lysis. The recombinant P21 was purified by Ni affinity chromatography and subsequently a molecular exclusion column. We performed homology modeling studies which led to assume that P21 can be a serinprotease inhibitor of Kunitz type. Furthermore, this hypothesis was confirmed in the experiments testing the P21 inhibitory activity against the trypsin, chymotrypsin and elastase. We found the P21 exclusively inhibit neutrophil elastase. Studies using dynamic light scattering (DLS) revealed that the samples containing P21 contained large molecular weigth aggregates in different concentrations at all evaluated pHs. Others measurements were performed to assess the P21 aggregation state according to the temperature and we found that between 32-52 °C the protein had a smaller hydrodynamic radius, indicating less aggregation in this range. Circular dichroism (CD) studies revealed that P21 has about 20% α-helix, 32% β, -sheet, 22% turn and 23% of random structure. According to the denaturation curve for the CD spectrum obtained, the P21 was denatured from 64°C.

Amblyomin-X é um inibidor de serinoprotease do tipo kunitz obtido de uma biblioteca de cDNA das glândulas salivares do carrapato Amblyomma cajannense. Dados preliminares mostraram que a injeção in vivo de Amblyomin-X reduziu a formação de massa tumoral induzida por células de melanoma B16F10 em camundongos. Com base neste dado e na ação de inibidores de serinoproteases sobre a angiogênese, este projeto foi delineado para caracterizar as ações do Amblyomin-X sobre a angiogênese in vivo e sobre funções da célula endotelial in vitro na vigência do fator de crescimento VEGF-A. Os efeitos do Amblyomin-X sobre a cinética de formação de novos vasos na rede microcirculatória in vivo foram investigados no modelo de câmara dorsal em camundongos e na membrana corioalantóica. Empregando cultura de células endoteliais de linhagem de microcirculação (t-End), foram avaliados os efeitos do Amblyomin-X sobre viabilidade e citoproteção celular (anexina e iodeto de propídio - PI), proliferação celular (incorporação do fluoróforo diacetato de carboxi-fluoresceína succinimidil éster) e ciclo celular, além da expressão das moléculas de adesão PECAM-1, ICAM-1, VCAM-1, β1 e β3 integrinas em ensaios de citometria de fluxo. A aderência celular em Matrigel foi quantificada por espectrofotometria, a formação de tubos foi mensurada por microscopia óptica e a expressão gênica das moléculas de adesão PECAM-1, ICAM-1 e VCAM-1 por RT-PCR. Os dados obtidos mostraram que a aplicação tópica do Amblyomin-X (100ng/10µL) reduziu a formação de novos vasos no tecido subcutâneo dorsal de camundongos, quando o tratamento foi iniciado anterior ou concomitantemente, mas não posteriormente ao tratamento ao VEGF (10ng/10µL) e, reduziu a formação de novos vasos na membrana corioalantóica, quando administrado concomitantemente com o VEGF (0,25ng/10µL). O Amblyomin-X não alterou a viabilidade de células t-End (1000ng/mL, 72 horas); inibiu a apoptose e apoptose tardia causada por meio de cultura carenciado (100ng/mL); inibiu a proliferação (10, 100 ou 1000ng/mL de Amblyomin-X, 48 e 72 horas); induziu parada nas fases G1/G0 do ciclo celular; diminuiu a aderência e a formação de tubos das células endoteliais; não alterou a expressão basal de PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1, β1 e β3 integrinas, mas reduziu a expressão de PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1 induzida pelo VEGF-A. A redução da expressão protéica da PECAM-1 e ICAM-1 parece não ser dependente de ação do Amblyomin-X na expressão gênica, já que os níveis de RNAm não foram afetados pela ação do Amblyomin-X. Em conjunto, os dados obtidos neste trabalho mostram que o Amblyomin-X inibe a formação de novos vasos in vivo, por interferir, possivelmente, em mecanismos relacionados a sinalização da célula endotelial induzida pelo VEGF-A, em especial com a proliferação, adesão , tubulogênese e expressão de moléculas de adesão da família das imunoglobulinas. / Amblyomin-X is a type-kunitz serineprotease inhibitor obtained from a cDNA library of the Amblyomma cajannense salivary glands. Preliminary data showed that in vivo injection of the protein reduced the formation of tumor-induced B16F10 melanoma cells in mice. Based on this data and on actions of serinorpoteases inhibitors on angiogenesis, this project aimed to characterize the actions of Amblyomin-X on angiogenesis in vivo and on in vitro endothelial cells functions in the presence of the growth factor VEGF. The effects of Amblyomin-X on the in vivo formation of microcirculatory new vessels were investigated in the dorsal chamber model in mice and in the chorioallantoic membrane assay. Mice microvascular endothelial cell lineage (t-End) was employed to evaluate the effects of Amblyomin-X on cytoprotection and cell viability (Annexin-V and propidium iodide-PI), cell proliferation (incorporation of the fluorophore fluorescein diacetate carboxy-succinimidil ester), cell cycle, membrane expression of PECAM-1, ICAM-1, VCAM-1, β1 and β3 integrins adhesion molecules using flow cytometry. Cell adhesion was assessed in matrigel by spectrophotometry, the formation of tubes was measured by optical microscopy and adhesion molecules PECAM-1, ICAM-1 and VCAM-1 gene expression was evaluated by RT-PCR. Data obtained showed that topical application of Amblyomin-X (100ng/10µL) reduced the formation of new vessels, only when Amblyomin-X treatment started before or simultaneously to VEGF-A stimulation (10ng/10µL). Amblyomin-X (100ng/10µL) also reduced the formation of new vessels in the chorioallantoic membrane assay, when coadministered with VEGF (0.25ng/10µL). The Amblyomin-X did not alter the viability of t-End (1000ng/mL, 72 hours), inhibited apoptosis and late apoptosis caused by deprivated serum (100ng/mL), inhibited proliferation (10, 100 or 1000ng/mL, 48 and 72 hours), induced G1/G0 arrest in cell cycle phases, decreased the cell adhesion and tube formation (100ng/mL), did not alter the basal expression of PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1, β1 or β3 integrin, but reduced the PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1 induced by VEGF-A. Impaired PECAM-1 and ICAM-1 expression seems not be dependent on gene expression, as, mRNA levels were not affected by the action of Amblyomin-X. Together, the data obtained shows that the Amblyomin-X inhibits new vessel formation in vivo, by interfering, possibly, with mechanisms related to VEGF-A induced endothelial cell signaling, especially with the proliferation, adhesion, tubulogenesis and expression of adhesion molecules.

A proteína P21 do Trypanosoma cruzi participa no processo de infecção da célula hospedeira, desse modo é de grande importância: elucidar as vias de sinalização induzidas pela proteína, bem como caracterizar a nível molecular e estrutural a P21. O que vai auxiliar no entendimento da função biológica da P21 e sua participação no processo de infecção. A P21 recombinante é expressa Escherichia coli em sua maioria na fração insolúvel. Visando aumento de proteína na fração solúvel, foi realizada a clonagem do gene da P21 em vetor pSMT3, bem como testes de expressão subsequentes em diferentes cepas de expressão de E. coli, em vetor pET-28 e pSMT3 e variadas condições de expressão e lise celular. Desse modo obtiveram-se as condições que permitissem uma maior concentração da P21 na fração solúvel. A expressão foi realizada no vetor pET-28, cepa BL21, a 37°C com meio 2xYT a 0.5 mM de IPTG, utilizando a técnica de sonicação como lise. A P21 foi purificada em cromatografia de afinidade e posteriormente em coluna de exclusão molecular. Foram realizados estudos de modelagem por homologia levaram a elaborar a hipótese de que a P21 tem a função de inibidor de serinoprotease do tipo kunitz. Posteriormente essa hipótese foi confirmada com ensaios de avaliação da atividade inibitória da P21 frente à tripsina, quimiotripsina e elastase neutrofílica, o qual a P21 mostrou capaz de inibir a elastase neutrofílica. Estudos com espalhamento dinâmico da luz (DLS) revelaram que as amostras testadas de P21 contém diferentes concentrações de agregados de alto peso molecular em todos os pHs avaliados. Outras medidas foram realizadas para avaliar o estado de agregação da P21 de acordo com a temperatura e verificou-se que entre 32-52 °C, a proteína apresenta menor raio hidrodinâmico, indicando menor agregação nesse intervalo. Estudos de dicroísmo circular revelaram que a P21 apresenta por volta de 20% de α hélice, 32% de folha-β, 22% de volta e 23 % estrutura randômica. De acordo com a curva de desnaturação referente ao espectro de CD obtido, a P21 se mostra desnaturada a partir de 64°C. / The Trypanosoma cruzi protein P21 participates in the host cell infection process, but its specific function is poorly described. Thus it is important to elucidate the signaling pathways induced by the protein and characterize the P21 at the structural and molecular levels, as a contribution towards the understanding of the P21 biological function and its role in the infection process. The Escherichia coli recombinant P21 is expressed mostly in the insoluble fraction. Aiming to increase protein in the soluble fraction, we performed the cloning of the P21 gene in pSMT3 vector and subsequent expression tests in different expression strains of E. coli in pET-28 and pSMT3 vectors and varied expression conditions and cell lysis. Thus we obtained conditions that allow a greater concentration of the P21 in the soluble fraction. The expression vector was performed using vector pET-28, in Bl21 strain at 37°C in 2xYT culture medium with 0.5 mM IPTG, using the sonication technique in cell lysis. The recombinant P21 was purified by Ni affinity chromatography and subsequently a molecular exclusion column. We performed homology modeling studies which led to assume that P21 can be a serinprotease inhibitor of Kunitz type. Furthermore, this hypothesis was confirmed in the experiments testing the P21 inhibitory activity against the trypsin, chymotrypsin and elastase. We found the P21 exclusively inhibit neutrophil elastase. Studies using dynamic light scattering (DLS) revealed that the samples containing P21 contained large molecular weigth aggregates in different concentrations at all evaluated pHs. Others measurements were performed to assess the P21 aggregation state according to the temperature and we found that between 32-52 °C the protein had a smaller hydrodynamic radius, indicating less aggregation in this range. Circular dichroism (CD) studies revealed that P21 has about 20% α-helix, 32% β, -sheet, 22% turn and 23% of random structure. According to the denaturation curve for the CD spectrum obtained, the P21 was denatured from 64°C.