A transmissão sináptica é essencial para o funcionamento do sistema nervoso. A neuromodulação permite regular esse processo de forma precisa. Um desses mecanismos modulatórios é a regulação da liberação de neurotransmissores. A adenosina é um importante modulador da transmissão sináptica. Além disso, a ativação do subtipo A2a dos receptores para adenosina está envolvida com a facilitação da liberação de neurotransmissores no sistema nervoso central. O presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos modulatórios da ativação do receptor A2a de adenosina sobre a liberação de neurotransmissores e sua via de sinalização intracelular em modelo in vitro. Além disso, a tese contempla a construção histórica dos conceitos abordados no trabalho permitindo uma visão clara de sua evolução. Esse projeto foi o pioneiro no Brasil a utilizar o sensor biossintético fluorescente de liberação de vesículas sinápticas (supereclipse sinapto-pHluorina), o qual foi gentilmente cedido pelo professor Gero Miensenboeck do Sloan-Kettering Institute for Cancer Research. Nossos resultados demonstraram que o tratamento com o agonista do receptor A A2a de adenosina aumentou a fluorescência do supereclipse sinapto-pHluorina, assim como os níveis de glutamato e noradrenalina. Além disso, foi demonstrado que o inibidor da proteína cinase dependente de AMPc aboliu o aumento nos níveis do glutamato e noradrenalina, tal como a fosforilação da proteína sináptica sinapsina I evocado pelo agonista do receptor A2a de adenosina. Desta forma, nossos dados sugerem que a ativação do receptor A2a de adenosina em cultura de células do bulbo de ratos Wistar modula a liberação de neurotransmissores e a fosforilação da sinapsina I, assim como a proteína cinase dependente do AMPc pode ser o modus operandi desse fenômeno modulatório / Synaptic transmission is a sine qua non process for nervous system physiology. Such precise process is accomplished in part due to modulation of neurotransmitter release. Adenosine is a putative synaptic transmission modulator. Moreover, adenosine A2a receptor facilitates neurotransmitter release in the Central Nervous System. The present study focuses on the modulation of neurotransmission by adenosine A2a receptor and its intracellular signaling pathway in in vitro model. Here, we provided evidence that adenosine A2a receptor agonist increases an optical biosynthetic sensor of synaptic vesicle release (supereclipct synapto-pHluorin), as well as glutamate and noradrenaline. Furthermore, it was demonstrated that cAMP-dependent protein kinase inhibitor abolished glutamate and norepinephrin increase, as well as synapsin I phosphorylation evoked by adenosine A2a receptor agonist. Therefore, our data suggest that adenosine A2a receptor activation modulates neurotransmitter release and synapsin I phosphorylation in cultured cells from medulla oblongata of Wistar rats, as well as cAMP-dependent protein kinase might be the modus operandi of this modulatory phenomenon

A transmissão sináptica é essencial para o funcionamento do sistema nervoso. A neuromodulação permite regular esse processo de forma precisa. Um desses mecanismos modulatórios é a regulação da liberação de neurotransmissores. A adenosina é um importante modulador da transmissão sináptica. Além disso, a ativação do subtipo A2a dos receptores para adenosina está envolvida com a facilitação da liberação de neurotransmissores no sistema nervoso central. O presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos modulatórios da ativação do receptor A2a de adenosina sobre a liberação de neurotransmissores e sua via de sinalização intracelular em modelo in vitro. Além disso, a tese contempla a construção histórica dos conceitos abordados no trabalho permitindo uma visão clara de sua evolução. Esse projeto foi o pioneiro no Brasil a utilizar o sensor biossintético fluorescente de liberação de vesículas sinápticas (supereclipse sinapto-pHluorina), o qual foi gentilmente cedido pelo professor Gero Miensenboeck do Sloan-Kettering Institute for Cancer Research. Nossos resultados demonstraram que o tratamento com o agonista do receptor A A2a de adenosina aumentou a fluorescência do supereclipse sinapto-pHluorina, assim como os níveis de glutamato e noradrenalina. Além disso, foi demonstrado que o inibidor da proteína cinase dependente de AMPc aboliu o aumento nos níveis do glutamato e noradrenalina, tal como a fosforilação da proteína sináptica sinapsina I evocado pelo agonista do receptor A2a de adenosina. Desta forma, nossos dados sugerem que a ativação do receptor A2a de adenosina em cultura de células do bulbo de ratos Wistar modula a liberação de neurotransmissores e a fosforilação da sinapsina I, assim como a proteína cinase dependente do AMPc pode ser o modus operandi desse fenômeno modulatório / Synaptic transmission is a sine qua non process for nervous system physiology. Such precise process is accomplished in part due to modulation of neurotransmitter release. Adenosine is a putative synaptic transmission modulator. Moreover, adenosine A2a receptor facilitates neurotransmitter release in the Central Nervous System. The present study focuses on the modulation of neurotransmission by adenosine A2a receptor and its intracellular signaling pathway in in vitro model. Here, we provided evidence that adenosine A2a receptor agonist increases an optical biosynthetic sensor of synaptic vesicle release (supereclipct synapto-pHluorin), as well as glutamate and noradrenaline. Furthermore, it was demonstrated that cAMP-dependent protein kinase inhibitor abolished glutamate and norepinephrin increase, as well as synapsin I phosphorylation evoked by adenosine A2a receptor agonist. Therefore, our data suggest that adenosine A2a receptor activation modulates neurotransmitter release and synapsin I phosphorylation in cultured cells from medulla oblongata of Wistar rats, as well as cAMP-dependent protein kinase might be the modus operandi of this modulatory phenomenon

A anóxia neonatal decorre da redução de oxigênio no feto ou no recém-nascido e provoca morte e morbidade principalmente nos prematuros. Neste projeto avaliamos se o exercício físico espontâneo em ratas gestantes atenua os problemas no desenvolvimento e na cognição provocados pela anóxia neonatal nos filhotes. Para tanto, avaliamos o desenvolvimento somático e sensorimotor dos filhotes até o desmame e na idade adulta avaliamos a sua memória espacial. Também analisamos a densidade de neurônios e a expressão relativa de sinapsina I no hipocampo de animais jovens e adultos. O exercício materno espontâneo foi capaz de reverter o atraso provocado pela anóxia neonatal no aparecimento de características físicas e reflexos. Em animais jovens, ele também diminuiu a redução, pela anóxia, da densidade neuronal no giro dentado e da expressão relativa de sinapsina I. Os efeitos do exercício materno e da anóxia neonatal aparentemente não persistiram até a vida adulta. Assim, o exercício materno espontâneo atenua os efeitos da anóxia neonatal em jovens. / Neonatal anoxia follows from oxygen reduction in fetus or newborn and causes death and morbidity mainly in premature children. We evaluated if spontaneous maternal exercise in pregnant rats attenuates problems in the development and in the cognition caused by neonatal anoxia in pups. Thereunto, we evaluated the somatic and sensory-motor development of pups until weaning and, at adult age, we evaluated their spatial memory. We also analysed the neuron density and the relative expression of synapsin I in the hippocampus of young and adult animals. The spontaneous maternal exercise was able to reverse the delay caused by neonatal anoxia in the development of physical traits and reflexes. In young animals, maternal exercise also decrease the reduction, by anoxia, of neuronal density in the dentate gyrus and of relative expression. of synapsin I. Maternal exercise and neonatal anoxia effects apparently did not persist until adulthood. Thus, spontaneous maternal exercise attenuates neonatal anoxia effects in Young rats.

A anóxia neonatal decorre da redução de oxigênio no feto ou no recém-nascido e provoca morte e morbidade principalmente nos prematuros. Neste projeto avaliamos se o exercício físico espontâneo em ratas gestantes atenua os problemas no desenvolvimento e na cognição provocados pela anóxia neonatal nos filhotes. Para tanto, avaliamos o desenvolvimento somático e sensorimotor dos filhotes até o desmame e na idade adulta avaliamos a sua memória espacial. Também analisamos a densidade de neurônios e a expressão relativa de sinapsina I no hipocampo de animais jovens e adultos. O exercício materno espontâneo foi capaz de reverter o atraso provocado pela anóxia neonatal no aparecimento de características físicas e reflexos. Em animais jovens, ele também diminuiu a redução, pela anóxia, da densidade neuronal no giro dentado e da expressão relativa de sinapsina I. Os efeitos do exercício materno e da anóxia neonatal aparentemente não persistiram até a vida adulta. Assim, o exercício materno espontâneo atenua os efeitos da anóxia neonatal em jovens. / Neonatal anoxia follows from oxygen reduction in fetus or newborn and causes death and morbidity mainly in premature children. We evaluated if spontaneous maternal exercise in pregnant rats attenuates problems in the development and in the cognition caused by neonatal anoxia in pups. Thereunto, we evaluated the somatic and sensory-motor development of pups until weaning and, at adult age, we evaluated their spatial memory. We also analysed the neuron density and the relative expression of synapsin I in the hippocampus of young and adult animals. The spontaneous maternal exercise was able to reverse the delay caused by neonatal anoxia in the development of physical traits and reflexes. In young animals, maternal exercise also decrease the reduction, by anoxia, of neuronal density in the dentate gyrus and of relative expression. of synapsin I. Maternal exercise and neonatal anoxia effects apparently did not persist until adulthood. Thus, spontaneous maternal exercise attenuates neonatal anoxia effects in Young rats.

Os peptídeos potenciadores da bradicinina (BPPs) presentes no veneno da serpente Bothrops jararaca são oligopeptídeos ricos em prolinas. Eles foram os primeiros inibidores naturais da enzima conversora de angiotensina (ECA) descritos. As propriedades bioquímicas e farmacológicas desses peptídeos foram essenciais para o desenvolvimento do captopril, o primeiro inibidor sítio-dirigido da ECA, usado para tratar a hipertensão humana. Recentes dados têm sugerido que a atividade farmacológica dos BPPs não pode ser explicada somente pela ação inibitória da atividade da ECA e que os efeitos dos BPPs devem envolver a participação do sistema nervoso central (SNC). Nesse trabalho foi caracterizada a sinalização de Ca2+ induzida pelo BPP-10c [<ENWPHPQIPP] em células neuronais obtidas de cultura primária de cérebro de ratos neonatos. As elevações na [Ca2+]i induzida por várias concentrações de BPP-10c revelaram uma curva dose-resposta atípica. A resposta máxima de transientes de [Ca2+]i foram medidas na concentração de 1 µM de BPP-10c, enquanto que em concentrações mais elevadas houve um declínio das respostas de [Ca2+]i. Esse efeito foi independente da atividade do receptor de bradicinina (BK) e foi mediado por um receptor acoplado a Gi/0. A sinalização do BPP-10c levou a um aumento da produção de óxido nítrico (NO) por células neuronais, como decorrência da ativação da NOS, uma enzima Ca2+-dependente e da super-expressão da NO sintase endotelial (eNOS) e da argininosuccicinato sintase (ASS), enzima passo limitante no fornecimento de substrato para a NOS. Além disso, ensaios de afinidade com o BPP-10c revelaram além da ASS, a sinapsina como potencial alvo do BPP-10c no SNC. O fato do BPP-10c interagir com a sinapsina, proteína envolvida com a exocitose, e aumentar a produção de NO por células neuronais pode explicar a sua capacidade de induzir a liberação dos neurotransmissores, GABA e glutamato, ambos com importante papel na regulação da pressão arterial. O NO no SNC também age como neurotransmissor, regulando a atividade simpática e parassimpática. O BPP-10c produz queda da pressão da arterial e da freqüência cardíaca, indicando uma interferência direta na atividade autonômica simpática, parassimpática ou ambas, provocando mudanças no controle barorreflexo da freqüência cardíaca. De fato, esse peptídeo mostrou aumentar a sensibilidade barorreflexa de SHRs que está diminuída nesses animais quando comparados a ratos normotensos. Foi demonstrado também que o efeito do BPP-10c administrado perifericamente foi semelhante ao administrado centralmente, sugerindo que o efeito anti-hipertensivo do BPP-10c deve envolver o SNC. Dessa maneira, apesar do bem caracterizado efeito anti-hipertensivo baseado na inibição da ECA, esse trabalho evidencia a existência de um segundo mecanismo para ação do BPP-10c no controle da pressão arterial. No SNC, o BPP-10c modula a expressão da eNOS e da ASS e induz um aumento na produção de NO e liberação dos neurotransmissores, GABA e glutamato, para controlar a atividade simpática e/ou parassimpática que reflete no aumento da sensibilidade do barorreflexo de SHRs. Sendo assim, as características bioquímicas e farmacológicas do BPP-10c abrem perspectivas para o desenvolvimento de fármacos baseado em um novo alvo terapêutico. / Pyroglutamyl proline-rich oligopeptides, denominated bradykinin-potentiating peptides (BPPs), present in the venom of the viper Bothrops jararaca were the first described naturally occurring angiotensine-converting enzyme (ACE) inhibitors. The biochemical and pharmacological properties of theses peptides were essential for the development of captopril, the first active site-directed inhibitor of ACE, currently used to treat human hypertension. Recent data have suggested that the pharmacological activity of BPPs could not only be explained by their inhibitory action on the ACE activity and that BPPmediated effects may involve the central nervous system. In this work, we have characterized BPP-10c [<ENWPHPQIPP]-induced calcium signaling in neuronal cells obtained as primary culture from day 1 of postnatal rat brain. Elevations of [Ca2+]i induced by increasing concentrations of BPP-10c revealed an atypical dose-response curve. Maximal [Ca2+]i peak values were measured at 1 µM BPP-10c concentration, while further raising BPP-10c concentrations led to a decline of [Ca2+]i responses. This effect was independent from kinin-B2 receptor activity and was mediated by a yet unknown Gi/0 protein-coupled receptor. BPP-10c signaling promoted an increase of nitric oxide (NO) production in neuronal cells, as consequence of Ca2+-dependent NO synthase activation and upregulated gene expression of endothelial NO synthase (eNOS) and argininosuccicinato synthase (ASS), a limiting step enzyme in the NOcitrulline cycle. Furthermore, affinity chromatography assays revealed ASS and synapsin as potential binding partners of BPP-10c in the CNS. In view of that BPP-10c interacts with synapsin, a protein involved with exocytosis, and induces NO production in neuronal cells, these data could explain its capacity of inducing release of the neurotransmitters GABA and glutamate with important roles in blood pressure regulation. NO also acts as neurotransmitter in the CNS, thereby regulating sympathetic and parasympathetic activities. The presence of BPP-10c also mediates reduction of arterial pressure and heart rate suggesting direct interference of BPP action with autonomic sympathetic and/or parasympathetic activity and the baroreflex control of the heart rate. In agreement, this peptide led to increased baroreflex sensitivity of spontaneous hypertensive rats. We have also demonstrated that the BPP-10c-mediated anti-hypertensive effect was similar following peripheral or central administration, suggesting the participation of the CNS in this process. The existence of a second mechanism for BPP-10c action on blood pressure control as new therapeutic target which is independent from ACE inhibition shall initiate novel approaches for antihypertensive drugs.

Os peptídeos potenciadores da bradicinina (BPPs) presentes no veneno da serpente Bothrops jararaca são oligopeptídeos ricos em prolinas. Eles foram os primeiros inibidores naturais da enzima conversora de angiotensina (ECA) descritos. As propriedades bioquímicas e farmacológicas desses peptídeos foram essenciais para o desenvolvimento do captopril, o primeiro inibidor sítio-dirigido da ECA, usado para tratar a hipertensão humana. Recentes dados têm sugerido que a atividade farmacológica dos BPPs não pode ser explicada somente pela ação inibitória da atividade da ECA e que os efeitos dos BPPs devem envolver a participação do sistema nervoso central (SNC). Nesse trabalho foi caracterizada a sinalização de Ca2+ induzida pelo BPP-10c [<ENWPHPQIPP] em células neuronais obtidas de cultura primária de cérebro de ratos neonatos. As elevações na [Ca2+]i induzida por várias concentrações de BPP-10c revelaram uma curva dose-resposta atípica. A resposta máxima de transientes de [Ca2+]i foram medidas na concentração de 1 µM de BPP-10c, enquanto que em concentrações mais elevadas houve um declínio das respostas de [Ca2+]i. Esse efeito foi independente da atividade do receptor de bradicinina (BK) e foi mediado por um receptor acoplado a Gi/0. A sinalização do BPP-10c levou a um aumento da produção de óxido nítrico (NO) por células neuronais, como decorrência da ativação da NOS, uma enzima Ca2+-dependente e da super-expressão da NO sintase endotelial (eNOS) e da argininosuccicinato sintase (ASS), enzima passo limitante no fornecimento de substrato para a NOS. Além disso, ensaios de afinidade com o BPP-10c revelaram além da ASS, a sinapsina como potencial alvo do BPP-10c no SNC. O fato do BPP-10c interagir com a sinapsina, proteína envolvida com a exocitose, e aumentar a produção de NO por células neuronais pode explicar a sua capacidade de induzir a liberação dos neurotransmissores, GABA e glutamato, ambos com importante papel na regulação da pressão arterial. O NO no SNC também age como neurotransmissor, regulando a atividade simpática e parassimpática. O BPP-10c produz queda da pressão da arterial e da freqüência cardíaca, indicando uma interferência direta na atividade autonômica simpática, parassimpática ou ambas, provocando mudanças no controle barorreflexo da freqüência cardíaca. De fato, esse peptídeo mostrou aumentar a sensibilidade barorreflexa de SHRs que está diminuída nesses animais quando comparados a ratos normotensos. Foi demonstrado também que o efeito do BPP-10c administrado perifericamente foi semelhante ao administrado centralmente, sugerindo que o efeito anti-hipertensivo do BPP-10c deve envolver o SNC. Dessa maneira, apesar do bem caracterizado efeito anti-hipertensivo baseado na inibição da ECA, esse trabalho evidencia a existência de um segundo mecanismo para ação do BPP-10c no controle da pressão arterial. No SNC, o BPP-10c modula a expressão da eNOS e da ASS e induz um aumento na produção de NO e liberação dos neurotransmissores, GABA e glutamato, para controlar a atividade simpática e/ou parassimpática que reflete no aumento da sensibilidade do barorreflexo de SHRs. Sendo assim, as características bioquímicas e farmacológicas do BPP-10c abrem perspectivas para o desenvolvimento de fármacos baseado em um novo alvo terapêutico. / Pyroglutamyl proline-rich oligopeptides, denominated bradykinin-potentiating peptides (BPPs), present in the venom of the viper Bothrops jararaca were the first described naturally occurring angiotensine-converting enzyme (ACE) inhibitors. The biochemical and pharmacological properties of theses peptides were essential for the development of captopril, the first active site-directed inhibitor of ACE, currently used to treat human hypertension. Recent data have suggested that the pharmacological activity of BPPs could not only be explained by their inhibitory action on the ACE activity and that BPPmediated effects may involve the central nervous system. In this work, we have characterized BPP-10c [<ENWPHPQIPP]-induced calcium signaling in neuronal cells obtained as primary culture from day 1 of postnatal rat brain. Elevations of [Ca2+]i induced by increasing concentrations of BPP-10c revealed an atypical dose-response curve. Maximal [Ca2+]i peak values were measured at 1 µM BPP-10c concentration, while further raising BPP-10c concentrations led to a decline of [Ca2+]i responses. This effect was independent from kinin-B2 receptor activity and was mediated by a yet unknown Gi/0 protein-coupled receptor. BPP-10c signaling promoted an increase of nitric oxide (NO) production in neuronal cells, as consequence of Ca2+-dependent NO synthase activation and upregulated gene expression of endothelial NO synthase (eNOS) and argininosuccicinato synthase (ASS), a limiting step enzyme in the NOcitrulline cycle. Furthermore, affinity chromatography assays revealed ASS and synapsin as potential binding partners of BPP-10c in the CNS. In view of that BPP-10c interacts with synapsin, a protein involved with exocytosis, and induces NO production in neuronal cells, these data could explain its capacity of inducing release of the neurotransmitters GABA and glutamate with important roles in blood pressure regulation. NO also acts as neurotransmitter in the CNS, thereby regulating sympathetic and parasympathetic activities. The presence of BPP-10c also mediates reduction of arterial pressure and heart rate suggesting direct interference of BPP action with autonomic sympathetic and/or parasympathetic activity and the baroreflex control of the heart rate. In agreement, this peptide led to increased baroreflex sensitivity of spontaneous hypertensive rats. We have also demonstrated that the BPP-10c-mediated anti-hypertensive effect was similar following peripheral or central administration, suggesting the participation of the CNS in this process. The existence of a second mechanism for BPP-10c action on blood pressure control as new therapeutic target which is independent from ACE inhibition shall initiate novel approaches for antihypertensive drugs.