Objectifs : Le gène SHANK3 code pour une protéine dite d’« échafaudage » localisée dans les synapses des neurones glutamatergiques. Elle est nécessaire au bon assemblage des protéines de la densité postsynaptique et est cruciale pour une transmission synaptique efficace. Des anomalies génétiques conduisant à la diminution de la protéine SHANK3 sont impliquées dans plusieurs maladies psychiatriques, incluant des formes génétiques de troubles du spectre autistique ainsi que la schizophrénie. Les mutations étant hétérozygotes, il serait théoriquement possible d’augmenter l’expression de la protéine SHANK3 en augmentant la transcription de l’allèle sain par des traitements chimiques. Cependant, la régulation transcriptionnelle du gène SHANK3 est très peu connue dans les neurones humains par manque de modèles cellulaires pertinents. L’objectif de mon travail de thèse a été de tirer avantage des propriétés d’autorenouvellement et de pluripotence des cellules souches pluripotentes humaines (Human Pluripotent Stem Cells, hPSC) pour produire une grande quantité de neurones humains glutamatergiques in vitro puis de les utiliser comme ressource cellulaire pour développer une technique de criblage à haut débit afin d’identifier des modulateurs de la transcription du gène SHANK3. Résultats : Des précurseurs neuronaux ont été dérivés à partir d’une lignée de cellules souches embryonnaires humaines (SA001, 46 XY, Cellartis, Suède) puis différenciés pendant 14 jours, dans des plaques 384 puits, afin d’obtenir une population composée d’au moins 70 % de neurones corticaux glutamatergiques. Une méthode à haut débit automatisée et miniaturisée basée sur la technique FastLane (Qiagen) a été développée pour extraire les ARNm directement à partir des plaques 384 puits. Les variations d’ARNm de SHANK3 induites par les différents traitements ont ensuite été quantifiées par qPCR Taqman en duplex, en normalisant avec le gène de ménage Cyclophiline A, et en rapportant aux niveaux d’ARNm de neurones non traités (Méthode de 2-ΔΔCt). Un criblage sur 205 composés, incluant des inhibiteurs de kinase, des régulateurs épigénétiques et des médicaments repositionnables, a été réalisé et 28 hits augmentant de plus de 30 % l’ARNm de SHANK3 ont été découverts. Seize composés ont été confirmés par des expériences de dose réponses sur l’ARNm de SHANK3. Des expériences d’immunofluorescence par imagerie à haut contenu ont confirmées que 4 composés augmentaient de façon significative les niveaux de la protéine SHANK3 dans le réseau neuritique, incluant des inhibiteurs de la kinase cycline dépendante 5 (Cdk5) avec la roscovitine et le lithium (régulateur d’humeur), l’antiépileptique acide valproïque et l’antipsychotique fluoxétine. Des mesures fonctionnelles de flux calcique ont validé l’effet du lithium et de l’acide valproïque sur la force synaptique glutamatergique. Enfin, le potentiel de ces composés a également été exploré sur des neurones différenciés à partir de cellules souches induites à la pluripotence (Induced Pluripotent Stem Cells, iPSC) d’individus autistes portant une mutation sur le gène SHANK3. Conclusion : Cette étude démontre qu’il est possible d’identifier des voies de régulation de protéines clés synaptiques, comme SHANK3, par méthode de criblage à haut débit en utilisant des neurones humains dérivés d’hPSC, incluant des neurones représentatifs d’individus autistes avec la technologie iPSC. Cette nouvelle approche devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires responsable de l’autisme et la découverte de nouveaux composés thérapeutiques, personnalisables à de sous-groupes de sujets autistes classifiés en fonction du gène ou de la voie de signalisation à corriger plutôt qu’en fonction de leurs symptômes cliniques hétérogènes. / Aims: The SHANK3 gene codes for a scaffold protein located in synapses of glutamatergic neurons. It plays a crucial role in the postsynaptic density assembly and in controlling glutamatergic synaptic transmission. Genetic anomalies leading to a decrease in SHANK3 protein expression are implicated in several psychiatric conditions, including genetic forms of autism spectrum disorders and schizophrenia. Mutations being heterozygous, treatments that increase SHANK3 protein through transcriptional regulation may be therapeutically useful. However, little is known about SHANK3 gene transcriptional regulation in human neurons because of the lack of a relevant cellular model. Here I took advantage of the self-renewing and pluripotency properties of human pluripotent stem cells (hPSC) to produce a large amount of human glutamatergic neurons in vitro and use them as a cellular resource to develop a large-scale screening strategy to identify SHANK3 gene transcription modulators. Results: Neuronal precursors were differentiated from one human embryonic stem cell line (SA001, 46 XY, Cellartis, Sweden). Cultures containing more than 70% of neurons with a cortical glutamatergic phenotype were reproducibly obtained in 384-well plates upon 14 days of precursor differentiation. Automated and high-throughput mRNA extraction was performed using Fastlane technology (Qiagen) in 384-well plates. SHANK3 mRNA levels were quantified using duplex Taqman qPCR, normalized to Cyclophilin A mRNA levels, then to SHANK3 mRNA levels of vehicle-treated cells in order to determine SHANK3 mRNA variations induced by the compound treatment (2-ΔΔCt method). A screening assay was conducted on 205 compounds, including kinase inhibitors, epigenetic regulators and repositionable marketed drugs, and 28 compounds successfully passed the hit selection criteria yielding SHANK3 mRNA increases of at least 30% from mean control values with a statistical cut-off of 2 standard deviation. Sixteen compounds were confirmed by dose-response experiments on SHANK3 mRNA. Further immunofluorescence studies using high content imaging confirmed that 4 compounds increased levels of SHANK3 protein in the neuritic network. Thus, this screening identified as SHANK3 regulators 2 Cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) inhibitors the lead molecule, roscovitine and the mood regulator, lithium; the antiepileptic drug valproïc acid and the antipsychotic fluoxetine. In addition, functional calcium flux experiments validated lithium and valproïc acid effect on glutamatergic synaptic strength. Finally, the compounds were also tested on neurons differentiated from induced pluripotent stem cells (iPSC) of autistic patients bearing SHANK3 mutation. Conclusion: This study demonstrates that cellular pathways regulating a key synaptic protein, SHANK3, can be explored on a large scale using hPSC-derived neurons, including autistic individuals neurons using iPSC technology. This approach should help improving knowledge of the molecular mechanisms responsible of autism and promote the discovery of new therapeutic compounds, personalized to autistic subgroups of individuals stratified according to gene or pathway dysfunction rather than according to clinical heterogeneous symptoms.

<p>Developmental disabilities, including intellectual disability (ID), attention-deficit hyperactivity disorder (ADHD), and autism spectrum disorders (ASD), affect approximately 1 in 6 children in the United States. Attempts to produce treatment for developmental disabilities have been hampered by our current lack of understanding of the molecular mechanisms underlying these disorders. Advancements in genome sequencing and animal modeling technologies have proven to be an invaluable resource in the elucidation of potential disease mechanisms, with recent studies reporting novel mutations of the Ptchd1 and Shank3 genes in patients with developmental disabilities. Though these two genes have been proposed to play important roles in neural development, their function in the normal brain and defective behavioral output are poorly understood. </p><p>In this dissertation, I characterize the circuit and behavioral dysfunction of the genetically-engineered Ptchd1 and Shank3 knockout mice. With respect to Ptchd1, I found that expression is developmentally enriched in the thalamic reticular nucleus (TRN), which is a group of GABAergic neurons serving as the major source of inhibition for thalamo-cortical neurons. Slice and in vivo electrophysiological experiments revealed that deletion of this gene in mice disrupts SK2 currents and burst firing mechanisms in the TRN, a region that has previously been shown to play an important role in sleep, attention, and cognition. Consistent with clinical findings, Ptchd1 knockout mice display behavioral phenotypes indicative of hyperactivity, attention deficits, motor dysfunction, hyperaggression, and cognitive impairment. Interestingly, attention-like deficits and hyperactivity are rescued by SK2 pharmacological enhancement, suggesting a potential molecular target for developing treatment. </p><p>Shank3 knockout mice display ASD-like phenotypes, including social interaction deficits and repetitive behaviors. In addition, biochemical, electrophysiological, and morphological abnormalities were discovered in the medium spiny neurons (MSNs) of these mice. However, the exact neural circuits and cell types responsible for the autistic-like behaviors have not been identified. To address this important question, I developed a new conditional Shank3 knockout mouse. Importantly, the behavioral abnormalities reported in the original Shank3 knockout mice were recapitulated in this novel conditional Shank3 knockout mouse, indicating that this mouse may be useful for future pathway-specific dissections of ASD-like behaviors. Together, these two sets of studies not only provide mouse models for dissecting the function of PTCHD1and SHANK3 in normal and abnormal neural development, but also demonstrate a critical role for PTCHD1 in TRN neurons and SHANK3 in MSN cells and in the case of PTCHD1, identify potential cellular and circuit pathway targets for much-needed pharmacological intervention.</p> / Dissertation

Les Troubles du Spectre Autistique (TSA) affectent un individu sur 100 en France et sont caractérisés par des déficits de la communication et des interactions sociales ainsi que par la présence d’intérêts restreints et de comportements répétitifs. Le laboratoire a démontré l’implication de protéines synaptiques dans le développement des TSA et en particulier celle des protéines SHANK. Ces protéines sont des protéines d’échafaudage présentes au niveau de la densité post-synaptique (PSD) des neurones glutamatergiques et interagissant avec différents partenaires. Dans le cadre de mon projet de thèse, nous nous sommes particulièrement intéressés à la protéine SHANK3. Des mutations au sein du gène SHANK3 ont été détectées chez environ 1 à 2% des patients, selon le degré de sévérité du retard mental. Un déficit de SHANK3 altère le fonctionnement synaptique. En effet, des analyses sur modèles de souris invalidées pour le gène SHANK3 ont montré une diminution de la densité des épines dendritiques, de la taille de la densité post-synaptique et de l’expression des partenaires protéiques de SHANK3. Mon modèle principal d’analyse a consisté en la reprogrammation de fibroblastes en cellules pluripotentes induites (iPSC « induced pluripotent stem cells »). Les iPSCs ont ensuite été sélectivement dérivées en neurones corticaux. Nos études se sont focalisées sur l’analyse des conséquences fonctionnelles de mutations de novo du gène SHANK3 retrouvées chez 4 patients à l’état hétérozygote et présentes au sein de l’exon 21. Ces mutations conduisent à un codon stop prématuré. En parallèle, nous avons obtenu des cellules de 4 individus témoins ne présentant aucun trouble psychiatrique identifié. L’analyse a porté d’une part sur des aspects morphologiques et d’autre part sur des aspects fonctionnels. Nous avons étudié l’effet des mutations sur la maturation et les caractéristiques morphologiques des épines dendritiques. Nous avons établi un protocole permettant une analyse détaillée de la morphologie en 3D des épines dendritiques et suivi leur maturation. Un résultat majeur est l’observation d’une diminution de la densité des épines sur les dendrites des neurones pyramidaux issus des patients par rapport aux témoins. Comme attendu, la maturation des épines n’est pas complètement achevée mais varie peu dans son évolution d’un individu à l’autre (témoins vs. patients). Nous avons poursuivi ces études par deux approches fonctionnelles : l’imagerie calcique et des études d’électrophysiologie. Les données électrophysiologiques sont en cours d’analyse. En conclusion, nous avons pu obtenir des cultures de neurones corticaux glutamatergiques et les maintenir en culture durant 40 jours pour effectuer différentes analyses à un stade de maturation suffisant pour la mise en évidence de phénotypes morphologiques et fonctionnels. Nous avons principalement observé une diminution de des densités synaptiques et de maturation des épines dendritiques au sein des neurones issus de patients liée à des altérations d’oscillations calciques spontanées. / Autism Spectrum Disorders (ASD) is a neurodevelopmental disorder affecting 1% of population ; characterised by impairments in social interaction and reciprocal communication as well as repetitive and stereotyped behaviors. The work of the laboratory lead to the identification of several genes associated with ASD, among which genes of the synaptic pathway such as SHANK. The SHANK proteins are scaffolding proteins of the post-synaptic density (PSD) of glutamatergic neurons and interact with several partners. In my thesis project, we were particularly interested in SHANK3 mutations. First, Shank3 mutations represent up to 2.12% of ASD cases with moderate to high ID. A SHANK3 deficit leads to the alteration of the synaptic functioning. Indeed, studies of mice KO for SHANK3 gene showed a decrease of the dendritic spines density, of the PSD size and of the expression of SHANK3 partners. My principal model of analysis consisted in the reprogrammation of fibroblasts into induced pluripotent stem cells (iPSCs). Then, the iPSCs were selectively derived into cortical neurons. Our studies were focus on the analysis of functional consequences of SHANK3 de novo mutations found within 4 patients. These mutations are heterozygous and within the exon 21. They result in a premature stop codon. In parallel, we obtained cells from 4 healthy individuals. The work was about the morphological and functional aspects. We analysed the mutations effects on the maturation and morphological caracteristics of the dendritic spines. We finalized a protocol that enabled a detailed analysis of the spine dendritic 3D morphology and their maturation follow-up. A important result was the observation of a decrease of the spine density on pyramidal neurons dendrites from patients compared to those from controls. Moreover, spines maturation was not fully accomplished but was not much different in its evolution between individuals (controls vs patients). Then, we used two functional skills : calcium imaging and electrophysiological experiments. The electrophysiological data are in progress. To conclude, we succeeded in the obtention of glutamatergic cortical neurons and to maintain them in culture during 40 days in order to realize some analysis at a sufficient maturation stage to observe morphological and functional phenotypes. We mainly observed a decrease of the dendritic spines density and maturation for the neurons from patients, with alterations of the spontaneous calcium oscillations.

SH3 and multiple ankyrin repeat domains 3 (SHANK3) is a multidomain scaffold protein that is highly augmented in the postsynaptic density (PSD) of excitatory glutamatergic synapses within the central and peripheral nervous systems. SHANK3 links neurotransmitter receptors, ion channels, and other critical membrane proteins to intracellular cytoskeleton and signal transduction pathways. Mutations in SHANK3 are linked with a number neuropsychiatric disorders including autism spectrum disorders (ASDs). Intellectual disability, impaired memory and learning, and epilepsy are some of the deficits commonly associated with ASDs that result from mutations in SHANK3. Interestingly, these symptoms show some clinical overlap with presentations of human neurological disorders involving hyperpolarization-activated cyclin nucleotide-gated (HCN) channels. In fact, it has recently been demonstrated in human neurons that SHANK3 haploinsufficiency causes Ih-channel dysfunction, and that SHANK3 has a physical interaction with HCN channels via its ANKYRIN repeat domain. These insights suggest that SHANK3 may play important roles in HCN channel expression and function, and put forward the idea that HCN channelopathies may actually encourage some of the symptoms observed in patients with SHANK-deficiency related ASDs. In this study, we provide preliminary data that suggests the ANK domain of SHANK3 interacts with COOH portion of HCN1. We also exploited the differences between two mouse models of autism to show that a subset of SHANK3 isoforms may be involved in the proper expression and function of HCN channels. We found that HCN2 expression is significantly decreased in a mouse model lacking all major isoforms of SHANK3 (exons 13-16 deleted; Δ13-16), while HCN2 expression is unaltered in a mouse model only lacking SHANK3a and SHANK3b (exons 4-9 deleted; Δ4-9). Surprisingly, we also found that HCN4 expression is altered in SHANK3Δ13-16, but not SHANK3Δ4-9. Taken together, our results show HCN channelopathy as a major downstream carrier of SHANK3 deficiency.