Les traitements anticancéreux utilisés sur la femme jeune conduisent de plus en plus à laguérison, au prix d’une altération de la fertilité par atteinte significative de la réserveovarienne. Ces patientes à risque d’atrésie folliculaire accélérée peuvent bénéficier d’une sauvegarde de leur fertilité, le plus souvent par techniques conventionnelles d’assistance médicale à la procréation, permettant la conservation d’ovocytes et/ou d’embryons. Cependant, ces techniques ne sont pas adaptées aux patientes pré-pubères ou à celles porteuses de pathologies imposant un traitement immédiat ou contrindiquant unestimulation hormonale. Chez ces patientes, la cryoconservation du tissu ovarien est indiquée. A ce jour, au moins 18 enfants sont nés après greffes avasculaires de fragments ovariens cryoconservés, mais ces greffes ont une durée de vie limitée par souffrance ischémique initiale et comportent un risque de réimplantation de cellules malignes. La transplantation micro-vasculaire d’ovaire entier a été proposée pour palier la souffrance ischémique, tandis que l’isolation des follicules primordiaux éviterait la récidive néoplasique induite par la greffe .Dans ce travail scientifique, nous nous sommes d'abord intéressés à l'isolation des follicules primordiaux humains. Par un modèle de xénogreffe, nous avons établi que ces follicules isolés et greffés dans un caillot de fibrine pouvaient poursuivre leur développement jusqu'austade antral. Ces travaux ont été précurseurs aux progrès récents sur la culture in vitro defollicules primordiaux encapsulés. Dans la suite du travail, nous avons contribué à l'étude de la vitrification d'ovaire entier de brebis avec son pédicule vasculaire. Nous avons ainsi établi l'altération de la viabilité dupédicule vasculaire de ces organes entiers vitrifiés, alors que des études thermodynamiques préalables prouvaient que ces pédicules vasculaires étaient bien vitrifiés. Des phénomènes de cristallisation étant survenus au réchauffement de ces organes, avec pour point de départ la zone péri-ovarienne, nous nous sommes intéressés à l'exposition deces ovaires lorsqu'ils sont perfusés par les cryoprotecteurs. Nous avons montré que la perfusion d'ovaires s'accompagne de zones non exposées dans plus de 50% des ovaires perfusés, d'autant plus que l'expérimentateur est novice, que la surface de la tranche ovarienne est petite et qu'il existe un corps jaune visible. Ces zones incomplètement exposées seraient donc responsables de cristallisation lors de la vitrification de l'organe, catalysant une prise en glace globale de l'organe lors du réchauffement. Le problème serait donc plus dans une exposition incomplète aux cryoprotecteurs que dans la nature même de ces cryoprotecteurs. L'équipe lyonnaise avait déjà rapporté l'absence d'efficacité du protocole de vitrification utilisant le cryoprotecteur « VS4 » dans le rétablissement de la fertilité de brebis. Nous avons confirmé que l'utilisation du cryoprotecteur « VM3 » (vitrifiant de manière plus performanteque « VS4 »), ne permettait pas non plus le rétablissement de la fertilité après autotransplantation d'ovaires vitrifiés à la brebis. En revanche, nous avons obtenu une gestation après auto-transplantation d'ovaire de brebis cryoconservé par congélation lente, ce qui est le deuxième cas rapporté au monde. Nos résultats suggèrent que cette vitrification incomplète due à une mauvaise exposition des ovaires est l'un des principaux obstacles à la conservation de la fertilité par vitrification d'ovaire entier avec son pédicule vasculaire. / Anticancer treatments used in young women more and more lead to recovery, but with fertility disturbance due to ovarian reserve insults. These women at risk of accelerated follicle atresia can safe guard there fertility. Most of the time, it is performed with conventional Assisted Reproductive Techniques, allowing ovocytes or embryos banking. However these treatments are available neither for girls before puberty, nor when thedisease requires emergency treatments, nor for hormone dependant disease. In these cases, ovarian tissue cryobanking is indicated. To date, at least 18 babies have been born after cryopreservation and replacement of ovarian cortical strips but these grafts have a short lifespan due to initial ischemic damages and can reintroduce cancer cells on a cured woman. To control ischemic damage, cryopreservation of whole ovaries with their vascular pedicle has been proposed where as isolation of early follicles could manage the cancer reintroduction risk. In this scientific work, we first focused on isolation of early follicles. Using a xenograft model to mice with plasma clot as a vehicle, we showed that human isolated follicles can pursuit their development up to antral stage. This work motivates further progress in in-vitro cultureof encapsulates early follicles. In the second part of this work, we contributed to knowledge on vitrification of whole eweovaries with their vascular pedicle. We thus established impaired vascular viability of whole“VS4” vitrified ovaries, whereas previous calorimetric studies founded these vascular pedicles to be completely vitrified. As warming phase crystallization happened, starting from the area surrounding the ovary, we focused on the ovarian exposition when it is perused with cryoprotectors. We showed that unexposed parts are present in more than 50% of perfused ovaries, as much as the slide surface is small, a corpus luteum is present and the experimenter is inexperienced. These unexposed zones could be responsible for focal freezing during vitrification, these frozen focicatalyzing the whole organ ice crystallization during the warming phase. Hence, whole ovary vitrification failure could be due to improper cryoprotectors exposition of the organ ratherthan the inability of these cryoprotectors to promote proper tissue vitrification.Our team already failed to preserve fertility with “VS4” vitrified ewe ovaries. Neither were we able to preserve fertility with “VM3” vitrified ewe ovaries (this last cryoprotector being amore potent vitrificant solution than “VS4”), suggesting that vitrification is an inappropriate way to cryopreserve whole ewe ovaries for fertility purpose. On the other hand, we obtained a gestation after transplantation of slow frozen ewe ovaries. This gestation is the second reported worldwide. Our results suggest that vitrification of whole ovaries is impaired by improper cryoprotector exposition of ovaries through perfusion route.

Les milieux de cryopréservation d'embryons contiennent généralement des produits d'origine animale, qui présentent des inconvénients majeurs : une composition variable et insuffisamment définie, et un risque de transmission d'agents pathogènes. La substitution de ces produits par des composés synthétiques chimiquement définis pourrait contribuer à l’amélioration des procédures de cryopréservation d’embryons, en réduisant la variabilité de composition des milieux, et le risque de contamination des ressources conservées.L’objectif de ce travail était d’évaluer l’effet du remplacement de l’albumine sérique bovine utilisée dans les milieux de congélation lente ou de vitrification d’embryons cunicoles et ovins par un milieu synthétique formulé à base d’acide hyaluronique (STEM ALPHA.Cryo3 – « CRYO3 »). Dans un premier temps, les propriétés thermodynamiques des substituts potentiels ont été évaluées à l’aide de la calorimétrie différentielle à balayage. Parallèlement, nous avons optimisé les différents outils expérimentaux dont nous avions besoin pour cette étude. Nous avons adapté un protocole d’évaluation de l'activité mitochondriale (JC-1) pour complémenter l'évaluation morphologique in vitro des embryons de lapin, et nous avons évalué l’efficacité de différents protocoles de superovulation sur la production d’embryons chez la brebis. Dans un second temps, nous avons procédé à la substitution de l’albumine sérique bovine (BSA) utilisée dans des milieux de congélation lente et de vitrification d’embryons cunicoles et ovins par du CRYO3. Une approche in vitro a été utilisée pour les protocoles de congélation et de vitrification, puis complétée par une approche in vivo pour les protocoles de vitrification.Nos résultats confirment que la BSA peut être efficacement remplacée par le CRYO3 dans des protocoles de cryoconservation d‘embryons de lapin et d’embryons ovins, qu’il s’agisse de congélation lente ou de vitrification / Embryo cryopreservation media usually contain animal-derived products, such as bovine serum albumin (BSA). These products present two major disadvantages: an undefined variable composition and a risk of pathogen transmission. The substitution of animal products of embryo cryopreservation media by synthetical products may improve procedure standardization (by avoiding variability in media composition) and avoid sanitary concerns inherent to animal-derived products.We aimed to evaluate the effect of replacing BSA in rabbit and ovine embryo slow freezing and vitrification media with a synthetic animal products free medium composed of synthetic hyaluronic acid: STEM ALPHA.Cryo3 (« CRYO3 »).During the first part, we evaluated the substitution candidates through a thermodynamic approach, using differential scanning calorimetry. In paralel, we adapted a mitochondrial activity evaluation protocol (JC-1) to rabbit embryo, which allowed us to complement morphological in vitro evaluation, and evaluated ewe superovulation protocols.During the second part, we used a biological approach to evaluate the replacement of BSA with synthetical products (containing CRYO3) in rabbit and ovine embryo slow freezing and vitrification media, using in vitro (slow freezing and vitrification) and in vivo (vitrification) evaluation methods.Our results seem to demonstrate that the chemically defined substitute CRYO3 can successfully replace BSA during rabbit embryo and ovine embryo cryopreservation (slow-freezing and vitrification)

Plusieurs composés présents dans les solutions de cryoconservation pour embryons sontsource de préoccupations : soit du point de vue sanitaire à cause de leur origine animale, soitdu fait de leur rôle potentiellement mutagène, notamment pour certains cryoprotecteurspénétrants. Leur retrait ou leur substitution par des composés chimiquement définis pourraitdonc constituer une amélioration sensible des techniques de cryoconservation des embryons.C’est dans ce cadre de réflexion que s’inscrit notre travail.Souvent, la conception et la mise en oeuvre des protocoles de cryoconservation sontempiriques. Il en résulte de nombreuses variations entre les études qui rendent lacomparaison des résultats obtenus d’autant plus difficile. Dans notre démarche, deuxapproches complémentaires ont été associées :•La première, physique, s’appuie sur l’utilisation de la calorimétrie différentielle à balayage(DSC) pour standardiser la comparaison des différentes solutions de congélation lente.Ainsi, les propriétés thermodynamiques de solutions contenant un substituant défini ontété caractérisées et comparées à celles de solutions contenant des produits de référence(sérum de veau foetal ou albumine bovine sérique) ;• La seconde, biologique, a consisté à congeler des embryons de lapins produits in vivo etdes embryons bovins produits in vitro, puis à analyser les taux de survie après culture invitro et/ou transferts. Cette approche a permis d’objectiver les propriétés biologiques dessolutions ainsi définies.Nos résultats confirment qu’il est judicieux d’utiliser une approche thermodynamiquepour sélectionner des molécules chimiquement différentes des composés habituellementutilisés. / Several compounds in embryo cryopreservation solutions are a source of concern:products of animal origin because of the sanitary risks, and the permeating cryoprotectantsbecause of their potential mutagenic effect. Removing or substituting these compounds withchemically defined products might improve embryo cryopreservation technics.Conception and use of cryopreservation protocols are often empirical. This empiricismleads to many variations between the studies which make a comparison between results allthe more difficult. In our study, two complementary approaches were associated:• The first approach (physical) consisted of using the differential scanning calorimetry tostandardize the comparison between different slow-freezing solutions. So, thethermodynamic properties of solutions containing a potential substitute were characterizedand compared to those obtained with solutions containing reference products (fetal calfserum and bovine serum albumin) ;• The second approach (biological) consisted of using freezing of in vivo-produced rabbitembryos or freezing of in vitro-produced bovine embryos in order to evaluate survival

La cryopréservation, dans le domaine de la reproduction médicalement assistée, constitue depuis de nombreuses années une branche suscitant beaucoup d’intérêts et d’espoirs. En effet, de nombreuses équipes de recherche se sont attelées à mettre au point et à améliorer des protocoles permettant de conserver les gamètes, les embryons et les tissus reproducteurs.<p>Malgré le fait que la cryopréservation soit une technique très attractive, elle peut avoir des effets délétères sur les cellules. Les protocoles expérimentaux visent donc à minimiser ces effets afin d’augmenter la survie et la compétence cellulaire après décongélation.<p><p>Les deux méthodes les plus utilisées, la congélation lente et la vitrification, présentent chacune des avantages et des inconvénients. En effet, la première ne permet pas d’éliminer la cristallisation intracellulaire. Quant à la seconde, elle empêche la formation de cristaux de glace mais pourrait provoquer une toxicité due à la forte concentration des cryoprotecteurs. <p><p>Cette thèse de doctorat propose plusieurs objectifs :<p><p>•\ / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les méthodes d’amélioration des procédures de cryoconservation sont traditionnellement basées sur l’empirisme. Pour s’en démarquer, nous sommes repartis des modèles biophysiques développés pour décrire les procédures en s’appuyant sur 2 méthodes. La 1ère méthode a consisté au développement de techniques de simulation des procédures en caractérisant l’utilisation du Snomax dans l’appareil DSC. Nous avons montré que le contrôle de la température de nucléation (Tn) est possible en choisissant les conditions expérimentales (volume d’échantillon et concentration en Snomax) qui influencent les probabilités de présence de 3 sous-populations d’INA des protéines de P. syringae. La possibilité d’effectuer des simulations a pu être validée pour certaines plages de surfusion dans les solutions de cryoconservation. Ceci a permis la caractérisation des effets physiques influencés par Tn et qui interviennent au cours des procédures et d’alimenter les modèles biophysiques de cryoconservation. La 2ème méthode a consisté à la modification de la composition des solutions afin de réduire le recours au DMSO (cytotoxique) en utilisant des composés de type oligosaccharides : les COS. Après vérification de la biocompatibilité des COS avec des cellules embryonnaires, la caractérisation de l’influence thermodynamique des COS a été effectuée. Il a été montré que les COS sont des cryostabilisateurs qui se lient à une petite quantité de molécule d’eau et n’en affecte pas les propriétés physicochimiques. Les COS peuvent donc être introduits dans le milieu extracellulaire sans risque d’accélérer la déshydratation cellulaire. De plus, il a été montré qu’ils favorisent la gélification du milieu extracellulaire, laquelle est fonction de la proportion massique d’eau en solution résiduelle. Cette gélification fige une partie du système ce qui favorise sa stabilisation au passage des zones de températures à risques de recristallisation / We wished to move aside classical cryopreservation procedure improvements that are based on empiricism and to focus on existing biophysical models in order to describe procedures. We based our study on two methods. The first method consisted in developing the methods for the simulations of procedures, by characterizing the use of Snomax in a DSC device. This study highlighted that the nucleation temperature (Tn) control is possible under precise experimental conditions (sample volume and Snomax concentration) that influence the presence probability of 3 INA subpopulations of the P. syringae protein aggregates. The possibility to simulate the cryopreservation procedures has been achieved for some supercooling ranges within complex cryopreservation solutions. Consequently, it has been possible to characterize the physical effects influenced by Tn and involved within procedures. These results will participate in supplying cryopreservation biophysical models. The second method aimed to modify the composition of cryopreservative solutions in order to reduce the DMSO use (because of its cytotoxicity), using extracellular CPA components: the chitooligosaccharides COS. Subsequent to the biocompatibility verification of the COS with embryonic cells, the thermodynamic influence of the COS has been characterized. Therefore, it has been demonstrated that COS are cryostabilizers that link themselves to a small number of water molecules and does not influence its physicochemical properties. Consequently, COS can be added within the extracellular space without any risk to accelerate the cell dehydration. It has been demonstrated that COS favor the gelation of the extracellular space and that this gelation relies on the mass proportion of water in the residual solution. This gelation immobilizes a part of the system and therefore favor its stabilization when the temperature reaches the risky recrystallization range