Ulm, Univ., Diss., 2008.

Ulm, Univ., Diss., 2008.

Zsfassung in dt. Sprache. - Würzburg, Univ., Diss., 2008

Würzburg, Univ., Diss., 2008. / Zsfassung in dt. Sprache.

Würzburg, Univ., Diss., 2009. / Zsfassung in dt. Sprache.

Würzburg, Univ., Diss., 2004.

Universiẗat, Diss., 2003--Köln.

Fabry disease (FD) is an X-linked lysosomal storage disorder caused by deficiency of the α-galactosidase A (GLA), leading to intracellular accumulations of globotriaosylceramide (Gb3). Acral burning pain, which can be triggered by heat, fever or physical activity is an early hallmark of FD and greatly reduces patients’ quality of life. The pathophysiology of FD pain is unknown and research is hindered by the limited in vivo availability of suitable human biomaterial. To overcome this obstacle, we generated induced pluripotent stem cells (iPSC) from one female and two male patients with a differing pain phenotype, and developed a refined differentiation protocol for sensory neurons to increase reliability and survival of these neurons, serving as an in vitro disease model. Neurons were characterized for the correct neuronal subtype using immunocytochemistry, gene expression analysis, and for their functionality using electrophysiological measurements. iPSC and sensory neurons from the male patients showed Gb3 accumulations mimicking the disease phenotype, whereas no Gb3 depositions were detected in sensory neurons derived from the female cell line, likely caused by a skewed X-chromosomal inactivation in favor of healthy GLA. Using super-resolution imaging techniques we showed that Gb3 is localized in neuronal lysosomes of male patients and in a first experiment using dSTORM microscopy we were able to visualize the neuronal membrane in great detail. To test our disease model, we treated the neurons with enzyme replacement therapy (ERT) and analyzed its effect on the cellular Gb3 load, which was reduced in the male FD-lines, compared to non-treated cells. We also identified time-dependent differences of Gb3 accumulations, of which some seemed to be resistant to ERT. We also used confocal Ca2+ imaging to investigate spontaneous neuronal network activity, but analysis of the dataset proofed to be difficult, nonetheless showing a high potential for further investigations. We revealed that neurons from a patient with pain pain are more easily excitable, compared to cells from a patient without pain and a healthy control. We provide evidence for the potential of patient-specific iPSC to generate a neuronal in vitro disease model, showing the typical molecular FD phenotype, responding to treatment, and pointing towards underlying electrophysiological mechanisms causing different pain phenotypes. Our sensory neurons are suitable for state-of-the-art microscopy techniques, opening new possibilities for an in-depth analysis of cellular changes, caused by pathological Gb3 accumulations. Taken together, our system can easily be used to investigate the effect of the different mutations of GLA on a functional and a molecular level in affected neurons. / Morbus Fabry (M. Fabry) ist eine X-chromosomal vererbte lysosomale Speichererkrankung, die durch die Defizienz von α-Galaktosidase A (GLA) verursacht wird. Diese führt zu pathologischen Ablagerungen von Globotriaosylceramid (Gb3) in Zellen. Akraler, brennender Schmerz, der durch Hitze, Fieber oder Sport ausgelöst werden kann, ist ein frühes Krankheitsmerkmal und reduziert die Lebensqualität der Patienten deutlich. Die Pathophysiologie von M. Fabry ist unklar und die Forschung ist durch die limitierte Verfügbarkeit von humanem Biomaterial nur eingeschränkt möglich. Um dieses Problem zu bewältigen haben wir induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) von einer weiblichen Patientin und zwei männlichen Patienten mit unterschiedlichen Schmerzphänotypen generiert. Mit diesen Zellen konnten wir ein verbessertes Protokoll zur Herstellung sensibler Neurone etablieren um diese als in vitro Krankheitsmodell zu nutzen. Die Neurone wurden mittels Immunozytochemie, Genexpressionsanalyse und elektrophysiologischer Messungen auf die korrekte Zellidentität und deren Funktionalität getestet. Gb3 Ablagerungen konnten als Krankheitsmerkmal in iPSC und sensiblen Neuronen der männlichen Patienten, nicht aber in Zellen der weiblichen Patientin und der Kontrollperson nachgewiesen werden. Das Fehlen von pathologischen Ablagerungen in Zellen der weiblichen Betroffenen ist vermutlich auf eine verschobene X-Inaktivierung zu Gunsten des gesunden GLA zurückzuführen. Nichtsdestotrotz ist es uns durch die Nutzung hochauflösender Mikroskopietechniken gelungen, bei männlichen Patienten Gb3 in neuronalen Lysosomen nachzuweisen und die Membran in großem Detail abzubilden. Die Behandlung der Neurone mit der Enzymersatztherapie (ERT) als Nachweis für die Funktionalität des Krankheitsmodells führte zu einer Reduktion der Gb3 Ablagerungen bei männlichen Zellen, im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Zudem konnten wir unterschiedliche Arten von Gb3 Akkumulationen identifizieren, von denen einige scheinbar behandlungsresistent sind. Erste Versuche mit Ca2+ Imaging zeigten spontane, neuronale Netzwerkaktivität, die noch weitergehend analysiert werden müssen. Mittels Patch-Clamp Analysen konnten wir zeigen, dass Neurone des Patienten mit Schmerzen leichter erregbar sind als Zellen des Patienten ohne Schmerzen, was einen Hinweis auf die mögliche Beteiligung gestörter Ionenkanäle gibt. Wir konnten zeigen, dass patientenspezifische iPSC geeignet sind um ein neuronales in vitro Krankheitsmodell zu erstellen. Dieses Modell zeigt den typischen molekularen Phänotypen des M. Fabry, spricht auf ERT an und liefert erste Hinweise auf pathologische elektrophysiologische Krankheitsursachen, die zu unterschiedlichen Schmerzphänotypen führen können. Zelluläre Veränderungen durch Gb3 Ablagerungen können nun mittels neuester Mikroskopietechniken anhand der von uns generierten Neurone untersucht werden um ein besseres Verständnis der zugrundeliegenden Pathophysiologie zu bekommen. Zusammenfassend bietet unser System eine neue Möglichkeit den neuronalen Einfluss verschiedener GLA Mutationen auf einer funktionellen und molekularen Ebene zu untersuchen und die Diversität von M. Fabry aufzuschlüsseln.

Die alveoläre Echinokokkose (AE) ist eine lebensbedrohliche Erkrankung des Menschen, welche durch das infiltrative Wachstum des Metazestoden-Larvenstadiums des Fuchsbandwurms (Echinococcus multilocularis) in der Leber verursacht wird. Das tumorartige Wachstum des Metazestoden beruht auf einer Echinococcus-spezifischen Modifikation der anterior-posterioren-Körperachse (AP Achse). Es wird vermutet, dass dabei der anteriore Pol der invadierenden Oncospären-Larve zunächst abgeschaltet wird und sich der Metazestode anschließend asexuell als vesikuläres, posteriorisiertes Gewebes im Wirt vermehrt. Nach massiver Proliferation wird der anteriore Pol reetabliert und führt zur Bildung zahlreicher Bandwurm-Kopfanlagen (Protoskolizes). Da die Ausbildung der AP Körperachse evolutionsgeschichtlich konserviert über den wingless-related (Wnt)-Signalweg gesteuert wird, wurde in dieser Arbeit die Rolle von Wnt-Signaling bei der Musterbildung von E. multilocularis über molekular- und zellbiologische Studien näher beleuchtet. Zentraler methodischer Ansatz der vorliegenden Arbeit war ein E. multilocularis Stammzell-Kultursystem, das Primärzellsystem, welches die in vitro-Generierung von Metazestoden-Vesikeln durch Proliferation und Differenzierung von germinativen Zellen (Stammzellen) erlaubt. Über RNA-Sequenzierung wurde zunächst gezeigt, dass in Primärzellkulturen sowohl Markergene für posteriore Entwicklung in Richtung Metazestode wie auch für Anterior-und Protoskolexmarker exprimiert werden. Unter Verwendung von RNA-Interferenz (RNAi) wurde anschließend ein erfolgreicher Knockdown des vermuteten Hauptregulators des kanonischen Wnt-Signalwegs, β Catenin (em-bcat1), erreicht und führte zu einem charakteristischen, sogenannten ‚red dot‘ Phänotyp, dem ersten jemals beschriebenen RNAi Phänotyp für E. multilocularis-Primärzellen. Primärzellkulturen nach em-bcat1 RNAi zeigten eine stark verminderte Fähigkeit, Metazestoden-Vesikel zu bilden sowie eine Überproliferation von germinativen Zellen. Zusätzliche RNA-Seq-Analysen des Transkriptoms von RNAi(em-bcat1)-Kulturen zeigten eine signifikant verringerte Expression von Posterior- und Metazestodenmarkern, während Anterior- und Protoskolexmarker deutlich überexprimiert wurden. Durch umfangreiche Whole-mount-in-situ-Hybridisierung (WMISH)-Experimente wurden diese Daten für eine Reihe ausgewählter Markergene für posteriore (Metazestode; em-wnt1, em-wnt11b, em-muc1) und für anteriore Entwicklung (Protoskolex; em sfrp, em-nou-darake, em npp36, em-frizzled10) verifiziert. In allen genannten Fällen zeigte sich durch Änderung der Polarität eine verminderte Genexpression von Posteriormarkern, während Anteriormarker deutlich erhöht exprimiert wurden. Ähnlich wie bei den verwandten, freilebenden Planarien, führt demnach ein Knockdown des zentralen Wnt-Regulators β-Catenin bei E. multilocularis zu einer anteriorisierten, Anterior- und Protoskolexmarker dominierte Genexpression, welche der posteriorisierten Entwicklung zum Metazestoden entgegenwirkt. Neben Markergenen für die Ausbildung der AP-Achse wurden in dieser Arbeit auch solche für die medio-laterale (ML)-Körperachse bei Zestoden erstmals beschrieben. So zeigte sich, dass ein Slit-Ortholog (em slit) im E. multilocularis Protoskolex im Bereich der Körper-Mittellinie exprimiert wird und lieferte Hinweise darauf, dass, ähnlich zur Situation bei Planarien, die ML Achse von E. multilocularis durch Morphogengradienten aus slit (Mittellinie) und wnt5 (lateral) definiert wird. Im Metazestoden wird hingegen nur em-slit exprimiert. Der Metazestode besitzt damit als posterior-medianisiertes Gewebe Anlagen zur Polarität zur AP- und ML-Achse, welche erst mit Bildung von Protoskolizes vollständig etabliert werden. Schließlich deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass bei der Wiederherstellung der Körperachsen während der Entwicklung von Protoskolizes Hedgehog (Hh)-Signale entscheidend mitwirken. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit der zentrale Faktor des kanonischen Wnt Signalwegs, β-Catenin, als Hauptregulator der Entwicklung des tumorartig wachsenden E. multilocularis-Metazestoden identifiziert. Zudem wurde gezeigt, dass zur Metazestodenbildung neben einer Echinococcus-spezifischen Modifikation der AP Körperachse auch eine solche der ML Achse beiträgt. In humanen malignen Tumoren sind der Wnt-, Slit-Robo- und Hh-Signalweg gut erforschte Wirkstofftargets und könnten in Zukunft in ähnlicher Weise für eine zielgerichtete Therapie von AE dienen. / Alveolar echinococcosis (AE) is a life-threatening human disease caused by the infiltrative growth of the metacestode larval stage of the fox tapeworm (Echinococcus multilocularis) within the host liver. According to previous research, the tumor-like growth of the metacestode is due to an Echinococcus-specific modification of the anterior-posterior (AP)-body axis formation. It is thus assumed that the invading oncosphere larva transiently represses the anterior pole, giving rise to metacestode vesicles which proliferate within the host as posteriorized tissue. Upon massive proliferation, the anterior pole is re-established at numerous sites within the metacestode tissue, yielding large numbers of tapeworm heads (protoscoleces). Since the formation of the AP-body axis is evolutionarily conserved and regulated by canonical wingless-related (Wnt) signaling, the present work investigated in detail the role of the Wnt-pathway in Echinococcus metacestode formation via molecular and cell biological studies. Methodologically, this work focussed on an Echinococcus stem cell cultivation system, called the primary cell system, which allows the in-vitro generation of mature metacestode vesicles through proliferation and differentiation of germinative cells (stem cells). By genome-wide RNA-Seq transcriptomics it is shown that primary cell cultures express marker genes for both posterior development towards the metacestode as well as anterior development of head organizers. By RNA interference (RNAi), successful knockdown of the presumed central regulator of canonical Wnt-signaling, β-catenin (em-bcat1), was achieved, yielding a striking phenotype ('red dot'), the first RNAi phenotype described for E. multilocularis primary cells. Primary cell cultures after em-bcat1 RNAi showed a greatly reduced ability to form metacestode vesicles as well as an overproliferation of germinative cells. Additional RNA-Seq analysis of the transcriptome of RNAi(em-bcat1) cultures indicated significantly decreased expression of posterior and metacestode markers whereas anterior and protoscolex markers were markedly overexpressed. These data were verified using whole-mount-in-situ-hybridization (WMISH) for several selected marker genes for posterior (metazestode; em-wnt1, em-wnt11b, em-muc1) and for anterior development (protoscolex; em-sfrp, em-nou-darake, em npp36, em frizzled10). In all cases, a change in polarity showed decreased gene expression of posterior markers whereas anterior markers were significantly increased in expression. Similar to the situation in related planarians, knockdown of β Catenin in E. multilocularis lead in anteriorized, anterior- and protoscolex marker-dominated gene expression and antagonized the formation of the posteriorized metacestode. In addition to marker genes for AP-axis formation, this work also established marker genes for the medio-lateral (ML)-body axis in cestodes for the first time. In particular, a slit orthologue (em slit) was shown to be expressed in the E. multilocularis protoscolex at the body midline and provided evidence that, similar to the situation in planarians, the ML-axis of E. multilocularis is defined by morphogen gradients consisting of slit (midline) and wnt5 (lateral). In contrast, only em-slit is expressed in the metacestode. Thus, the metacestode tissue is indeed posterior-medianized and the AP- and ML-axes are established only with formation of protoscoleces. Finally, the results of this work suggest that Hedgehog (Hh) signaling plays a critical role in the reestablishment of body axes during protoscoleces development. In conclusion, this work identified the central regulator of the canonical Wnt-signaling pathway, β-catenin, as a master regulator of E. multilocularis metacestode development. Furthermore, it is herein established that metacestode formation not only involves Echinococcus-specific modification of the AP-axis but also of the ML-axis. In human malignant tumors, the Wnt, Slit-Robo, and Hh-pathway are well-studied drug targets and may similarly serve for AE targeted therapy in the future.

Der adenovirale SOX9-Gentransfer induziert nach 3-wöchiger in vitro Pelletkultur die chondrogene Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen in Pelletkultur wirksamer als der TGFB1 Gentransfer mit geringerer Chondrozytenhypertrophie. Eine solche Technologie könnte zukünftig in vivo die Bildung von stabilerem hyalinem Knorpelregeneratgewebe ermöglichen. / Adenoviral SOX9 genetransfer in human mesenchymal stem cells can be used for chondrogenic differentiation and to generate stable hyaline cartilage regeneration in vitro in pellet culture system.