Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Durante décadas, la estructura de las membranas biológicas fue caracterizada como un Mosaico Fluido, pero posteriormente surgió evidencia de la presencia de Lipid Rafts o Microdominios Lipídicos, que son estructuras de membrana enriquecidas en esfingolípidos y colesterol que contienen diversas proteínas y cumplen roles específicos dentro de la membrana. Recientemente, se ha reportado la presencia de estas estructuras, además de una serie de canales iónicos, en las membranas del Sinciciotrofoblasto placentario humano (hSTB), epitelio sincicial responsable del intercambio materno-fetal en la gestación. Este tejido posee membrana basal y membrana apical, la cual se subdivide en dos subdominios; uno pesado o MVM y uno liviano o LMVM. Por otra parte, existen antecedentes de que la asociación de un canal de potasio a microdominios de membrana tiene implicancias en el funcionamiento del canal, por lo que, el objetivo del presente estudio es describir la segregación de los canales de potasio previamente identificado en placenta KV 2.1, KIR 2.1, TREK-1 y TASK-1 en dominios Rafts de MVM y LMVM del hSTB. A partir de placentas de término, se obtuvieron la membrana basal y los dos sub-dominios de membrana apical del hSTB. Luego, MVM y LMVM se solubilizaron con detergente Tritón-X-100 y se centrifugaron en una gradiente discontinua de sacarosa, la cual se alicuotó en once fracciones, donde las fracciones insolubles en detergente (1-5) fueron Rafts y el resto no-Rafts. Mediante Western Blot y Dot Blot, se probaron marcadores Rafts (Fosfatasa Alcalina Placentaria o PLAP y gangliósido GM1) y no-Rafts (Receptor de Transferrina Humano o hTf-R), como también los canales de potasio KV 2.1, KIR 2.1, TREK-1 y TASK-1 en las once fracciones. Los resultados indicaron que las fracciones Rafts son ricas en PLAP y GM1, mientras que las no-Rafts ricas en hTf-R, lo cual permite inferir que se lograron aislar los Lipid Rafts. En el caso de los canales de potasio, Kv 2.1 se ubicó en fracciones no-Rafts y KIR 2.1 en fracciones Rafts. La presencia de KIR 2.1 en Rafts además se confirma mediante un experimento con extracción de colesterol. Este es la primera evidencia de segregación de canales de potasio en dominios Rafts y no-Rafts realizado en el hSTB. Sabiendo que KV 2.1 se ubica en sitios no-Rafts y KIR 2.1 en sitios Rafts, resta investigar la implicancia funcional de dicha asociación en la membrana apical, ya sea en condiciones normales como en patologías de la gestación

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El sinciciotrofoblasto presenta una membrana apical y una membrana basal, que constituyen la principal barrera para el intercambio materno fetal. El cloruro (Cl-) es el principal ión extracelular y su paso através de la membrana apical ha sido ampliamente estudiado. Sin embargo, en la membrana basal el transporte de cloruro ha sido poco estudiado. El presente trabajo es el primero en describir las vías conductivas de cloruro existentes en la membrana basal (MB) del sinciciotrofoblasto trasplantado a ovocitos de Xenopus leavis a través del método de Voltage clamp. Al transplantar MB a ovocitos de Xenopus Laevis, estos muestran un aumento de corrientes de al menos 3 veces en comparación a ovocitos controles y un aumento de conductancia de cuerda a 40 mV de 5,9 μS promedio. Además a 30 mV las corrientes exógenas disminuyeron en un 51,8% al agregar ácido 4,4'-diisotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico (DIDS) y en un 52,8% al agregar ácido difenilamina-2-carboxílico (DPC), ambos conocidos bloqueadores de canales de Cl-. Estos datos demuestran la presencia vías conductivas para Cl- en la MB del sinciciotrofoblasto placentario humano / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1070695

A barreira placentária é constituída por duas camadas de células sinciciais, uma camada de células trofoblásticas gigantes e o endotélio fetal. Apesar da importância das camadas sinciciais no transporte molecular entre mãe e feto, o exato mecanismo de formação dessa barreira não está completamente elucidado em camundongos. Em humanos, estudos sugerem que a formação do sinciciotrofoblasto ocorre por um processo de fusão celular dependente de Caspase- 8, uma proteína iniciadora da cascata de apoptose. Desta forma, este estudo teve como proposta analisar o processo de formação das camadas sinciciais do labirinto em placentas de camundongos e o possível envolvimento da caspase-8 neste processo. Sítios de implantação foram coletados de camundongos fêmeas nos dias 8,5 a 11,5 de gestação e caracterizados morfologicamente através de marcadores de células precursoras sinciciais (EpCAM) e de células sinciciais maduras (Slc16A3) por meio de reações imunohitoquímicas. A expressão gênica dos marcadores diferenciais de células sinciciais também foi analisada por RT-PCR na região labiríntica dissecada nos diferentes dias de gestação. A expressão de Caspase-8 total e clivada também foi avaliada por Western blot e a relação entre a presença de Caspase-8 clivada e a indução de apoptose, avaliada por TUNEL e pela imunolocalização da Citoqueratina 18 clivada. Tambem foram realizadas análises com células labirínticas cultivadas, isoladas nos dias 8,5 a 10,5 de gestação. As células cultivadas foram caracterizadas morfologicamente e avaliadas quanto a expressão gênica de marcadores sinciciais e proteica de Caspase-8. Nossos resultados mostraram que os primeiros sinais morfológicos de formação da barreira placentária ocorream no dia 9,5 de gestação. O marcador EpCAM foi encontrado na base da placenta nos dias 8,5 e 9,5. No dia 11,5 de gestação, o labirinto já se encontra estruturado e funcional, o que foi indicado pela expressão de Slc16A3, nos dias 10,5 e 11,5 de gestação. A expressão gênica dos fatores de transcrição associados ao desenvolvimento das camadas sinciciais mostraram expressões crescentes ao longo do período estudado. Caspase-8 total e clivada mostrou intensa expressão no dia 9,5 de gestação, e aparentemente não estava associada à morte celular por apoptose, uma vez que não se detectou reatividade pela reação de TUNEL ou imunomarcação de Citoqueratina 18 clivada nas células labirínticas em formação em nenhum dos dias estudados. Células labirínticas obtidas aos 9,5 dias de gestação e cultivadas formaram ninhos celulares ao longo das 48 horas de cultura, com indícios morfológicos de sincicialização. A imunolocalização do marcador de células progenitoras do labirinto, EpCAM foi mais intensa nas culturas de 6 horas e se limitou a áreas ao redor dos ninhos celulares após 48 horas. Inversamente, a imunolocalização do transportador sincicial Slc16A3 não foi observada após 6 horas de cultura, mas foi bastante intensa no centro dos ninhos celulares após 48 horas. As culturas de labirinto de 9,5 das de gestação, também mostraram aumento de expressão das Sincitinas A e B ao longo do tempo de cultivo. A análise da expressão proteica de Caspase-8 mostrou expressão mais alta após 6 horas de cultivo do que a observada nos demais tempos experimentais. Por outro lado, a forma ativa (clivada) da caspase aumentou gradativamente após 24 e 48 horas de cultivo. Culturas submetidas ao tratamento com o inibidor farmacológico de Caspase-8 z-IEDT-fmk, mostraram perfis morfológicos alterados com redução da formação dos ninhos celulares e diminuição da reatividade ao Slc16A3. A expressão dos marcadores de diferenciação Sincitina A e B também foi significativamente diminuída (p<0.05) nestes experimentos em que a inibição da Caspase-8 clivada foi comprovada por Western blot. Estes achados mostraram a expressão de Caspase- 8, principalmente no dia 9,5 de gestação, nas células trofoblásticas labirínticas da placenta de camundongos e sugerem sua participação na formação das camadas sinciciais do labirinto. / Two layers of syncytial cells, a layer of trophoblastic giant cells and the fetal endothelium form the placental barrier. Despite the importance of the syncytial layers in molecular transport between mother and fetus, its exact developmental mechanism is still not completely elucidated in rodents. In humans, studies suggest that the formation of the syncytiotrophoblast occurs through a cell fusion process dependent on Caspase-8, an apoptosis cascade-initiating protein. In this way, this study had the proposal to analyze the process of formation of the syncytial layers of the labyrinth in placentas of mice and the possible involvement of Caspase-8 in this process. Implantation sites were collected from female mice on days 8.5 to 11.5 of gestation and morphologically characterized by the labyrinthine precursor cell marker EpCAM, and the mature syncytial cell marker - Slc16A3, through immunohistochemical reactions. The gene expression of the differential markers of syncytial cells was analyzed by RT-PCR in the labyrinthine region dissected on the different days of gestation. Total and cleaved Caspase-8 expression was also evaluated by Western blot and the relationship between the presence of cleaved Caspase-8 and the induction of apoptosis as assessed by TUNEL and the immunolocalization of the cleaved Cytokeratin 18. Analyzes were also performed with cultured labyrinth cells, isolated on days 8.5 to 10.5 of gestation. The cultured cells were characterized morphologically and evaluated for the gene expression of syncytial markers and Caspase-8 protein. Our results showed that the first morphological signs of placental barrier formation occurred on day 9.5 of gestation. The EpCAM marker was found at the base of the placenta on days 8.5 and 9.5. At day 11.5 of gestation, the labyrinth is already structured and functional, which was indicated by the expression of Slc16A3, on days 10.5 and 11.5 of gestation. The gene expression of the transcription factors associated with the development of the syncytial layers showed increased throughout the studied period. Total and cleaved Caspase-8 showed intense expression at day 9.5 of gestation, and apparently was not associated with cell death by apoptosis, since no reactivity was detected by the TUNEL reaction or cleaved Cytokeratin 18 immunolabeling in the labyrinthine zone. Labyrinthine cells obtained at 9.5 days of gestation formed nests during the 48 hours of culture, with morphological signs of syncytialization. Immunolocalization of the progenitor cell marker EpCAM was more intense in the 6-hour cultures and was limited to areas around the cell nests after 48 hours. Conversely, immunolocalization of the syncytial transporter Slc16A3 was not observed after 6 hours of culture but was quite intense at the center of the cell nests after 48 hours. Labyrinthine cell cultures of 9.5 gestation days also showed increased expression of A and B syncytins throughout the culture time. Analysis of the protein expression of Caspase- 8 showed higher expression after 6 hours of culture than that observed in the other experimental times. On the other hand, the active (cleaved) form of Caspase gradually increased after 24 and 48 hours of culture. Cultures submitted to the pharmacological inhibitor of Caspase-8 - z-IEDT-fmk showed altered morphological 18 profiles with reduction of cell nests formation and a decrease of reactivity to Slc16A3. The expression of the differentiation markers A and B Syncytins was also significantly decreased (p <0.05) in the experiments, in which the inhibition of the cleaved Caspase-8 was confirmed by Western blot. These findings show the expression of Caspase-8, mainly on day 9.5 of gestation, in the labyrinthine cells of the mice placenta and suggest its participation in the formation of the labyrinthine syncytial layers.

Made available in DSpace on 2016-08-15T20:31:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FerdinandoVFB_DISSERT.pdf: 10097957 bytes, checksum: aaf72cc9003c689e5792192fd220aef8 (MD5) Previous issue date: 2014-02-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The subplacenta is considered an ideal model for comparative studies of trophoblastic processes in humans. Thus, the aim of this study was made a morphological description of the development of the Spix s yellow-toothed cavy. To do this, 12 females were distributed in three groups in a proportion of 1 male to 4 females, kept in pickets of 5m2. Thereafter, vaginal cytology examinations were made daily, to verify if the females were copulated and to separate them from the other females. Then, the collection of subplacentas was made in the 15, 23, 30, 45, 53 and 55 days of gestation, by slaughtering the pregnant females using a specific anesthesic protocol. The samples were processed to standard histological techniques, cytochemistry and immunohistochemistry, and to transmission electronic microscopy. In the 15th day of gestation, the subplacenta was formed by a single cytotrophoblastic layer surrounded by a vacuolized syncytium with maternal lacunae which presented invasive characteristic in the portions apart of the cytotrophoblastic layer. In the 23th day of gestation, the subplacenta did not presented a well-defined shape, however, it was organized in lobules composed of predominantly of cytotrophoblast e its syncytium was related to the regions where maternal lacunae previously appeared. In the 30th day of gestation, the subplacenta appeared as a compact organ with a well-defined shape and with an evident mesenchymal capilarization; the lobules was composed by syncytiotrophoblast in the centre, and by a mesenchyme surrounded by cytotrophoblast. From the 45th day of gestation, the degeneration of the subplacental tissue was evident and the syncytiotrophoblast was more abundant than the cytotrophoblast; moreover, the syncytium was markedly vacuolized and presented signs of cellular death. Near to gestation term (53-54thday), the subplacenta was in an advanced degeneration stage, with evident signs of cellular death and reduction of subplacental tissue. The presence of fetal circulation was characteristic from the 23th day of gestation, evidenced by the positive reaction to vimentin; positive reaction to cytokeratin was observed during entire gestation. The proliferative activity of the subplacenta was assessed by PCNA and AgNOR procedures, and demonstrated to be higher in the beginning of the gestational period, decreasing progressively during the gestation. Ultrastructurally, the subplacenta presented cellular and syncytial trophoblastic characteristics. The development of the Spix s yellow-toothed cavy subplacenta starts around the 15th day of gestation, reaching maximum development in the 30th day and becomes necrotic in the end of gestation. Moreover, it presented an organization and structure similar to the subplacenta of other cavidae / A subplacenta é considerada um modelo ideal para o estudo comparativo dos processos trofoblásticos em humanos. Dessa maneira objetivou-se descrever morfologicamente o desenvolvimento da subplacenta no preá. Para isto foram utilizadas 12 fêmeas desta espécie que foram distribuídas em três grupos numa relação de um macho para quatro fêmeas, mantidos em boxes de 5m2. Após formação dos grupos, exames de citologia vaginal eram realizados diariamente, para verificação da cópula, separando-se dos grupos as fêmeas que eram cobertas. A partir da ocorrência da cópula programaram-se as coletas das subplacentas nos dias 15, 23, 30, 45, 53, e 55 da gestação e estas foram realizadas mediante sacrifício das fêmeas gestantes com a utilização de protocolo anestésico específico. O material, então, era processado segundo técnicas para histologia convencional, citoquímica, imunohistoquímica e microscopia eletrônica de transmissão. No 15° dia de gestação observou-se que a subplacenta era constituída por uma monocamada citotrofoblástica envolta por sincício que apresentava vacúolos e lacunas maternas e que ao se afastar da camada de citotrofoblasto apresentava características invasivas. Aos 23 dias de gestação a subplacenta apresentou-se ainda sem uma forma característica definida, porém, mostrava uma conformação em lóbulos compostos predominantemente por citotrofoblasto e seu sincício esteve relacionado com as regiões onde apareciam as lacunas de origem materna. Aos 30 dias de gestação a subplacenta mostrou-se como um órgão compacto de forma definida e com a capilarização do mesênquima bastante evidente, os lóbulos eram constituídos por citotrofoblasto que envolvia o mesênquima e em seu centro possuía sinciciotrofoblasto. A partir dos 45 dias de gestação a degeneração do tecido subplacentário era evidente e a quantidade de sinciciotrofoblasto supera a de citotrofoblasto, alem disto o sincício apresenta uma grande quantidade de vacúolos e sinais de morte celular podiam ser visualizados. Aproximando-se ao termo da gestação (53 e 55 dias) a subplacenta encontrava-se em avançada degeneração e os sinais de morte celular assim como a diminuição de seu tecido eram evidentes. A presença da circulação fetal foi característica a partir do 23° dia de gestação podendo ser destacada pela reação positiva a vimentina, e a reação a citoqueratina foi positiva durante toda a gestação especialmente no citotrofoblasto. A atividade proliferativa do tecido subplacentário, avaliada pelas técnicas de PCNA e AgNOR, demonstrou ser maior no inicio da gestação e decair com o avançar desta. Ultraestruturalmente evidenciou-se as características do trofoblasto celular e sincicial. O desenvolvimento da subplacenta do preá inicia-se por volta do 15° dia de gestação, tem seu auge aos 30 dias e a termo é necrótica. Além disto, é muito semelhante a subplacenta de outros cavídeos, quanto a sua organização e estrutura