Orientador: Prof. Dr. Carlos Alberto Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2014. / Os peptideos potenciadores de bradicinina (BPPs) presentes na fracao de baixo peso molecular (FBP) do veneno da serpente Bothropoides jararaca (Bj) foram os primeiros inibidores da enzima conversora de angiotensina descritos. Recentes estudos demonstram que estes peptideos promovem a ativacao da enzima argininosuccinato sintetase, aumentando a disponibilidade de L-arginina e consequentemente a sintese de oxido nitrico, poliaminas e agmatina, essenciais para o crescimento, diferenciacao celular e neuroprotecao. Considerando os possiveis efeitos farmacologicos da FBP, o presente estudo tem como objetivo avaliar a atividade citoprotetora da FBP do veneno da serpente Bj em cultura primaria de celulas do hipocampo. Os resultados sugerem que a FBP nao e citotoxica nas condicoes experimentais avaliadas. Evidencias demonstram que as celulas tratadas com FBP 0,1 ¿Êg/mL e posteriormente com peroxido de hidrogenio H2O2 50¿ÊM apresentam maior viabilidade e menor expressao de caspase 3 clivada que as celulas tratadas apenas com H2O2 50¿ÊM, tambem e possivel observar que as celulas previamente tratadas com FBP apresentam morfologia normal, caracterizada pela presenca de neuritos, ja as celulas tratadas apenas com H2O2 50¿ÊM apresentam morfologia compativel com processos de morte celular. Em sintese os resultados sugerem que a FBP apresenta atividade citoprotetora contra o estresse oxidativo promovido por H2O2 50¿ÊM. O presente estudo abre novas perspectivas da aplicacao dos BPPs presentes na FBP da Bj para o desenvolvimento de novas pesquisas na area de neurociencia, com foco no desenvolvimento de farmacos aplicados ao tratamento de doencas neurodegenerativas. / The bradykinin potentiating peptides (BPPs) in the low molecular weight fraction (LMWF) from the venom of the Bothropoides jararaca (Bj) were the first angiotensin-converting enzyme inhibitors described. Recent studies have demonstrated that these peptides promote the activation of the enzyme argininosuccinate synthetase, increasing the availability of L-arginine and therefore the synthesis of agmatine, nitric oxide, polyamines essential for the growth, cell differentiation and neuroprotection. Considering the possible pharmacological effects of the LMWF, the present study aims to evaluate the cytoprotective activity of LMWF from Bj in primary cultured hippocampal cells. The results suggest that the LMWF is not cytotoxic in all experimental conditions. Evidence has shown that cells treated with LMWF 0.1 ìg/mL and then with hydrogen peroxide H2O2 (50ìM) show higher viability and lower expression of cleaved caspase 3 cells than the treated just with H2O2 (50ìM). Is also observed that cells pretreated with LMWF have normal morphology characterized by the presence of neurites, cells treated with H2O2 (50ìM) showed morphology compatible with cell death processes. In summary the results suggest that LMWF has cytoprotective activity against oxidative stress caused by H2O2 (50ìM). This study opens new perspectives of application of BPPs present in the LMWF from Bj for the development of new research in neuroscience, focusing on the development of drugs applied to the treatment of neurodegenerative diseases.

Orientador: Prof. Dr. Carlos Alberto Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2014. / Os acidentes ofidicos sao considerados um problema de saude publica. Por este motivo, ha a necessidade de realizar estudos de caracterizacao do veneno, bem como os de tratamentos e da fisiopatologia do envenenamento. Os componentes do veneno possuem especificidade com varios receptores teciduais humanos, podendo desestabilizar o sistema nervoso, cardiovascular ou hemostatico. Os peptideos potenciadores de bradicinina (BPPs) foram os primeiros inibidores naturais da Enzima Conversora de Angiotensina (ECA) descritos, presentes na fracao de baixo peso molecular (Bj-FBP). No presente estudo foram avaliados as alteracoes no testiculo e musculo estriado esqueletico durante o processo de envenenamento induzido via intramuscular pela acao do veneno e da fracao de baixo peso molecular da serpente Bothropoides jararaca (Bj-V). 22 camundongos machos da linhagem Swiss foram aleatoriamente distribuidos em grupos de 6h e 24h e administrados uma dose de 20¿ÊL de NaCl 0,9% nos animais controle (n=3); 1.2 mg/kg de veneno bruto (Bj-V) (n=4) e 0.24 mg/kg da fracao de baixo peso molecular (Bj-FBP) (n=4). A fracao de baixo peso molecular foi obtida por uma filtracao com peso molecular de 10 kDa e analisado por Espectrometria de Massas onde confirmou a ausencia de indicios de proteinas ou enzimas proteoliticas. Apos o tratamento os testiculos e fragmentos do musculo reto femoral foram coletados e analisados para avaliacao morfologica dos tratamentos. O envenenamento foi caracterizado pela analise morfologica do musculo estriado esqueletico, onde verificou-se, nas amostras do tratamento com Bj-V, verificou-se presenca de hemorragia e necrose tecidual; nas amostras dos animais tratados com Bj-FBP verificou-se a integridade das fibras musculares, mas houve a presenca de migracao celular leucocitaria. Na analise histopatologica dos testiculos observou-se com maior frequencia, alteracoes na morfologia dos tubulos seminiferos dos camundongos tratados com Bj-V e Bj-FBP em comparacao ao controle. Em sintese, os resultados demonstraram que o envenenamento por Bj podem afetar os tubulos seminiferos, levando a presenca de tubulos hipoespermatogenicos, sendo assim, os individuos acometidos pelo acidente ofidico podem apresentar algum comprometimento na espermatogenese. / Snakebites are considered a public health problem. For this reason, there is a need for studies to characterize the poison and the pathophysiology and treatment of poisoning. The components of the venom have specificity with various human tissue receptors, may destabilize the nervous, cardiovascular or hemostatic system. The bradykinin potentiating peptides (BPPs) were the first natural inhibitors of Angiotensin Converting Enzyme (ACE) described, present in the low molecular weight fraction (Bj-FBP). In the present study the changes in the testis and skeletal muscle were assessed during the process of poisoning induced by intramuscular action of the poison and the fraction of low molecular weight Bothropoides snake jararaca (Bj-V). 22 male mice of the Swiss strain were randomly distributed in groups of 6h and 24h and administered a dose of 20¿ÊL of 0.9% NaCl in control animals (n = 3); 1.2 mg / kg of crude venom (Bj-V) (n = 4) and 0.24 mg / kg of low molecular weight fraction (Bj- FBP) (n = 4). The low molecular weight fraction was obtained by filtration with molecular weight 10kDa and analyzed by mass spectrometry which confirmed the absence of evidence of proteolytic enzymes or proteins. After treatment the testes and fragments of the rectus femoris muscle were collected and analyzed for morphologic evaluation of treatments. The poisoning was characterized by morphological analysis of the striated skeletal muscle, where it was found in the samples treated with Bj-V, there was the presence of hemorrhage and necrosis; in samples from animals treated with Bj-FBP was found the integrity of muscle fibers, but there was the presence of leukocyte cell migration. Histopathology of the testes was observed more frequently, changes in the morphology of the seminiferous tubules of mice treated with Bj and Bj-V-FBP compared to the control. In summary, the results showed that Bj poisoning can affect the seminiferous tubules, leading to the presence of hipoespermatogenicos tubules, so individuals affected by snakebite may have some involvement in spermatogenesis.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-25Bitstream added on 2014-06-13T19:14:40Z : No. of bitstreams: 1 santos_kf_me_sjrp.pdf: 789178 bytes, checksum: c9d3ae49b4891343eda0dc12453c315f (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Angiotensina II, um peptídeo hipertensivo, e bradicinina, um peptídeo hipotensivo, são fatores humorais cruciais para a regulação da pressão sanguínea. A enzima chave desse sistema é a enzima conversora de angiotensina que produz angiotensina II a partir de angiotensina I e degrada bradicinina. A descoberta dos primeiros inibidores naturais dessa enzima, os peptídeos potenciadores de bradicinina (BPPs), tornou possível o desenvolvimento dos primeiros medicamentos utilizados no controle da pressão arterial humana. Caracteristicamente, os BPPs contêm de 5 a 13 resíduos de aminoácidos apresentando um resíduo de piroglutâmico no N-terminal e um resíduo de prolina no Cterminal. O precursor de BPPs encontrado na glândula de veneno de Bothrops jararaca contém 256 resíduos de aminoácidos e codifica para sete BPPs alinhados em tandem seguidos pelo peptídeo natriurético tipo-C. Até o momento, não se conhecem os mecanismos envolvidos para a liberação desses peptídeos da proteína precursora. Dessa forma, a resolução da estrutura dessa proteína pode contribuir para a elucidação do mecanismo evolvido no processamento do precursor para a liberação dos BPPs. Duas construções da proteína precursora de BPPs (domínio BPP e domínios BPP+CNP) da glândula de veneno de B. jararaca foram expressas, purificadas e suas identidades confirmadas por experimentos de western blotting. A pureza das amostras foi avaliada por SDS-PAGE e a presença de enovelamento após expressão heteróloga foi observada por experimentos de dicroísmo circular e fluorescência. Os ensaios de cristalização não foram promissores. Isso pode ser explicado pela baixa concentração da proteína usada no experimento. Assim, devido ao baixo nível de expressão de ambas as proteínas, métodos para maximização da expressão foram empregados resultando em significante... / Angiotensin II, a hypertensive peptide, and bradykinin, a hipotensive peptide, are crucial humoral factors for the regulation of blood pressure. The key enzyme for this system is the angiotensin-converting enzyme that produces angiotensin II from angiotensin I and degrades bradykinin. The discovery of the first natural inhibitors for this enzyme, the bradykinin potentiating peptides (BPPs), made it possible to develop the early drugs aimed at controlling unbalanced cardiovascular functions. Characteristically, BPPs contain 5 to 13 amino acid residues that have a pyroglutamyl residue at the N-terminus and a praline residue at the C-terminus. The BPP precursor protein contains 256 amino acid residues coding for seven BPPs aligned in tandem followed by the C-type natriuretic peptide. At present, there are no suggested mechanisms for understanding the release of BPPs from the precursor protein. Two constructs of the BPP precursor protein (BPP domain and BPP+CNP domains) from the venom gland of Bothrops jararaca were over-expressed, purified and the identity of both recombinant proteins confirmed by western blotting experiments. The purity of the samples was assessed by SDS-PAGE and the protein fold after expression was observed by circular dichroism and fluorescence experiments. Crystallization assays were not successful, probably due to the low protein concentration used for the experiment. Considering the low expression level observed for both recombinant proteins, the experimental methods were optimized to maximize the yield and resulted in high protein amounts in inclusion bodies. Methods were applied aiming at the solubilization of the proteins from the insoluble fraction and protein purification under denaturing conditions was carried out yielding high amounts of pure protein. Until this moment, none of the procedures were successful in producing refolded proteins. Work ...(Complete abstract click electronic access below)

Resumo: Angiotensina II, um peptídeo hipertensivo, e bradicinina, um peptídeo hipotensivo, são fatores humorais cruciais para a regulação da pressão sanguínea. A enzima chave desse sistema é a enzima conversora de angiotensina que produz angiotensina II a partir de angiotensina I e degrada bradicinina. A descoberta dos primeiros inibidores naturais dessa enzima, os peptídeos potenciadores de bradicinina (BPPs), tornou possível o desenvolvimento dos primeiros medicamentos utilizados no controle da pressão arterial humana. Caracteristicamente, os BPPs contêm de 5 a 13 resíduos de aminoácidos apresentando um resíduo de piroglutâmico no N-terminal e um resíduo de prolina no Cterminal. O precursor de BPPs encontrado na glândula de veneno de Bothrops jararaca contém 256 resíduos de aminoácidos e codifica para sete BPPs alinhados em tandem seguidos pelo peptídeo natriurético tipo-C. Até o momento, não se conhecem os mecanismos envolvidos para a liberação desses peptídeos da proteína precursora. Dessa forma, a resolução da estrutura dessa proteína pode contribuir para a elucidação do mecanismo evolvido no processamento do precursor para a liberação dos BPPs. Duas construções da proteína precursora de BPPs (domínio BPP e domínios BPP+CNP) da glândula de veneno de B. jararaca foram expressas, purificadas e suas identidades confirmadas por experimentos de western blotting. A pureza das amostras foi avaliada por SDS-PAGE e a presença de enovelamento após expressão heteróloga foi observada por experimentos de dicroísmo circular e fluorescência. Os ensaios de cristalização não foram promissores. Isso pode ser explicado pela baixa concentração da proteína usada no experimento. Assim, devido ao baixo nível de expressão de ambas as proteínas, métodos para maximização da expressão foram empregados resultando em significante...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Angiotensin II, a hypertensive peptide, and bradykinin, a hipotensive peptide, are crucial humoral factors for the regulation of blood pressure. The key enzyme for this system is the angiotensin-converting enzyme that produces angiotensin II from angiotensin I and degrades bradykinin. The discovery of the first natural inhibitors for this enzyme, the bradykinin potentiating peptides (BPPs), made it possible to develop the early drugs aimed at controlling unbalanced cardiovascular functions. Characteristically, BPPs contain 5 to 13 amino acid residues that have a pyroglutamyl residue at the N-terminus and a praline residue at the C-terminus. The BPP precursor protein contains 256 amino acid residues coding for seven BPPs aligned in tandem followed by the C-type natriuretic peptide. At present, there are no suggested mechanisms for understanding the release of BPPs from the precursor protein. Two constructs of the BPP precursor protein (BPP domain and BPP+CNP domains) from the venom gland of Bothrops jararaca were over-expressed, purified and the identity of both recombinant proteins confirmed by western blotting experiments. The purity of the samples was assessed by SDS-PAGE and the protein fold after expression was observed by circular dichroism and fluorescence experiments. Crystallization assays were not successful, probably due to the low protein concentration used for the experiment. Considering the low expression level observed for both recombinant proteins, the experimental methods were optimized to maximize the yield and resulted in high protein amounts in inclusion bodies. Methods were applied aiming at the solubilization of the proteins from the insoluble fraction and protein purification under denaturing conditions was carried out yielding high amounts of pure protein. Until this moment, none of the procedures were successful in producing refolded proteins. Work ...(Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Raghuvir Krishnaswamy Arni / Coorientador: Mirian Akemi Furue Hayashi / Banca: Fátima Pereira de Souza / Banca: Patrick Jack Spencer / Mestre

Orientador: Prof. Dr. Carlos Alberto-Silva / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Neurociência e Cognição, Santo André, 2018. / Os Peptídeos Potenciadores de Bradicinina (BPPs) são oligopeptídeos presentes na fração de baixo peso molecular (FBP) do veneno da serpente Bothrops jararaca (Bj). Estes peptídeos são descritos como inibidores naturais da Enzima Conversora de Angiotensina. Porém, eles também alteram a atividade catalítica e a expressão da argininosuccinato sintetase (AsS), favorecendo a síntese de Larginina. Este aminoácido participa de várias vias metabólicas importantes, incluindo a formação de poliaminas e agmatina com atividade neuroprotetora amplamente descrita. Além disso, FBP apresenta atividade neuroprotetora contra o estresse oxidativo induzido em cultura de células do hipocampo de ratos. Com isso, o objetivo do presente estudo foi avaliar a possível atividade neuroprotetora da FBP e BPPs sintéticos contra o estresse oxidativo induzido por H2O2 em cultura de células humanas de linhagem SH-SY5Y. A citotoxicidade do veneno bruto (VB), FBP (0,001 ¿ 10 µg/mL) e BPPs [BPP-5a; BPP-7a; BPP-10c; BPP-11e, BPP-12b e BPP-AP (0,1 ¿ 10 µM)] por 3, 6, 12, 24 e 48 h foi avaliada pelo teste de MTT. Para os ensaios de neuroproteção, a cultura de células foi previamente tratada com BPPs (1 µM) ou FBP (0,1 µg/mL) por 4 horas. Em seguida, foi adicionado H2O2 450 µM para indução do estresse oxidativo. Após 20 horas, foram realizados os ensaios de viabilidade celular. Os resultados indicaram que todos os BPPs, com exceção da FBP, foram neuroprotetores. Em especial, os peptídeos BPP-5a, BPP-7a e BPP-10c foram os mais eficientes. Os mecanismos envolvidos na neuroproteção foram avaliados pela análise das espécies reativas de oxigênio (EROs ¿ DCFH), peroxidação lipídica (TBARS), expressão da AsS e iNOS, níveis de nitrito (Griess) e o potencial de membrana mitocondrial (TMRM). Os três peptídeos reduziram a geração de EROs, síntese de NO, expressão de NF-?B e a peroxidação lipídica. Entretanto, apenas o BPP-10c aumentou os níveis de expressão da AsS. Este resultado sugere que o aumento da disponibilidade de L-arginina pode estar relacionado com o seu efeito neuroprotetor. Ainda, o BPP-10c e BPP-5a reduziram as alterações no potencial de membrana mitocondrial frente ao estresse oxidativo, um importante mecanismo na neuroproteção. Curiosamente, o BPP-7a na presença do H2O2 não reduziu a síntese de NO. Este dado sugere a inibição da oxidação do cofator enzimático BH4, um significativo ativador da NOS. Os resultados obtidos até o momento sugerem que os mecanismos envolvidos na neuroproteção são distintos, apesar destes peptídeos possuírem semelhanças estruturais. Este foi o primeiro estudo a demonstrar que os BPPs apresentam atividade neuroprotetora contra o estresse oxidativo. / The Bradykinin Potentiating Peptides (BPP), present in Low Molecular Weight Fraction (LMWF) of Bothrops jararaca (Bj), are described as natural inhibitors of angiotensin conversing enzyme (ACE) and argininossucinate synthase (AsS) activators, improving L-arginine synthesis, the agmatine and polyamines formation, which have neuroprotective properties. Have been demonstrated that LMWF show neuroprotective action on rat hippocampal cell culture. The aim of this study is to evaluate the possible neuroprotective activity of LMWF and BPPs against oxidative stress induced by H2O2 in SHSY5Y human cell line. Initially, the crude venom (CV), LMWF (0.001 ¿ 10 µg/mL) and [BPP-5a; BPP7a; BPP-10c; BPP-11e, BPP-12b e BPP-AP (0.1 ¿ 10 µM)] cytotoxicity were analyzed after 3, 6, 12, 24 e 28 h using MTT assay. For the neuroprotection assays, the cell culture was treated with BPPs (1 µM) or LMWF (0.1 µg/mL) and, after 4 h, H2O2 450 µM was added to induce oxidative stress. The cell viability assay was performed 20 h later. Our results suggest that all BPPs tested (excepting LMWF) were neuroprotective and the peptides BPP-5a, BPP-7a and BPP-10c were the most efficient. The neuroprotection mechanisms were assessed by the reactive oxygen species (ROS ¿ DCFH), lipid peroxidation (TBARS), AsS and iNOS expression, levels of nitrite (Griess) and mitochondrial membrane potential (TMRM) analyses. BPP-5a, BPP-7a and BPP-10c reduced the ROS, NO, NF-?B expression, and the lipid peroxidation. However, only BPP-10c enhanced the AsS expression, suggesting that the increase of L-arginine availability might be related to neuroprotection. In addition, BPP-10c and BPP-5a avoided the mitochondrial membrane potential promoted by H2O2. Interestingly, there is the hypothesis that only BPP-7a inhibited the co-factor BH4 oxidation because did not decrease NO synthesis. Overall, we demonstrated for the first time that the neuroprotective mechanisms of BPPs against oxidative stress could be distinct.

Os peptídeos potenciadores da bradicinina (BPPs) presentes no veneno da serpente Bothrops jararaca são oligopeptídeos ricos em prolinas. Eles foram os primeiros inibidores naturais da enzima conversora de angiotensina (ECA) descritos. As propriedades bioquímicas e farmacológicas desses peptídeos foram essenciais para o desenvolvimento do captopril, o primeiro inibidor sítio-dirigido da ECA, usado para tratar a hipertensão humana. Recentes dados têm sugerido que a atividade farmacológica dos BPPs não pode ser explicada somente pela ação inibitória da atividade da ECA e que os efeitos dos BPPs devem envolver a participação do sistema nervoso central (SNC). Nesse trabalho foi caracterizada a sinalização de Ca2+ induzida pelo BPP-10c [<ENWPHPQIPP] em células neuronais obtidas de cultura primária de cérebro de ratos neonatos. As elevações na [Ca2+]i induzida por várias concentrações de BPP-10c revelaram uma curva dose-resposta atípica. A resposta máxima de transientes de [Ca2+]i foram medidas na concentração de 1 µM de BPP-10c, enquanto que em concentrações mais elevadas houve um declínio das respostas de [Ca2+]i. Esse efeito foi independente da atividade do receptor de bradicinina (BK) e foi mediado por um receptor acoplado a Gi/0. A sinalização do BPP-10c levou a um aumento da produção de óxido nítrico (NO) por células neuronais, como decorrência da ativação da NOS, uma enzima Ca2+-dependente e da super-expressão da NO sintase endotelial (eNOS) e da argininosuccicinato sintase (ASS), enzima passo limitante no fornecimento de substrato para a NOS. Além disso, ensaios de afinidade com o BPP-10c revelaram além da ASS, a sinapsina como potencial alvo do BPP-10c no SNC. O fato do BPP-10c interagir com a sinapsina, proteína envolvida com a exocitose, e aumentar a produção de NO por células neuronais pode explicar a sua capacidade de induzir a liberação dos neurotransmissores, GABA e glutamato, ambos com importante papel na regulação da pressão arterial. O NO no SNC também age como neurotransmissor, regulando a atividade simpática e parassimpática. O BPP-10c produz queda da pressão da arterial e da freqüência cardíaca, indicando uma interferência direta na atividade autonômica simpática, parassimpática ou ambas, provocando mudanças no controle barorreflexo da freqüência cardíaca. De fato, esse peptídeo mostrou aumentar a sensibilidade barorreflexa de SHRs que está diminuída nesses animais quando comparados a ratos normotensos. Foi demonstrado também que o efeito do BPP-10c administrado perifericamente foi semelhante ao administrado centralmente, sugerindo que o efeito anti-hipertensivo do BPP-10c deve envolver o SNC. Dessa maneira, apesar do bem caracterizado efeito anti-hipertensivo baseado na inibição da ECA, esse trabalho evidencia a existência de um segundo mecanismo para ação do BPP-10c no controle da pressão arterial. No SNC, o BPP-10c modula a expressão da eNOS e da ASS e induz um aumento na produção de NO e liberação dos neurotransmissores, GABA e glutamato, para controlar a atividade simpática e/ou parassimpática que reflete no aumento da sensibilidade do barorreflexo de SHRs. Sendo assim, as características bioquímicas e farmacológicas do BPP-10c abrem perspectivas para o desenvolvimento de fármacos baseado em um novo alvo terapêutico. / Pyroglutamyl proline-rich oligopeptides, denominated bradykinin-potentiating peptides (BPPs), present in the venom of the viper Bothrops jararaca were the first described naturally occurring angiotensine-converting enzyme (ACE) inhibitors. The biochemical and pharmacological properties of theses peptides were essential for the development of captopril, the first active site-directed inhibitor of ACE, currently used to treat human hypertension. Recent data have suggested that the pharmacological activity of BPPs could not only be explained by their inhibitory action on the ACE activity and that BPPmediated effects may involve the central nervous system. In this work, we have characterized BPP-10c [<ENWPHPQIPP]-induced calcium signaling in neuronal cells obtained as primary culture from day 1 of postnatal rat brain. Elevations of [Ca2+]i induced by increasing concentrations of BPP-10c revealed an atypical dose-response curve. Maximal [Ca2+]i peak values were measured at 1 µM BPP-10c concentration, while further raising BPP-10c concentrations led to a decline of [Ca2+]i responses. This effect was independent from kinin-B2 receptor activity and was mediated by a yet unknown Gi/0 protein-coupled receptor. BPP-10c signaling promoted an increase of nitric oxide (NO) production in neuronal cells, as consequence of Ca2+-dependent NO synthase activation and upregulated gene expression of endothelial NO synthase (eNOS) and argininosuccicinato synthase (ASS), a limiting step enzyme in the NOcitrulline cycle. Furthermore, affinity chromatography assays revealed ASS and synapsin as potential binding partners of BPP-10c in the CNS. In view of that BPP-10c interacts with synapsin, a protein involved with exocytosis, and induces NO production in neuronal cells, these data could explain its capacity of inducing release of the neurotransmitters GABA and glutamate with important roles in blood pressure regulation. NO also acts as neurotransmitter in the CNS, thereby regulating sympathetic and parasympathetic activities. The presence of BPP-10c also mediates reduction of arterial pressure and heart rate suggesting direct interference of BPP action with autonomic sympathetic and/or parasympathetic activity and the baroreflex control of the heart rate. In agreement, this peptide led to increased baroreflex sensitivity of spontaneous hypertensive rats. We have also demonstrated that the BPP-10c-mediated anti-hypertensive effect was similar following peripheral or central administration, suggesting the participation of the CNS in this process. The existence of a second mechanism for BPP-10c action on blood pressure control as new therapeutic target which is independent from ACE inhibition shall initiate novel approaches for antihypertensive drugs.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-03-31. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:40Z : No. of bitstreams: 1 Publico-063.pdf: 1283927 bytes, checksum: 89787a2a88db59b03f60213385f6b0ba (MD5) / Nosso laboratório mostrou que um único gene codifica um precursor protêico, cujo processamento gera o peptídeo natriurético tipo C (CNP) e uma variedade de peptídeos ricos em prolina, conhecidos como peptideos potenciadores da bradicinina ou BPPs. Com pequenas diferenças, esse precursor é expresso na glândula do veneno e na região neuro-endócrina do cérebro da Bothrops jararaca. Todos os produtos desse processamento têm como característica comum sua ação sob o sistema cardiovascular, levando à redução da pressão arterial e da frequência cardíaca. Esse fato intrigante levou-nos a questionar se esses diferentes peptídeos teriam mecanismo de ação semelhante. Surpreendentemente, esse trabalho mostrou que a resposta é negativa embora ainda não possamos explicar detalhadamente como cada um desses peptídeos atua no complexo mecanismo responsável pelo tônus vascular e pela frequência cardíaca. Historicamente, a demonstração de que os peptídeos potenciadores da bradicinina da Bothrops jararaca (Bj-BPPs) eram inibidores naturais da enzima conversora de angiotensina (ECA) teve ampla repercussão médica. Essa inibição parecia explicar a forte ação anti-hipertensiva desses peptídeos, dai servirem de modelo estrutural para o desenvolvimento de um inibidor sítio-dirigido, o Captopril, medicamento mundialmente utilizado para o tratamento da hipertensão arterial sistêmica humana. Contudo, recentes evidências experimentais sugerem que a atividade anti-hipertensiva dos Bj-BPPs não está relacionada somente com a inibição da ECA. Nosso grupo demonstrou para o Bj-BPP-10c que sua ação anti-hipertensiva se deve à ativação da geração de L-arginina, essencial para produção de óxido nítrico, potente vasodilatador, bem como pela regulação do barorreflexo arterial e pela sinalização de cálcio intracelular, ações que contribuem para a produção de NO em células endoteliais e neurais. Outros Bj-BPPs derivados do mesmo precursor foram aqui analizados. Demonstramos que o mecanismo de ação do Bj-BPP-5a envolve receptores B2 da bradicinina, o receptor muscarínico do subtipo M1 e a produção de NO. Curiosamente, o Bj-BPP-9a que serviu de modelo para a síntese do Captopril, parece atuar predominantemente como um clássico inibidor da ECA. O Bj-BPP-11e deve ter ação num receptor de membrana, assim explicando seus efeitos sobre parâmetros cardiovasculares. O mecanismo de ação do Bj-BPP-12b poderia ser explicado pela potenciação da BK e/ou pela inbição da ECA e do Bj-BPP-13a por ação em receptor muscarínico do subtipo M3 e sobre a ASS. Adicionalmente, o presente trabalho mostrou, pela primeira vez na área de toxinologia, que toxinas de serpentes já se valem do recurso bem conhecido na geração de hormônio-peptídeos em mamíferos, isto é, utilizam o processamento de uma poliproteina para gerarem peptídeos de ação sinérgica. / Our laboratory has shown that one gene codes for the protein precursor that yields the natriuretic peptide type C (CNP) after having been processed, along with a variety of proline-rich peptides, known as bradykinin-potentiating peptides or BPPs. Showing little differences, this precursor is expressed in the venom gland and the neuroendocrine region of the Bothrops jararaca brain. All processing products have in common that they act on the cardiovascular system, lowering arterial blood pressure and heart frequency. This intriguing fact led us to question whether the different peptides display similar mechanisms of action. Surprisingly, the present study showed that the answer is negative, although we cannot, at the present time, explain in full detail how each peptide acts in the complex mechanism, responsible for vascular tonus and cardiac frequency. Historically, the demonstration that the Bradykinin-Potentiating Peptides from Bothrops jararaca (Bj-BPPs) were natural inhibitors of the angiotensin converting enzyme (ACE) had a wide medical impact. In fact, this inhibition seemed to fully explain the strong anti-hypertensive action of these peptides, therefore being employed as structural models for the development of a site-directed inhibitor, Captopril, a drug used worldwide for the treatment of systemic human arterial hypertension. Recent experimental evidences, however, suggest that the anti-hypertensive activity of the Bj-BPPs is not due exclusively to the inhibition of the ACE. Our group demonstrated that the antihypertensive action of Bj-BPP-10c, for instance, is due to the activation of L-arginine generation, which is essential for NO production, a potent vasodilator. Moreover, it also regulates the arterial baroreflex and intracellular calcium signaling, which contribute to NO production in endothelial and neuronal cells. In the present work we studied the mechanism of action of other Bj-BPPs found in the above mentioned precursor. We showed that the mechanism of action of Bj-BPP-5a involves bradykinin B2 receptor, the muscarinic receptor, subtype M1, and NO production. Bj-BPP-11e probably acts on a membrane receptor, thereby explaining its effects on cardiovascular parameters. The mechanism of action of Bj-BPP-12b might be explained by Bk potentiation and/or by ACE inhibition and Bj- BPP-13a action on by muscarinic receptor subtype M3 and the ASS. Interestingly, Bj-BPP-9a, which was the model molecule for the synthesis of Captopril, seems to act predominantly as a classic ACE inhibitor. Beside the pharmacological interest, our work also revealed, for the first time, that snake toxins also employ the well-known strategy in hormone-peptide generation, that is, they use the processing of a polyprotein to generate peptides which display a synergistic action. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Os peptídeos potenciadores da bradicinina (BPPs) presentes no veneno da serpente Bothrops jararaca são oligopeptídeos ricos em prolinas. Eles foram os primeiros inibidores naturais da enzima conversora de angiotensina (ECA) descritos. As propriedades bioquímicas e farmacológicas desses peptídeos foram essenciais para o desenvolvimento do captopril, o primeiro inibidor sítio-dirigido da ECA, usado para tratar a hipertensão humana. Recentes dados têm sugerido que a atividade farmacológica dos BPPs não pode ser explicada somente pela ação inibitória da atividade da ECA e que os efeitos dos BPPs devem envolver a participação do sistema nervoso central (SNC). Nesse trabalho foi caracterizada a sinalização de Ca2+ induzida pelo BPP-10c [<ENWPHPQIPP] em células neuronais obtidas de cultura primária de cérebro de ratos neonatos. As elevações na [Ca2+]i induzida por várias concentrações de BPP-10c revelaram uma curva dose-resposta atípica. A resposta máxima de transientes de [Ca2+]i foram medidas na concentração de 1 µM de BPP-10c, enquanto que em concentrações mais elevadas houve um declínio das respostas de [Ca2+]i. Esse efeito foi independente da atividade do receptor de bradicinina (BK) e foi mediado por um receptor acoplado a Gi/0. A sinalização do BPP-10c levou a um aumento da produção de óxido nítrico (NO) por células neuronais, como decorrência da ativação da NOS, uma enzima Ca2+-dependente e da super-expressão da NO sintase endotelial (eNOS) e da argininosuccicinato sintase (ASS), enzima passo limitante no fornecimento de substrato para a NOS. Além disso, ensaios de afinidade com o BPP-10c revelaram além da ASS, a sinapsina como potencial alvo do BPP-10c no SNC. O fato do BPP-10c interagir com a sinapsina, proteína envolvida com a exocitose, e aumentar a produção de NO por células neuronais pode explicar a sua capacidade de induzir a liberação dos neurotransmissores, GABA e glutamato, ambos com importante papel na regulação da pressão arterial. O NO no SNC também age como neurotransmissor, regulando a atividade simpática e parassimpática. O BPP-10c produz queda da pressão da arterial e da freqüência cardíaca, indicando uma interferência direta na atividade autonômica simpática, parassimpática ou ambas, provocando mudanças no controle barorreflexo da freqüência cardíaca. De fato, esse peptídeo mostrou aumentar a sensibilidade barorreflexa de SHRs que está diminuída nesses animais quando comparados a ratos normotensos. Foi demonstrado também que o efeito do BPP-10c administrado perifericamente foi semelhante ao administrado centralmente, sugerindo que o efeito anti-hipertensivo do BPP-10c deve envolver o SNC. Dessa maneira, apesar do bem caracterizado efeito anti-hipertensivo baseado na inibição da ECA, esse trabalho evidencia a existência de um segundo mecanismo para ação do BPP-10c no controle da pressão arterial. No SNC, o BPP-10c modula a expressão da eNOS e da ASS e induz um aumento na produção de NO e liberação dos neurotransmissores, GABA e glutamato, para controlar a atividade simpática e/ou parassimpática que reflete no aumento da sensibilidade do barorreflexo de SHRs. Sendo assim, as características bioquímicas e farmacológicas do BPP-10c abrem perspectivas para o desenvolvimento de fármacos baseado em um novo alvo terapêutico. / Pyroglutamyl proline-rich oligopeptides, denominated bradykinin-potentiating peptides (BPPs), present in the venom of the viper Bothrops jararaca were the first described naturally occurring angiotensine-converting enzyme (ACE) inhibitors. The biochemical and pharmacological properties of theses peptides were essential for the development of captopril, the first active site-directed inhibitor of ACE, currently used to treat human hypertension. Recent data have suggested that the pharmacological activity of BPPs could not only be explained by their inhibitory action on the ACE activity and that BPPmediated effects may involve the central nervous system. In this work, we have characterized BPP-10c [<ENWPHPQIPP]-induced calcium signaling in neuronal cells obtained as primary culture from day 1 of postnatal rat brain. Elevations of [Ca2+]i induced by increasing concentrations of BPP-10c revealed an atypical dose-response curve. Maximal [Ca2+]i peak values were measured at 1 µM BPP-10c concentration, while further raising BPP-10c concentrations led to a decline of [Ca2+]i responses. This effect was independent from kinin-B2 receptor activity and was mediated by a yet unknown Gi/0 protein-coupled receptor. BPP-10c signaling promoted an increase of nitric oxide (NO) production in neuronal cells, as consequence of Ca2+-dependent NO synthase activation and upregulated gene expression of endothelial NO synthase (eNOS) and argininosuccicinato synthase (ASS), a limiting step enzyme in the NOcitrulline cycle. Furthermore, affinity chromatography assays revealed ASS and synapsin as potential binding partners of BPP-10c in the CNS. In view of that BPP-10c interacts with synapsin, a protein involved with exocytosis, and induces NO production in neuronal cells, these data could explain its capacity of inducing release of the neurotransmitters GABA and glutamate with important roles in blood pressure regulation. NO also acts as neurotransmitter in the CNS, thereby regulating sympathetic and parasympathetic activities. The presence of BPP-10c also mediates reduction of arterial pressure and heart rate suggesting direct interference of BPP action with autonomic sympathetic and/or parasympathetic activity and the baroreflex control of the heart rate. In agreement, this peptide led to increased baroreflex sensitivity of spontaneous hypertensive rats. We have also demonstrated that the BPP-10c-mediated anti-hypertensive effect was similar following peripheral or central administration, suggesting the participation of the CNS in this process. The existence of a second mechanism for BPP-10c action on blood pressure control as new therapeutic target which is independent from ACE inhibition shall initiate novel approaches for antihypertensive drugs.