L'étude porte sur la réalisation d'un support plan fonctionnalisé et structuré pour l’immobilisation d’un nombre limité de biomolécules sondes telles que des carbohydrates, des protéines, des anticorps. Les supports sont des lames commerciales silanisées avec un amino-silane sur les deux faces. Des composés fluorescents porteurs de fonctions aldéhyde ou acide ont été utilisés comme modèles pour valider les greffages covalents sur ces supports via une liaison imine ou amide respectivement. Pour localiser les greffages, des puits en polymère de géométrie contrôlée à base de résine SU-8 ont été directement fabriqués sur la surface par un procédé de stéréolithographie. Le greffage de deux fluorophores acides a été réalisé simultanément dans différents puits sur un même support. La localisation des réactions a été caractérisée par spectroscopie et/ou microscopie de fluorescence. Pour permettre la fixation de composés porteurs d’une ou plusieurs fonctions aldéhyde, tels que des anticorps après oxydation des carbohydrates présents sur leur fragment Fc, un bras espaceur de type polyoxyéthylène terminé par une fonction aminooxy ou hydrazide a été synthétisé directement sur la surface des supports. / This work deals with manufacturing functionalized and patterned plane substrates to immobilize a few biological components like carbohydrates, proteins or antibodies. The substrates are commercial glass microscope slides silanized with an amino linker on the two sides. Covalent binding on such substrates has been successfully tested using fluorophores as models with carboxylic acid or aldehydic function to afford respectively amide or imine bond with the amino functions of the support. To localize chemical graftings, polymeric regular and geometrically controlled wells were manufactured from SU-8 photoresist directly on the glass support, applying stereolithography process. Grafting of two fluorophores with carboxylic functions activated by N-hydroxysuccinimide was led simultaneously inside polymeric wells on a same substrate. Localized bindings were characterized by fluorescence spectroscopy and/or microscopy. In order to enable covalent attachment through a stable chemical linkage of aldehydic components, like antibodies after oxidation of their Fc fragment, aminooxy and hydrazide terminated polyoxyethylene spacers were directly synthesized on substrates surface

La disponibilité et la persistance à l'échelle locale des métaux lourds pourraient être critiques notamment pour l'usage futur des zones agricoles ou urbaines, au droit desquelles de nombreux sites industriels se sont installés dans le passé. La gestion de ces situations environnementales complexes nécessitent le développement de nouvelles méthodes d'analyse peu invasives (capteurs environnementaux), comme celles utilisant des biosenseurs bactériens, afin d'identifier et d'évaluer directement l'effet biologique et la disponibilité chimique des métaux. Ainsi dans ce travail de thèse, nous avons cherché à identifier, à l'aide d'outils mathématiques de l'algèbre multilinéaire, les réponses de senseurs bactériens fluorescents dans des conditions environnementales variées, qu'il s'agisse d'un stress engendré par la présence à forte dose d'un métal ou d'une carence nutritive engendrée par son absence. Cette identification est fondée sur l'analyse quantitative à l'échelle d'une population bactérienne de signaux multidimensionnels. Elle repose en particulier sur (i) l'acquisition de données spectrales (fluorescence) multi-variées sur des suspensions de biosenseurs multicolores interagissant avec des métaux et sur (ii) le développement d'algorithme de décomposition tensoriels. Les méthodes proposées, développées et utilisées dans ce travail s'efforcent d'identifier « sans a priori» a minima, la réponse fonctionnelle de biosenseurs sous différentes conditions environnementales, par des méthodes de décomposition de tenseurs sous contraintes des signaux spectraux observables. Elles tirent parti de la variabilité des réponses systémiques et permettent de déterminer les sources élémentaires identifiant le système et leur comportement en fonction des paramètres extérieurs. Elles sont inspirées des méthodes CP et PARALIND . L'avantage de ce type d'approche, par rapport aux approches classiques, est l'identification unique des réponses des biosenseurs sous de faibles contraintes. Le travail a consisté à développer des algorithmes efficaces de séparations de sources pour les signaux fluorescents émis par des senseurs bactériens, garantissant la séparabilité des sources fluorescentes et l'unicité de la décomposition. Le point original de la thèse est la prise en compte des contraintes liées à la physique des phénomènes analysés telles que (i) la parcimonie des coefficients de mélange ou la positivité des signaux source, afin de réduire au maximum l'usage d'a priori ou (ii) la détermination non empirique de l'ordre de la décomposition (nombre de sources). Cette posture a permis aussi d'améliorer l'identification en optimisant les mesures physiques par l'utilisation de spectres synchrones ou en apportant une diversité suffisante aux plans d'expériences. L'usage des spectres synchrones s'est avéré déterminant à la fois pour améliorer la séparation des sources de fluorescence, mais aussi pour augmenter le rapport signal sur bruit des biosenseurs les plus faibles. Cette méthode d'analyse spectrale originale permet d'élargir fortement la gamme chromatique des biosenseurs fluorescents multicolores utilisables simultanément. Enfin, une nouvelle méthode d'estimation de la concentration de polluants métalliques présents dans un échantillon à partir de la réponse spectrale d'un mélange de biosenseurs non-spécifiques a été développée / Availability and persistence of heavy metals could be critical for future use of agricultural or urban areas, on which many industrial sites have installed in the past. The management of these complex environmental situations requiring the development of new analytical methods minimally invasive, such as bacterial biosensors, to identify and directly assess the biological effects and the chemical availability of metals. The aims of this thesis was to identify the responses of fluorescent bacterial sensors various environmental conditions, using mathematical tools of algebra multi-linear, whether stress caused by the presence of high dose of a metal or a nutrient deficiency caused by his absence. This identification is based on quantitative analysis of multidimensional signals at the bacterial population-scale. It is based in particular on (i) the acquisition of multivariate spectral data on suspensions of multicolored biosensors interacting with metals and (ii) the development of algorithms for tensor decomposition. The proposed methods, developed and used in this study attempt to identify functional response of biosensors without \textsl{a priori} by decomposition of tensor containing the spectral signals. These methods take advantage of the variability of systemic responses and allow to determine the basic sources identifying the system and their behavior to external factors. They are inspired by the CP and PARALIND methods. The advantage of this approach, compared to conventional approaches, is the unique identification of the responses of biosensors at low constraints. The work was to develop efficient algorithms for the source separation of fluorescent signals emitted by bacterial sensors, ensuring the sources separability and the uniqueness of the decomposition. The original point of this thesis is the consideration of the physical constraints of analyzed phenomena such as (i) the sparsity of mixing coefficients or positivity of sources signals in order to minimize the use of a priori or (ii) the non-empirical determination of the order of decomposition (number of sources).This posture has also improved the identification optimizing physical measurements by the use of synchronous spectra or providing sufficient diversity in design of experiments. The use of synchronous spectra proved crucial both to improve the separation of fluorescent sources, but also to increase the signal to noise ratio of the lowest biosensors. This original method of spectral analysis can greatly expand the color range of multicolored fluorescent biosensors used simultaneously. Finally, a new method of estimating the concentration of metal pollutants present in a sample from the spectral response of a mixture of non-specific biosensor was developed

Maîtriser l'impact des maladies sur les cultures est un défi majeur de l'agriculture moderne. Cette préoccupation est un aspect important de l'optimisation de la productivité, notamment en viticulture. En France, le mildiou de la vigne causé par Plasmopara viticola est une des maladies cryptogamiques responsable des épidémies les plus dévastatrices et les plus redoutées. Les traitements reposent sur l'utilisation préventive, systématique et onéreuse de composés chimiques antifongiques dont l'utilisation massive constitue un risque à la fois pour l'homme et l'environnement. La réduction de l'utilisation de fongicide implique le développement d'outils de diagnostic au champ, qui requiert la compréhension des interactions entre la plante et les agents pathogènes. Les travaux de cette thèse pluridisciplinaire ont porté sur le pathosystème Plasmopara viticola - Vitis vinifera, notamment pour répondre à l'intérêt croissant pour un outil de diagnostic en temps réel de la maladie utilisable au vignoble. Les stilbènes sont des phytoalexines impliqués dans la défense de certaines plantes supérieures vis-à-vis de stress biotiques et abiotiques. L'autofluorescence de ces composés phénoliques, dont la biosynthèse est induite dans les feuilles de vigne par P. viticola, en fait un potentiel marqueur naturel de l'infection. En effet, la faible autofluorescence bleu-verte des feuilles de vigne saines est considérablement renforcée par l'autofluorescence violet-bleue des stilbènes à la surface de feuilles de vigne infectée par P. viticola. Cette étude a montré que quelque soit le niveau de résistance du génotype, l'autofluorescence violet-bleue des stilbènes induit par l'infection est présente au niveau des parois des cellules de l'épiderme. En dehors de la concentration, la viscosité s'est révélé être la principale variable physico-chimique influençant l'intensité de l'autofluorescence des stilbènes dans les différents compartiments cellulaires des feuilles de vigne. Ceci explique la fluorescence intense des parois, particulièrement rigides, des cellules de garde (stomates) des feuilles infectées. Le suivi cinétique journalier a révélé la nature transitoire de l'autofluorescence des stilbènes lors de l'infection. La robustesse et l'intérêt de ce signal a également été validée par la mesure à différentes échelles (de la cellule à la feuille entière) et avec différentes méthodes fluorimétriques. Les résultats de ce travail ont permis des avancées sur la connaissance du rôle de composés phénoliques induits et constitutifs dans la défense contre P. viticola. En plus de la localisation de l'autofluorescence des stilbènes en surface des feuilles, la microscopie confocale couplée à la microspectrofluorimetrie a révélé différentes localisations de ces phytoalexines dans la profondeur des tissus en corrélation avec le niveau de résistance des génotypes. L'utilisation de l'autofluorescence des stilbènes comme marqueur de l'infection a permis de mettre en évidence : 1) le fait que les flavonols constitutifs des feuilles de V. vinifera retardent le développement de l'infection par P. viticola; et 2) le fait que les acides hydroxycinnamiques constitutifs ne semble pas participer à la défense contre P. viticola. Enfin, une nouvelle méthode de diagnostic non-destructive du mildiou sur feuille basée sur l'autofluorescence des stilbènes a été développée. Elle a montré une détection pré-symptomatique du mildiou sur les feuilles de vigne entières dès le premier jour après l'infection sur la face abaxiale et le troisième jour sur la face adaxiale. Cette méthode de diagnostic du mildiou a été validée au laboratoire notamment grâce à un prototype de capteur proximal développé en collaboration avec la société Force-A. La validation de la méthode au vignoble dans le cadre d'infection naturelle est la prochaine étape pour une utilisation de ce capteur optique dans le cadre de l'agriculture durable et de la sélection variétale.

Maîtriser l’impact des maladies sur les cultures est un défi majeur de l’agriculture moderne. Cette préoccupation est un aspect important de l’optimisation de la productivité, notamment en viticulture. En France, le mildiou de la vigne causé par Plasmopara viticola est une des maladies cryptogamiques responsable des épidémies les plus dévastatrices et les plus redoutées. Les traitements reposent sur l’utilisation préventive, systématique et onéreuse de composés chimiques antifongiques dont l’utilisation massive constitue un risque à la fois pour l’homme et l’environnement. La réduction de l’utilisation de fongicide implique le développement d’outils de diagnostic au champ, qui requiert la compréhension des interactions entre la plante et les agents pathogènes. Les travaux de cette thèse pluridisciplinaire ont porté sur le pathosystème Plasmopara viticola - Vitis vinifera, notamment pour répondre à l’intérêt croissant pour un outil de diagnostic en temps réel de la maladie utilisable au vignoble. Les stilbènes sont des phytoalexines impliqués dans la défense de certaines plantes supérieures vis-à-vis de stress biotiques et abiotiques. L’autofluorescence de ces composés phénoliques, dont la biosynthèse est induite dans les feuilles de vigne par P. viticola, en fait un potentiel marqueur naturel de l’infection. En effet, la faible autofluorescence bleu-verte des feuilles de vigne saines est considérablement renforcée par l’autofluorescence violet-bleue des stilbènes à la surface de feuilles de vigne infectée par P. viticola. Cette étude a montré que quelque soit le niveau de résistance du génotype, l’autofluorescence violet-bleue des stilbènes induit par l’infection est présente au niveau des parois des cellules de l’épiderme. En dehors de la concentration, la viscosité s’est révélé être la principale variable physico-chimique influençant l’intensité de l’autofluorescence des stilbènes dans les différents compartiments cellulaires des feuilles de vigne. Ceci explique la fluorescence intense des parois, particulièrement rigides, des cellules de garde (stomates) des feuilles infectées. Le suivi cinétique journalier a révélé la nature transitoire de l’autofluorescence des stilbènes lors de l’infection. La robustesse et l’intérêt de ce signal a également été validée par la mesure à différentes échelles (de la cellule à la feuille entière) et avec différentes méthodes fluorimétriques. Les résultats de ce travail ont permis des avancées sur la connaissance du rôle de composés phénoliques induits et constitutifs dans la défense contre P. viticola. En plus de la localisation de l’autofluorescence des stilbènes en surface des feuilles, la microscopie confocale couplée à la microspectrofluorimetrie a révélé différentes localisations de ces phytoalexines dans la profondeur des tissus en corrélation avec le niveau de résistance des génotypes. L’utilisation de l’autofluorescence des stilbènes comme marqueur de l’infection a permis de mettre en évidence : 1) le fait que les flavonols constitutifs des feuilles de V. vinifera retardent le développement de l’infection par P. viticola; et 2) le fait que les acides hydroxycinnamiques constitutifs ne semble pas participer à la défense contre P. viticola. Enfin, une nouvelle méthode de diagnostic non-destructive du mildiou sur feuille basée sur l’autofluorescence des stilbènes a été développée. Elle a montré une détection pré-symptomatique du mildiou sur les feuilles de vigne entières dès le premier jour après l’infection sur la face abaxiale et le troisième jour sur la face adaxiale. Cette méthode de diagnostic du mildiou a été validée au laboratoire notamment grâce à un prototype de capteur proximal développé en collaboration avec la société Force-A. La validation de la méthode au vignoble dans le cadre d’infection naturelle est la prochaine étape pour une utilisation de ce capteur optique dans le cadre de l’agriculture durable et de la sélection variétale. / Controlling the impact of diseases on crops is a major challenge of modern agriculture. This concern is an important aspect of optimizing productivity, notably in viticulture. In France, downy mildew caused by Plasmopara viticola is a fungal disease responsible for the most devastating epidemics. The preventive and systematic treatments are expensive, while the massive use of antifungal chemicals is a risk to both humans and the environment. Reducing the use of fungicide involves the development of diagnostic tools in the field, which requires understanding the interactions between plants and pathogens. The work of this multidisciplinary thesis focused on the pathosystem Plasmopara viticola - Vitis vinifera, especially to meet the growing interest in a real-time diagnostic tool of disease applicable in the vineyard. Stilbenes are phytoalexins involved in the defense of certain higher plants against biotic and abiotic stresses. The autofluorescence of these phenolic compounds, whose biosynthesis is induced in grapevine leaves by P. viticola, makes it a potential marker of natural infection. Indeed, the low blue-green autofluorescence of grapevine leaves is greatly enhanced by the violet-blue autofluorescence of stilbenes on the surface of leaves infected by P. viticola. This study showed that whatever the level of resistance in various genotypes, violet-blue autofluorescence induced by stilbene is present in the walls of epidermal cells. In addition to their concentration, viscosity proved the main physico-chemical variable affecting the intensity of the autofluorescence of stilbenes in different compartments of vine leaves. This explains the intense fluorescence of the walls, particularly rigid, of guard cells (stomata) of infected leaves. Daily monitoring revealed a kinetic with a transient rise of the autofluorescence of stilbenes during infection. The robustness and value of this signal was also validated by measuring at different levels (cellular to whole leaf) and with various fluorimetric methods (imaging, spectroscopy, proximal sensing). These results advance our understanding of the role of constitutive and induced phenolic compounds in plant defence against P. viticola. In addition to a common location of the autofluorescence of stilbenes on the leaf surface, confocal microscopy coupled with microspectrofluorometry revealed distinctive localizations of these phytoalexins in the deep tissue correlated with the level of resistance in genotypes. This aspect no doubt needs broader testing. The use of autofluorescence of stilbene as a marker of infection allowed us to ascertain that: 1) constitutive flavonols of the leaves of V. vinifera retard the development of infection by P. viticola and 2) the constitutive hydroxycinnamic acids do not seem to participate in the defence against P. viticola. Finally, a new method for the non-destructive diagnosis of leaf infection based on the autofluorescence of stilbenes has been developed. We have demonstrated a pre-symptomatic detection of downy mildew on whole grape leaves from the first day after infection on the abaxial surface and from the third day on the adaxial surface. This method of diagnosis has been validated in the laboratory thanks to a proximal sensor prototype developed in collaboration with the company Force-A. The validation of the method in the vineyard in a context of natural infections is the next step for use of this optical sensor as a tool for sustainable agriculture and for genetic screening.

La disponibilité et la persistance à l'échelle locale des métaux lourds pourraient être critiques notamment pour l'usage futur des zones agricoles ou urbaines, au droit desquelles de nombreux sites industriels se sont installés dans le passé. La gestion de ces situations environnementales complexes nécessitent le développement de nouvelles méthodes d'analyse peu invasives (capteurs environnementaux), comme celles utilisant des biosenseurs bactériens, afin d'identifier et d'évaluer directement l'effet biologique et la disponibilité chimique des métaux. Ainsi dans ce travail de thèse, nous avons cherché à identifier, à l'aide d'outils mathématiques de l'algèbre multi-linéaire, les réponses de senseurs bactériens fluorescents dans des conditions environnementales variées, qu'il s'agisse d'un stress engendré par la présence à forte dose d'un métal ou d'une carence nutritive engendrée par son absence. Cette identification est fondée sur l'analyse quantitative à l'échelle d'une population bactérienne de signaux multidimensionnels. Elle repose en particulier sur (i) l'acquisition de données spectrales (fluorescence) multivariées sur des suspensions de biosenseurs multicolores interagissant avec des métaux et sur (ii) le développement d'algorithme de décomposition tensoriels. Les méthodes proposées, développées et utilisées dans ce travail s'efforcent d'identifier " sans \textsl{a priori} " (\textsl{a minima}), la réponse fonctionnelle de biosenseurs sous différentes conditions environnementales, par des méthodes de décomposition de tenseurs sous \hyphenation{con-train-tes} des signaux spectraux observables. Elles tirent parti de la variabilité des réponses systémiques et permettent de déterminer les " sources " élémentaires identifiant le système et leur comportement en fonction des paramètres extérieurs. Elles sont inspirées des méthodes CP et PARALIND . L'avantage de ce type d'approche, par rapport aux approches classiques, est l'identification unique des réponses des biosenseurs sous de faibles contraintes. Le travail a consisté à développer des algorithmes efficaces de séparations de sources pour les signaux fluorescents émis par des senseurs bactériens, garantissant la séparabilité des sources fluorescentes et l'unicité de la décomposition. Le point original de la thèse est la prise en compte des contraintes liées à la physique des phénomènes analysés telles que (i) la parcimonie des coefficients de mélange ou la positivité des signaux "source", afin de réduire au maximum l'usage d'a priori ou (ii) la détermination non empirique de l'ordre de la décomposition (nombre de sources). Cette posture a permis aussi d'améliorer l'identification en optimisant les mesures physiques par l'utilisation de spectres synchrones ou en apportant une diversité suffisante aux plans d'expériences. L'usage des spectres synchrones s'est avéré déterminant à la fois pour améliorer la séparation des sources de fluorescence, mais aussi pour augmenter le rapport signal sur bruit des biosenseurs les plus faibles. Cette méthode d'analyse spectrale originale permet d'élargir fortement la gamme chromatique des biosenseurs fluorescents multicolores utilisables simultanément. Enfin, une nouvelle méthode d'estimation de la concentration de polluants métalliques présents dans un échantillon à partir de la réponse spectrale d'un mélange de biosenseurs non-spécifiques a été développée.