O meduloblastoma (MB) é o tumor maligno cerebral mais frequente em crianças e adolescentes. Trata-se de uma doença heterogênea sob o aspecto genético, sendo reconhecido ao menos 12 subgrupos genético-moleculares, com impacto na apresentação clínicopatológica. Pacientes do subgrupo SHH apresentam mutação somática em genes da via Hedgehog, incluindo PTCH1, SUFU, SMO e ativação dos genes GLI1 e GLI2. Mutações no gene TP53 também podem estar presentes, particularmente em crianças acima de 3 anos, e conferem um pior prognóstico. O trióxido de arsênio (ATO) possui ação inibitória sobre os genes da via SHH, mas pouco se sabe sobre sua ação no MB. O presente estudo objetivou avaliar os potenciais efeitos citotóxicos e radiossensibilizantes do ATO sobre as linhagens de MB pediátrico grupo SHH (ONS-76: TP53-selvagem; DAOY: TP53-mutado c.725G>T e UW402, TP53-mutado c.464C>A). Foram comparadas as taxas de proliferação celular, clonogenicidade e apoptose nas linhagem de MB antes e após o tratamento com ATO. Também foi avaliada a clonogenicidade da associação droga e irradiação. Foram investigadas proteínas responsáveis pelo reparo dos danos causados ao DNA (Rad51 e Ku86) através de Western Blot. Foi realizada análise da expressão gênica relativa por QPCR e estudados genes que integram a via SHH, assim como efetores finais desta via de sinalização. A viabilidade celular foi monitorada nos tempos de 24 à 120 horas pelo ensaio de resazurina. A taxa de apoptose foi mensurada por meio de marcação com anexina e iodeto de propídio e avaliada por citometria de fluxo. Os ensaios foram realizados em triplicata e analisados por One Way e Two Way ANOVA, utilizando o pós-teste Bonferroni, e sendo considerados resultados significativos valores de p<0,05. Foi possível observar uma diminuição na viabilidade celular após tratamento com ATO nas três linhagens estudadas. Além disso, houve uma diminuição significativa na capacidade clonogênica. Observou-se também um aumento nas taxas de apoptose nas linhagens, sendo acima de 70% de morte celular para a linhagem DAOY. Foi observado que o tratamento com ATO radiossensibilizou a linhagem UW402, TP53-mutado. Não foi encontrada associação com proteínas de reparo no tempo e dose estudados. O estudo de expressões relativas dos genes estudados demonstrou inibição, principalmente nas linhagens de interesse DAOY e UW402 -(SHH TP53) mutado. Estes achados in vitro apontam para um efeito citotóxico do ATO sobre as linhagens de MB pediátrico, podendo apresentar efeito radiossenssibilizante. O ATO deve ser melhor explorado como droga alvo para MB SHH+, em caráter experimental. / Medulloblastoma (MB) is the most common malignant brain tumor in children and adolescents. It is a heterogeneous disease under the genetic aspect, with at least 12 geneticmolecular subgroups being recognized, with impact on the clinical-pathological presentation. Patients of the SHH subgroup present somatic mutation in genes of the Hedgehog pathway, including PTCH1, SUFU, SMO and activation of the genes GLI1 and GLI2. Mutations in the TP53 gene may also be present, particularly in children over 3 years, and confer a worse prognosis. The arsenic trioxide (ATO) has an inhibitory action on SHH pathway genes, but little is known about its action. The present study aimed to evaluate the potential cytotoxic and radiosensitizing effects of ATO on the pediatric MB cells of SHH group (ONS-76: TP53- wild type; DAOY: TP53-mutated c.725GT and UW402 TP53-mutated c.464C>A). Cell proliferation, clonogenicity and apoptosis were compared in the MB strains following ATO treatment. The clonogenicity assay of ATO combined with irradiation was also evaluated. We investigated proteins responsible for repairing DNA damage and performed Western blotting of the Rad51 and Ku86 proteins. Gene expression analysis was performed using the real-time PCR. Selected genes integrating the SHH pathway as well as final effectors of signaling were also assesed. Cell viability was monitored at endpoints from 24 to 120h by the resazurin assay. The rate of apoptosis was measured by labeling with annexin and propidium iodide, as assessed by flow cytometry. The assays were performed in triplicate and analyzed by One Way and Two Way ANOVA, using the Bonferroni post-test, and being considered significant results a p value less than 0.05. It was possible to observe a decrease in cell viability in the three studied strains. In addition, there was a significant decrease in clonogenic capacity. There was also an increase in the apoptosis rates in the lineages, being above 70% of cell death for the DAOY lineage. It was found that the ATO treatment radiosensitized the UW402 strain - TP53-mutated. No association with time and dose of ATO and irradiation on the repair proteins was found. The study of the relative expressions of the studied genes demonstrated inhibition, mainly in the mutant line of interest DAOY and UW-402, a SHHTP53 mutated cell-line. These in vitro findings point to a cytotoxic effect of ATO on pediatric medulloblastoma lines, with a potential radiosensitizing effect. This study offers rationale for further assesment of ATO on SHH-MB, either alone or along with radiotherapy as a preclinical drug.

O meduloblastoma (MB) é o tumor maligno cerebral mais frequente em crianças e adolescentes. Trata-se de uma doença heterogênea sob o aspecto genético, sendo reconhecido ao menos 12 subgrupos genético-moleculares, com impacto na apresentação clínicopatológica. Pacientes do subgrupo SHH apresentam mutação somática em genes da via Hedgehog, incluindo PTCH1, SUFU, SMO e ativação dos genes GLI1 e GLI2. Mutações no gene TP53 também podem estar presentes, particularmente em crianças acima de 3 anos, e conferem um pior prognóstico. O trióxido de arsênio (ATO) possui ação inibitória sobre os genes da via SHH, mas pouco se sabe sobre sua ação no MB. O presente estudo objetivou avaliar os potenciais efeitos citotóxicos e radiossensibilizantes do ATO sobre as linhagens de MB pediátrico grupo SHH (ONS-76: TP53-selvagem; DAOY: TP53-mutado c.725G>T e UW402, TP53-mutado c.464C>A). Foram comparadas as taxas de proliferação celular, clonogenicidade e apoptose nas linhagem de MB antes e após o tratamento com ATO. Também foi avaliada a clonogenicidade da associação droga e irradiação. Foram investigadas proteínas responsáveis pelo reparo dos danos causados ao DNA (Rad51 e Ku86) através de Western Blot. Foi realizada análise da expressão gênica relativa por QPCR e estudados genes que integram a via SHH, assim como efetores finais desta via de sinalização. A viabilidade celular foi monitorada nos tempos de 24 à 120 horas pelo ensaio de resazurina. A taxa de apoptose foi mensurada por meio de marcação com anexina e iodeto de propídio e avaliada por citometria de fluxo. Os ensaios foram realizados em triplicata e analisados por One Way e Two Way ANOVA, utilizando o pós-teste Bonferroni, e sendo considerados resultados significativos valores de p<0,05. Foi possível observar uma diminuição na viabilidade celular após tratamento com ATO nas três linhagens estudadas. Além disso, houve uma diminuição significativa na capacidade clonogênica. Observou-se também um aumento nas taxas de apoptose nas linhagens, sendo acima de 70% de morte celular para a linhagem DAOY. Foi observado que o tratamento com ATO radiossensibilizou a linhagem UW402, TP53-mutado. Não foi encontrada associação com proteínas de reparo no tempo e dose estudados. O estudo de expressões relativas dos genes estudados demonstrou inibição, principalmente nas linhagens de interesse DAOY e UW402 -(SHH TP53) mutado. Estes achados in vitro apontam para um efeito citotóxico do ATO sobre as linhagens de MB pediátrico, podendo apresentar efeito radiossenssibilizante. O ATO deve ser melhor explorado como droga alvo para MB SHH+, em caráter experimental. / Medulloblastoma (MB) is the most common malignant brain tumor in children and adolescents. It is a heterogeneous disease under the genetic aspect, with at least 12 geneticmolecular subgroups being recognized, with impact on the clinical-pathological presentation. Patients of the SHH subgroup present somatic mutation in genes of the Hedgehog pathway, including PTCH1, SUFU, SMO and activation of the genes GLI1 and GLI2. Mutations in the TP53 gene may also be present, particularly in children over 3 years, and confer a worse prognosis. The arsenic trioxide (ATO) has an inhibitory action on SHH pathway genes, but little is known about its action. The present study aimed to evaluate the potential cytotoxic and radiosensitizing effects of ATO on the pediatric MB cells of SHH group (ONS-76: TP53- wild type; DAOY: TP53-mutated c.725GT and UW402 TP53-mutated c.464C>A). Cell proliferation, clonogenicity and apoptosis were compared in the MB strains following ATO treatment. The clonogenicity assay of ATO combined with irradiation was also evaluated. We investigated proteins responsible for repairing DNA damage and performed Western blotting of the Rad51 and Ku86 proteins. Gene expression analysis was performed using the real-time PCR. Selected genes integrating the SHH pathway as well as final effectors of signaling were also assesed. Cell viability was monitored at endpoints from 24 to 120h by the resazurin assay. The rate of apoptosis was measured by labeling with annexin and propidium iodide, as assessed by flow cytometry. The assays were performed in triplicate and analyzed by One Way and Two Way ANOVA, using the Bonferroni post-test, and being considered significant results a p value less than 0.05. It was possible to observe a decrease in cell viability in the three studied strains. In addition, there was a significant decrease in clonogenic capacity. There was also an increase in the apoptosis rates in the lineages, being above 70% of cell death for the DAOY lineage. It was found that the ATO treatment radiosensitized the UW402 strain - TP53-mutated. No association with time and dose of ATO and irradiation on the repair proteins was found. The study of the relative expressions of the studied genes demonstrated inhibition, mainly in the mutant line of interest DAOY and UW-402, a SHHTP53 mutated cell-line. These in vitro findings point to a cytotoxic effect of ATO on pediatric medulloblastoma lines, with a potential radiosensitizing effect. This study offers rationale for further assesment of ATO on SHH-MB, either alone or along with radiotherapy as a preclinical drug.

La voie de signalisation activée par la protéine Sonic Hedgehog (Shh) est connue pour son rôle majeur au cours de l’embryogenèse et en particulier dans la prolifération et la spécification cellulaire ou encore le guidage axonal au cours de l’établissement des structures du système nerveux. Depuis quelques années, ce morphogène a aussi été identifié comme un régulateur important de plusieurs processus physiologiques du cerveau adulte comme le maintien de la neurogenèse ou la régulation de l’activité électrique de certains neurones (Traiffort et al., 2010). La suractivation de la voie Shh dans un cerveau sain entraine une augmentation significative de la prolifération des cellules progénitrices des oligodendrocytes (OPCs), la source des oligodendrocytes matures, les cellules responsables de la formation des gaines de myéline (Loulier et al., 2006). Au cours de ma thèse, j’ai étudié le potentiel que représente l’activation de la voie Shh dans la régulation de ces progéniteurs dans un contexte de démyélinisation. Pour cela, j’ai utilisé une souris transgénique plp-GFP, chez laquelle la protéine fluorescente verte est exprimée par les cellules du lignage oligodendrocytaire. Après avoir caractérisé le profil d’expression de la GFP dans le cerveau mature de ces souris, j’ai mis au point un modèle de démyélinisation focale par injection stéréotaxique d’un détergent spécifique de la myéline, la lysolécithine (LPC). J’ai identifié les cellules du lignage oligodendrocytaire comme source directe de protéines Shh au sein de la lésion à un temps très précoce après l’injection de LPC. Les gènes cibles de la voie Shh sont aussi fortement induits dans cette population cellulaire à une période plus tardive, correspondant à la différenciation des OPCs en cellules matures. L’utilisation d’adénovirus codant soit pour Shh lui-même soit pour son antagoniste physiologique Hip, m’a permis de réaliser des expériences de gain et de perte de fonction et ainsi d’analyser comment la modulation de la voie Shh peut influencer sur le processus de régénération des oligodendrocytes suite à une lésion. La surexpression de Shh permet d’augmenter la prolifération des OPCs mais aussi d’accélérer leur différenciation, aboutissant à un nombre plus élevé d’oligodendrocytes matures plus précocement au cours du processus de remyélinisation. De plus, il est intéressant de constater que la densité des cellules astrocytaires et microgliales, notamment associées au processus inflammatoire, diminue dans la lésion chez les animaux ayant reçu l’adénovirus Shh comparés au animaux contrôles. A l’inverse, le blocage de la voie induit l’arrêt complet de la production de nouveaux oligodendrocytes. Au-delà de l’amélioration de notre compréhension de la physiologie et de la régulation du lignage oligodendrocytaire dans le cerveau adulte, l’ensemble de ce travail montre de quelle manière la voie Shh peut représenter une nouvelle piste dans la recherche de cibles thérapeutiques dans les affections de la myéline telles que la sclérose en plaques. / The Sonic Hedgehog (Shh) signaling pathway is known for its role during embryogenesis and in particular for controlling cell proliferation and specification, as well as axon guidance. In recent years, this morphogen has also been identified as an important regulator of several physiological processes in the adult brain such as the maintenance of neurogenesis or the regulation of the electrophysiological propreties of mature neurons (Traiffort et al., 2010). Overactivation of the Shh pathway in a healthy brain causes a significant increase in the proliferation of oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), the source of mature oligodendrocytes, the cells responsible for the formation of myelin sheaths (Loulier et al., 2006).In my thesis, I studied the effects of the Shh pathway activation on OPC regulation in the context of demyelination. To that purpose, I used a plp-GFP transgenic mouse, in which the green fluorescent protein (GFP) is expressed by cells belonging to the oligodendrocyte lineage. After characterization of the expression pattern of GFP in the mature brain of these mice, I developed a model of focal demyelination by stereotaxic injection of lysolecithin (LPC). I identified the oligodendrocyte lineage cells as a source of Shh protein within the lesion, soon after the LPC injection. Target genes of the Shh pathway are also strongly induced in this cell population, at a time corresponding to the differentiation of OPCs into mature cells. The use of adenoviral vectors encoding either Shh itself or its physiological antagonist Hip allowed me to conduct gain- and loss-of-function experiments. This way I could analyze how the modulation of Shh pathway may influence the regeneration ofoligodendrocytes after injury. Shh overexpression increases the survival and proliferation of OPCs but also accelerates their differentiation, resulting in a higher number of mature oligodendrocytes earlier during the remyelination process. In addition, the density of astrocytes and microglia, associated with the inflammatory process, is decreased in animalsreceiving the Shh adenoviral vector compared to control animals. Altogether these effects are associated with a reduction of the lesion. Conversely, blocking the pathway induced a complete arrest of new oligodendrocyte production. Besides the fundamental knowledge gained about the molecular mechanism involved in the oligodendroglial precursor cells survival, proliferation, differentiation and myelin repair in vivo, this project should also give valuable insights concerning the potential use of pharmacological modulators of Shh signaling as a novel therapeutic approach for the treatment of multiple sclerosis and other myelin diseases.

Au cours des dernières années, des progrès significatifs ont été réalisés dans la prévention des épisodes de démyélinisation qui surviennent au cours de la sclérose en plaques, mais beaucoup moins dans le domaine de la régénération de la myéline détruite. Notre équipe a précédemment démontré que la protéine Sonic Hedgehog (Shh) est un régulateur positif des progéniteurs oligodendrocytaires favorisant la réparation de la myéline dans un modèle de démyélinisation induite par injection focale de lysolécithine dans le corps calleux chez la souris. Cependant, les mécanismes moléculaires mis en jeu restent encore largement méconnus. Mon projet de thèse consiste à explorer le rôle d'un co-récepteur de Shh, Boc, une glycoprotéine reliée aux molécules d'adhésion cellulaire (CAM) et fortement induite à l’issue d’une démyélinisation. Dans un premier temps, nous avons focalisé nos investigations sur la caractérisation du mutant Boc knockout au cours de la myélinisation développementale. Nos résultats révèlent des activités région et temps spécifiques de Boc sur les mécanismes de prolifération et de maturation des progéniteurs oligodendrocytaires. De plus, les souris Boc knockout présentent un phénotype d’hypermyélinisation qui apparaît au cours des premières semaines post-natales et persiste à l’âge adulte.Dans un second temps, nous avons déterminé l'effet de l'absence de Boc sur les processus de démyélinisation et de réparation de la myéline. En utilisant le modèle d’injection focale de lysolécithine dans le corps calleux, nous avons démontré un retard dans la maturation des progéniteurs oligodendrocytaires et une réduction de la régression des lésions chez les souris dépourvues de Boc.Nos résultats indiquent ainsi un rôle positif de Boc dans le processus de régénération faisant suite à une démyélinisation. Par ailleurs, l’absence de Boc diminue la réaction gliale inflammatoire étroitement associée au mécanisme de régénération de la myéline. L’ensemble de nos résultats indique une activité différente du récepteur au cours des processus de myélinisation et de remyélinisation du système nerveux central. Ces données originales contribuent à la caractérisation d’une composante de la signalisation Hedgehog impliquée dans le processus régénératif associé aux pathologies démyélinisantes. Ces résultats seront importants à considérer dans le cadre de l’approche thérapeutique des maladies démyélinisantes. / During the last years, significant progress have been made in preventing demyelinating events that occur during multiple sclerosis, but much less in the field of regeneration of the lost myelin. Our team has previously demonstrated that the Sonic Hedgehog (Shh) protein is a positive regulator of oligodendrocyte progenitors enhancing myelin repair in a demyelination model relying on the focal injection of lysolecithin into the corpus callosum. However, the molecular mechanisms that are involved are still largely unknown. My thesis project was aimed at exploring the role of a co-receptor of Shh, Boc, a glycoprotein linked to the cell adhesion molecules (CAM) and strongly induced during myelin repair. First, we focused our investigations on the characterization of the Boc knockout mutant during developmental myelination. Our results reveal region and time specific activities for Boc in the mechanisms of proliferation and maturation of oligodendrocyte progenitors. In addition, Boc knockout mice exhibit hypermyelination that occurs in the firstpostnatal weeks and persists until adulthood In a second step, we determined the effect of the absence of Boc in the processes of demyelination and myelin repair. Using the model of focal injection of lysolecithin into the corpus callosum, we demonstrated a delay in oligodendrocyte maturation and a decrease in lesion regression in the Boc knockout mice. Thus, our results indicate a positive role for Boc in the regeneration process following demyelination.Furthermore, the absence of Boc decreases the inflammatory glial reaction closely associated with myelin repair. Altogether, our results indicate a different activity of the receptor during the processes of myelination and remyelination in the central nervous system. These original data contribute to the characterization of a component of the Hedgehog signaling pathway involved in the regenerative process associated with demyelinating pathologies.Those results will be important to consider in the context of the therapeutic approach of the demyelinating diseases.

Le médulloblastome est la plus fréquente des tumeurs pédiatriques malignes du cerveau et est divisé en quatre sous-groupes moléculaires. Le groupe Sonic Hedgehog (SHH), caractérisé par l’activation de la voie SHH, présente une surexpression du facteur de transcription basique hélice-boucle-hélice Atoh1. Atoh1 est essentiel pour le développement du cervelet et plus spécifiquement pour la formation des précurseurs des cellules granulaires, qui sont aussi la cellule d’origine du médulloblastome SHH. Dans le médulloblastome SHH, Atoh1 agit comme un facteur pro-tumoral en collaboration avec la voie SHH. De plus, l’inhibition des niveaux protéiques d’Atoh1 inhibe la prolifération tumorale in vitro et in vivo. Etant donnée l’importance de la protéine Atoh1 dans la formation du médulloblastome SHH, Atoh1 pourrait être une cible thérapeutique potentielle pour traiter le médulloblastome SHH. Cependant, les mécanismes de régulation d’Atoh1 sont encore mal connus.Les modifications post-traductionnelles sont connues pour réguler les niveaux protéiques dans les cellules. Plusieurs types de modifications régulent la dégradation protéique et elles incluent l’ubiquitination et la phosphorylation. Nous avons décidé de nous concentrer dans un premier temps sur le rôle potentiel de la phosphorylation d’Atoh1 sur sa fonction et régulation durant le développement du cervelet et la formation de médulloblastome.Par une analyse de spectrométrie de masse, nous avons identifié douze sites de phosphorylation sur la protéine Atoh1. Parmi ces douze sites, seulement deux, la sérine 328 (S328) et la sérine 339 (S339), sont importantes pour la stabilité et la fonction de la protéine. En effet, les deux mutants de phosphorylation spécifiques de ces deux sites, Atoh1-S328A et Atoh1-S339A, ont une demi-vie plus longue ainsi qu’une activité transcriptionnelle augmentée dans les précurseurs des cellules granulaires par rapport à la forme sauvage d’Atoh1. Nous avons ensuite réalisé une purification d’affinité en tandem différentielle suivie par une analyse par la technologie d’identification protéique multidimensionnelle (MudPIT) pour définir les partenaires phospho-spécifiques d’Atoh1. Nous avons découvert que l’ubiquitine ligase E3 Huwe1 est responsable de la dégradation d’Atoh1 de manière phospho-dépendante dans les progéniteurs des cellules granulaires. Nous avons aussi montré que SHH protège Atoh1 de la dégradation médiée par Huwe1 par l’intermédiaire des phosphatases de la famille des PP2A. De manière importante, ce mécanisme de régulation d’Atoh1 est nécessaire au bon développement du cervelet. De plus, dans le contexte tumoral, un faible niveau d’ARNm d’HUWE1 est associé à une mauvaise survie chez les patients ayant un medulloblastome SHH.Au vu de ces résultats, nous souhaitons étudier plus en détail le rôle de la phosphorylation d’Atoh1 ainsi que la contribution de ce nouveau mécanisme dans le médulloblastome. Nous souhaiterions ainsi exploiter nos résultats pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le médulloblastome SHH. / Medulloblastoma (MB) is the most common pediatric malignant brain tumor and is divided in four subgroups by gene profiling. The well-known subgroup harboring an activation of the Sonic Hedgehog (SHH) pathway shows an upregulation of the proneural basic helix-loop-helix transcription factor Atoh1. Atoh1 is essential for cerebellum development and more specifically for the formation of the granule neuronal progenitors (GNPs), which are the cells of origin of SHH induced MB. In tumoral context, Atoh1 acts as a pro-tumor factor in cooperation with SHH pathway. In addition, the inhibition of Atoh1 protein level prevents MB proliferation in vitro and in vivo. Thus, given the strong implication of Atoh1 protein in MB formation, Atoh1 seems to be a potential therapeutic target to treat SHH MB. However, up to date, mechanisms underlying its regulation remain to be elucidated. Posttranslational modifications are known to regulate protein levels in cells. Several modifications regulate protein turnover including the two most prominent, ubiquitination and phosphorylation. We decided to focus primarily our study on a potential role of Atoh1’s phosphorylation on its function and regulation both during cerebellar development and MB genesis. Using mass spectrometry analysis, we identified twelve phosphorylation sites on Atoh1 protein. Among them, only two, the serine 328 (S328) and serine 339 (S339), were critical for Atoh1 stability and function. The two single phospho-deficient mutants, Atoh1-S328A and Atoh1-S339A, displayed a longer half-life and increased transcriptional activity in granule neuron progenitors when compared to the wild-type form of Atoh1. Next, we employed differential tandem affinity purification followed by Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT) analysis to define Atoh1 phospho-specific partners. We uncovered that the E3 ubiquitin ligase Huwe1 is responsible for Atoh1 degradation in a phospho-dependent manner in granule neuron progenitors. We also discovered that SHH protects Atoh1 against its degradation mediated by Huwe1 through the phosphatases of PP2A family. Importantly, this machinery is required for proper cerebellar development and we highlighted that low levels of HUWE1 are associated with a poor prognosis in patient harboring a SHH medulloblastoma.Given this data, we wish to dissect the role of Atoh1 phosphorylation, and the contribution of this new pathway in MB. We anticipate exploiting our findings to develop new therapeutic strategies in SHH MB.

Le médulloblastome (MB), une tumeur formée à partir du cervelet en développement, est l’un des cancers pédiatriques malins les plus fréquents. Des profils d’expression géniques ont montré l’existence de quatre groupes distincts de MB qui présentent des profils moléculaires et des pronostics différents. Parmi ces groupes, l’un d’entre eux est caractérisé par une activation de la voie de signalisation Sonic Hedgehog (SHH). Ce groupe de MB provient des précurseurs de neurones en grain lors du développement cérébelleux. Les traitements actuels comprennent la chirurgie, la chimiothérapie ainsi que la radiothérapie, ce qui a pour effet d’altérer les capacités cognitives et sociales des survivants. Ainsi, des efforts considérables ont été mis en œuvre dans le but de trouver des cibles thérapeutiques afin de bloquer spécifiquement les mécanismes tumorigéniques sans affecter le développement normal. De récentes analyses à grande échelle ont révélé le rôle crucial de mécanismes épigénétiques, et en particulier dans le groupe SHH, dans lequel la perte de fonction d’un certain nombre de modificateurs chromatiniens a été identifiée. Ainsi, l'objectif principal de ma thèse est d'étudier l'implication de potentiels candidats modificateur chromatinien, à la fois au cours du développement cérébelleux et lors du MB SHH. Nous avons concentré notre étude sur plusieurs modificateurs de la chromatine qui ont été trouvés mutés dans les MB SHH humains. Nous avons commencé l’étude avec trois modificateurs chromatiniens sélectionnés selon (i) leur impact sur la survie, (ii) leur expression au cours du développement du cervelet, (iii) leur expression dans les MB SHH humains et nous sommes finalement concentré sur un.Afin d'étudier ce candidat, un objectif important de ma thèse a été de développer des outils fiables. Dans ce contexte, nous avons développé des modèles de souris knock-out conditionnelles et le système CRISPR-cas9 dans le développement cérébelleux postnatal afin d'étudier l'impact de la perte du candidat à la fois dans le développement du cervelet et dans le MB SHH. Ensuite, nous nous sommes intéressés aux mécanismes moléculaires contrôlés par ce modificateur de la chromatine. Plus précisément, nous avons défini (i) l’interactome, et (ii) des cibles transcriptionnelles spécifiques qui nous ont aidé à comprendre comment une protéine impliquée dans la modification de la chromatine peut favoriser l’état tumoral. En conclusion, ces travaux permettent de mettre en évidence comment la perte de la fonction de modificateur chromatinien spécifique peut différemment affecter le destin cellulaire dans le développement normal cérébelleux et dans le MB SHH et soulève la question d’une prise en charge plus personnalisée des patients atteints de MB SHH. / Medulloblastoma (MB), a tumor arising from the developing cerebellum, is one of the most common malignant pediatric brain tumors. Gene expression profiling showed the existence of four groups of MB with distinct molecular profiles and patient outcomes. Among these groups, one of them is associated with an activation of the Sonic Hedgehog (SHH) pathway.This specific group is thought to arise from cerebellar Granule Neuron Progenitors (GNPs) during cerebellar development. The actual treatment is heavy and consists of surgery, chemotherapy as well as radiotherapy impairing social and cognitive ability of survivors. Thus, considerable effort has been made in order to find drug targets that would specifically block tumorigenic mechanisms without affecting normal development.Recent large scale analysis revealed the crucial role of epigenetic mechanisms, and especially in the SHH group of MB in which loss of function mutation of several chromatin modifiers has been identified. Thus, the main goal of my PhD is to study the involvement of potential candidate chromatin modifiers both during cerebellar development and in SHH MB.We focused our study on several chromatin modifiers that were found mutated in human SHH MB. We began to study three chromatin modifiers that were selected according to (i) their impact on survival, (ii) their expression during cerebellar development, (iii) their expression in human SHH MB and finally we selected one for further functional validation.In order to study this candidate, one important goal of my PhD has been to develop reliable tools. In that context, we developed conditional knock-out mice models and the CRISPR-Cas9 system in postnatal cerebellar development in order to study the impact of the loss of this chromatin modifier both in cerebellar development and SHH MB initiation. Then, we investigated the molecular mechanisms controlled by this chromatin modifier. In particular, we defined (i) the interactome, and (ii) specific target genes that helped us understanding how a protein implicated in chromatin modification can favor tumors. In conclusion, this work provides insights into how the loss of function of a specific chromatin modifier can differentially affect cell fate in the context of normal cerebellar development and in SHH MB, stressing the question of a more personalized patient care.

Pendant le développement du cervelet, les progéniteurs des neurones granulaires (PNG) nécessitent la présence du cil primaire pour proliférer en réponse à Sonic Hedgehog (SHH). En effet, la prolifération dérégulée des PNGs peut conduire à la formation d'une tumeur pédiatrique maligne appelée SHH-médulloblastome (MB), de ce fait comprendre comment le cil primaire est régulé dans les PNGs est crucial.Nous montrons que le facteur de transcription Atoh1 contrôle la présence du cil primaire dans les PNGs in vitro et in vivo. En particulier, la suppression du cil primaire par l’inactivation génétique de gènes impliqués dans la ciliogenèse (par exemple, Kif3a ou Ift88) empêche Atoh1 de maintenir les PNGs en prolifération, ce qui indique qu’Atoh1 favorise l’expansion des PNGs en maintenant la présence du cil primaire. D’un point de vue moléculaire, Atoh1 contrôle la formation du cil primaire en régulant le bon positionnement peri-centrosomal des satellites centriolaires (SC), complexes protéiques essentiels pour la ciliogenèse. L'inactivation de Atoh1 dans les PNGs perturbe en effet la distribution subcellulaire des SCs, altérant ainsi inévitablement la ciliogenèse. Cette nouvelle fonction de Atoh1 est gouvernée par la régulation transcriptionnelle directe d'un composant clé des SCs, Cep131. L’expression ectopique de Cep131 dans les PNGs restore les effets liés à l'inactivation d'Atoh1, rétablissant la localisation correcte du SC et comme conséquence la présence d’un cil primaire.De plus, nous avons montré que cette voie Atoh1-SC-cil primaire-SHH contrôlant la prolifération des PNGs est également conservée dans le contexte du SHH-MB, où Atoh1 est surexprimée et essentielle pour sa formation et sa maintenance.Ces données révèlent un mécanisme par lequel la ciliogenèse est régulée dans des progéniteurs de neurones, offrant de nouvelles informations sur la neurogenèse dans le cervelet et sur la pathogenèse du SHH-MB. / Cerebellar granule neuron progenitors (GNPs) require the primary cilium to proliferate in response to Sonic Hedgehog (SHH) during cerebellar development. As aberrant proliferation of GNPs may lead to SHH-type medulloblastoma (SHH-MB), a pediatric brain tumor, understanding which mechanisms control ciliogenesis in GNPs represents a major interest in the field. Here, we show that the proneural bHLH transcription factor Atoh1 controls the presence of primary cilia in GNPs both in vitro and in vivo, thus maintaining GNPs responsive to the mitogenic effects of SHH. Indeed, loss of primary cilia induced via knockdown of specific ciliary components (e.g. Kif3a and Ift88) abolishes the ability of Atoh1 to keep GNPs in proliferation in vivo. Mechanistically, Atoh1 controls ciliogenesis by regulating the proper peri-centrosomal clustering of centriolar satellites (CS), large multiprotein complexes working as essential machineries for ciliogenesis. Knockdown of Atoh1 in GNPs perturbs CS subcellular distribution, leading to impairment of ciliogenesis. Luciferase reporter assays and chromatin immunoprecipitation experiments indicate that Atoh1 can directly regulate the expression of Cep131, a key CS core component. Importantly, ectopic expression of Cep131 in GNPs depleted of Atoh1, is sufficient to restore proper CS localization and consequent primary cilia formation, indicating that the Atoh1-Cep131-CS axis is responsible for ciliogenesis in GNPs.In addition, we further demonstrated that these functions of Atoh1 are conserved in the context of SHH-MB, where Atoh1 is typically overexpressed and acts as a lineage-dependent transcription factor.These data reveal a mechanism whereby ciliogenesis is regulated in neuron progenitors providing novel insights into cerebellar neurogenesis and pathogenesis of SHH-MB.

During embryogenesis, airway epithelial cells possess primary cilia, and HH signaling guides lung development. As epithelial cells mature, they produce hundreds of motile cilia and continue to produce the sonic hedgehog (SHH) ligand, which is found apically in the thin layer of liquid covering airways. However, whether ciliated airway cells express apical HH signaling components and what their function might be have remained unknown. Here we show that motile cilia are enriched for HH signaling proteins, including patched 1 and smoothened. These cilia are also enriched for proteins affecting cAMP-dependent signaling, including Gαi and adenylyl cyclase 5/6. Surprisingly, SHH in differentiated airway epithelia did not elicit the canonical SHH signaling pathway that regulates transcription during development. But instead, activating HH signaling decreases intracellular levels of cAMP, which reduces ciliary beat frequency and airway surface liquid pH, similar to changes that have been observed in the airway of people with chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Furthermore, we observed that significant increase of SHH ligand expression in differentiated airway epithelia with COPD, suggesting a potential role of SHH signaling in the pathogenesis of airway disease. Collectively, our study indicates that airway cilia detect apical SHH to mediate airway physiology through noncanonical HH signaling. SHH may dampen defenses at the contact point between the environment and the lung, perhaps counterbalancing processes that stimulate airway defenses. This may suggest a potential role of SHH signaling in the pathogenesis of airway disease, such as COPD.

The caudal fin of zebrafish (danio rerio) is often used to study regeneration thanks to its extraordinary regenerative ability, easy access, and relative simplicity in structure. Branching morphogenesis is observed in many organs, including lungs and salivary glands in mammals, as well as the fin rays in zebrafish and is thought to follow unifying principles. An important developmental gene, sonic hedgehog a (shha), has been shown in other studies to play an essential role in the branch formation. Previous studies in our lab have shown that the transient depletion of the shha-expressing cells following laser ablation of the shha-expressing cells in the regenerating caudal fin results in a delay of fin rays branch formation. In order to study the long-term effect of ablating the shha-expressing cells, I generated a new zebrafish transgenic line (Tg)(2.4shha:CFP-NTR-ABC) to perform a conditional cell ablation using the Metronidazole/Nitroreductase (Mtz/NTR) system. Preliminary data suggest that cell ablation using the Mtz/NTR system is successful in the Tg(2.4shha:CFP-NTR-ABC) embryos. In addition, short-term ablation of the shha-expressing cells through Mtz/NTR system delays branch formation during caudal fin regeneration of the Tg(2.4shha:CFP-NTR-ABC) adult fish. Further work will involve the analysis of the effects of the long-term ablation of the shha-expressing cells and the involvement of other signaling pathways in the ray branching formation during zebrafish caudal fin regeneration. This study can provide insights into understanding of the molecular mechanisms underlying branching morphogenesis in various organs. During the course of the above project, I have observed an organ-wide response to local injury in the zebrafish caudal fin. In this study, I have shown, for the first time, an immediate organ-wide response to partial fin amputation characterized by the damage of blood vessels, nerve fibers and the activation of inflammatory response in the non-amputated tissues. I established that the adult zebrafish caudal fin serves as an excellent model for the study of the organ-wide response to local injury, and such study may provide new insights into the field of regenerative medicine in which stimulating regeneration locally may trigger responses in unintended locations.   Résumé La nageoire caudale du poisson zèbre (danio rerio) est souvent utilisée pour étudier les mécanismes de régénération à cause de son extraordinaire capacité de régénération, son accès facile, et sa relative simplicité structurale. La morphogenèse de branches est observée dans plusieurs organes incluant les poumons et les glandes salivaires chez les mammifères ainsi que les rayons des nageoires du poisson zèbre et est supposée suivre des principes communs. Un important gène de développement, sonic hedgehog a (shha), joue un rôle essentiel dans la formation des branches. Des études précédentes effectuées dans notre laboratoire ont montré que l’absence transitoire des cellules exprimant shha dans des expériences d’ablation au rayon laser induit un délai de la formation des branches dans les rayons au cours de la régénération de la nageoire caudale. Afin d’étudier les effets de l’ablation à long terme des cellules exprimant shha, j’ai fait un nouvelle lignée transgénique de poisson zèbre Tg(2.4shha:CFP-NTR-ABC) pour effectuer une ablation cellulaire conditionnelle à l’aide du système Métronidazole / Nitroréductase (Mtz/NTR). Mes données préliminaires suggèrent que l’ablation cellulaire à l’aide du système Mtz/NTR fonctionne sur les embryons Tg(2.4shha:CFP-NTR-ABC). De plus, l’ablation à court terme des cellules exprimant shha à l’aide du système Mtz/NTR induit un délai de la formation des branches au cours de la régénération des rayons la nageoire caudale des poissons adultes Tg(2.4shha:CFP-NTR-ABC). Des études supplémentaires incluront l’analyse des effets de l’ablation à long terme des cellules exprimant shha et le rôle d’autres cascades de signalisation dans la formation des branches des rayons au cours de la régénération de la nageoire caudale du poisson zèbre. Cette étude pourrait fournir des informations concernant la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à la formation de branches dans des organes variés. Au cours de l’étude décrite ci-dessus, j’ai fait l’observation d’une réponse globale de toute la nageoire caudale à une blessure locale. Dans cette étude, j’ai montré pour la première fois, une réponse immédiate et globale après amputation partielle de la nageoire. Cette réponse est caractérisée par des lésions des vaisseaux sanguins, des fibres nerveuses et par l’activation d’une réponse inflammatoire dans les tissus non-amputés. J’ai établi que la nageoire caudale du poisson zèbre adulte est un excellent modèle pour l’étude de la réponse globale d’un organe à une lésion locale. Une telle étude pourrait fournir de nouvelles informations pertinentes à la médecine régénérative qui, en visant à stimuler la régénération de façon locale, peut entraîner des réponses dans des domaines non voulus.

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