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Orientador: Maria Lucia Gonsales da Costa Araujo / Banca: Sandra Regina Pombeiro Sponchiado / Banca: Carlos Osamu Hokka / Resumo: O ácido clavulânico (AC) é um composto β-lactâmico que, apesar de não ter atividade antibiótica significativa, é um potente inibidor de β-lactamases produzidas por bactérias resistentes a antibióticos β-lactâmicos. O efeito sinérgico do AC com penicilinas e cefalosporinas resulta no bloqueio do sítio ativo de β-lactamases e, assim, protege aqueles antibióticos conferindo-lhes um maior espectro de ação. O AC é produzido industrialmente por linhagens de Streptomyces clavuligerus em meios contendo fontes de N provenientes de matérias primas vegetais de baixo custo que rendem altas concentrações de produto. Porém, estes complexos protéicos, assim como estimulam o crescimento e a produção, também podem conter componentes desconhecidos que afetam negativamente o processo. Neste contexto, a utilização de meios sintéticos contendo aminoácidos (AA) pode ser uma boa alternativa. A maioria dos AA é bem assimilada por S. clavuligerus mas apenas alguns favorecem a produção de AC. Asn e Pro, por exemplo, favorecem o crescimento celular, enquanto Orn e Arg são precursores do AC e estimulam sua síntese. Desta forma, meios contendo aminoácidos como fontes de N podem apresentar vantagens significativas, pois, além de direcionar o processo de produção de AC, resultam em caldos mais homogêneos e menos viscosos que promovem melhorias na transferência de massa e calor, nas condições de monitoramento e controle, bem como nos processos de separação, recuperação e purificação do produto. No presente trabalho, utilizou-se a metodologia de planejamento fatorial de experimentos 22, com replicatas do ponto central, para otimizar empiricamente a proporção molar entre glicerol e Orn do meio suplementar sintético de processo contínuo intermitente em frascos agitados agitados (250 rpm, 28ºC). A etapa contínua era iniciada após 48 h de batelada...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The clavulanic acid (CA) is a β - lactam compound that despite not having significant bioactivity, is a potent inhibitor of β - lactamases produced by bacteria resistant to β - lactam antibiotics. The synergistic effect of CA with penicillins and cephalosporins results in blockade of the active site of β - lactamases and protects those antibiotics by giving them a greater spectrum of action. The CA is industrially produced by strains of Streptomyces clavuligerus in media containing N source of low-cost vegetable raw materials that yield high concentrations of the product. However these complex media, as well as stimulates growth and the production, may also contain unknown components that affect negatively the process. Then the use of synthetic media containing amino acid (AA) may be a good alternative. Most of AA is well metabolized by S. clavuligerus but only some of them induce the production of CA. Asn and Pro, for example, promote cell growth, while Orn and Arg are precursors of CA and stimulate its synthesis. Thus media containing amino acids may be significantly advantageous because, in addition to provide a direction for the process, result in more homogeneous and less viscous broths that promote improvements in heat and mass transfer, monitoring and controlling of the process, as well as in the processes of separation, recovery and purification of the product. In this work, the factorial design 22 of experiments methodology was used to optimize empirically the molar ratio between glycerol and Orn of the synthetic supplementary medium of an intermittent continuous process in shaken flasks (250rpm, 28ºC). The continuous process started after 48 h of batch process in a medium containing glycerol as limiting substrate, proteic extract from soybean (Soytone) as the main source of N and salts (pH 6,8 ± 0,2). Sampling and medium supplementation were accomplished every 24 h,...(Complete abstract, click electronic access below) / Mestre

Orientador: Maria Lucia Gonsales da Costa Araújo / Resumo: O ácido clavulânico é um metabólito secundário isolado de culturas de Streptomyces clavuligerus que possui uma atividade antibacteriana fraca, mas é um potente inibidor de b-lactamases. O uso combinado desse composto com penicilinas e cefalosporinas tem se mostrado uma estratégia terapêutica eficiente na luta contra a resistência bacteriana. Esse composto b-lactâmico é produzido por fermentação simultaneamente com outros intermediários metabólicos e sua purificação envolve uma série de etapas, que incluem: adsorção, troca-iônica, extração líquido-líquido, precipitação e cristalização. O objetivo deste trabalho foi a investigação da eficiência de diferentes resinas na purificação do ácido clavulânico por adsorção e troca-iônica. No entanto, como esse composto b-lactâmico apresenta velocidades de degradação elevadas em soluções aquosas, inicialmente estabeleceu-se a faixa de pH de maior estabilidade, situada entre 4,5 e 7,5. Os estudos cinéticos de adsorção em batelada mostraram que somente a resina de troca iônica IRA400 foi eficiente na recuperação do ácido clavulânico, a partir de soluções aquosas. Assim, analisou-se a influência de parâmetros como temperatura, concentração de resina, força iônica e pH no processo de troca-iônica. A caracterização termodinâmica do processo foi possível através da determinação da entalpia de adsorção por microcalorimetria e da afinidade da resina pelo composto em questão. Esses estudos foram importantes para o estabelecimento das melhores condições de adsorção que podem ser empregadas na purificação do ácido clavulânico a partir do caldo fermentativo. / Abstract: Clavulanic acid is a secondary metabolite isolated from cultures of Streptomyces clavuligerus and presents a low antibacterial activity but is a potent inhibitor of ß-lactamases. Its use in combination with penicillins and cephalosporins has shown to be an efficient therapeutic strategy to face bacterial resistance to antibiotics. This ß-lactam compound is produced by fermentation simultaneously with other metabolic intermediates and its purification involves several steps: liquid-liquid extraction, adsorption, ion-exchange chromatography, precipitation and crystallization. In this work the performance of several resins for the purification of clavulanic acid by adsorption and ion-exchange chromatography was investigated. However, since this ß-lactam compound presents high degradation rates in aqueous solution, inicially the pH range leading to higher stability was determined. The adsorption studies, performed batchwise, has shown that only the Amberlite IRA400 ion exchange resin was effective for the recovery of the clavulanic acid in aqueous solutions. Then, the influence of temperature, resin concentration, ionic strength and pH in the ion exchange process was analyzed. Thermodynamic characterization of the process was achieved by the determination of the adsorption entalphy in a microcalorimetry and by the resin affinity the target compound. This studies were essential for the establishment of the best adsorption conditions which could be applied for the clavulanic acid purification from the fermentation broth. / Mestre

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2989.pdf: 1358671 bytes, checksum: 12fbd756cc40d3ef3c2c00e46613717e (MD5) Previous issue date: 2010-02-25 / Financiadora de Estudos e Projetos / Due to the large number of functional advantages, pneumatic bioreactors have drawn attention in the biotechnology field, being more promising than stirred and aerated tank bioreactors. Parameters such as global gas hold-up (G), volumetric oxygen transfer coefficient (kLa) and average shear rate (Ym) must be considered as performance criteria of these types of bioreactors to provide a better understanding of their hydrodynamics. However, there are no works in literature which compare the performance of bioreactors in terms of shear conditions. Therefore, the aim of the present work was to apply a method proposed in recent literature to evaluate the average shear rate (Ym) in three pneumatic bioreactors of 5-dm3 working volume: bubble column, split airlift and concentric-tube airlift. The volumetric oxygen transfer coefficient (kLa) was chosen as the appropriate characteristic parameter to assess the average shear rate (Ym) in this methodology. Correlations for as a function of superficial gas velocity in the riser region (Ugs) and rheological fluid properties (consistency index, K, and flow index, n) were obtained for each model of pneumatic bioreactor studied. Moreover, correlations between G, Ugs and viscosity (μ) (for Newtonian fluids) and apparent viscosity (μap) (for non-Newtonian fluids) were performed. In general, global gas hold-up (G) was higher for non-Newtonian fluids. The Ym values estimated by the proposed methodology lay within the range of values calculated by classical correlations. The proposed correlations were utilized to predict the Ym during three Streptomyces clavuligerus cultivations carried out at the same specific air flow rate (3.5 vvm) in the different types of pneumatic bioreactors. The lowest values of related to the highest values of Ym consistency index (K) were found for the bubble column bioreactor, and the highest values of related to the lowest values of K were found for the concentric-tube airlift bioreactor. Intermediate values were found for the split airlift bioreactor. The results showed that high Ym values affect the structural health of the mycelia by rupture of the hipha. / Biorreatores pneumáticos têm se destacado no campo da biotecnologia devido suas muitas vantagens funcionais, mostrando-se mais promissores do que o modelo convencional tipo tanque agitado e aerado. Parâmetros como retenção gasosa global (G), coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa) e velocidade de cisalhamento média (Уm ) devem ser analisados como critérios de desempenho desses modelos de biorreatores, para o melhor entendimento da hidrodinâmica dos mesmos. Entretanto, não existem estudos na literatura que comparem biorreatores pneumáticos em termos de condições de cisalhamento. Dessa forma, o objetivo principal deste estudo foi aplicar uma metodologia recente para quantificar e comparar a velocidade de cisalhamento média (Уm ) em três biorreatores pneumáticos: coluna de bolhas, airlift tipo split-cylinder e airlift de cilindros concêntricos. O coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa) foi escolhido como parâmetro característico para determinar . Correlações de em função da velocidade superficial do gás na região de subida (Ugs) e das propriedades reológicas do fluido (índice de consistência, K, e índice de comportamento de escoamento, n) foram obtidas para cada modelo de biorreator pneumático estudado. Além disso, foram obtidas correlações entre G, Ugs e viscosidade (μ) para fluidos Newtonianos e viscosidade aparente (μap) para fluidos não-Newtonianos. De forma geral, a retenção gasosa global (G) foi maior em fluidos não-Newtonianos. Os valores Уm de estimados pela metodologia proposta estão dentro de uma faixa média de valores calculados por correlações clássicas. As correlações propostas foram utilizadas para predizer Уm durante cultivos de Streptomyces clavuligerus realizadas sob a mesma vazão específica de ar (3,5 vvm) nos três diferentes tipos de biorreatores pneumáticos. Os menores valores Уm de , relacionados aos maiores valores de índice de consistência (K), foram encontrados para o biorreator coluna de bolhas, e o maiores valores de Уm, relacionados aos menores valores de K, foram encontrados para o biorreator airlift de cilindros concêntricos. Valores intermediários foram encontrados para o biorreator airlift tipo split-cylinder . Os resultados mostraram que altos valores de Уm afetam a saúde estrutural dos micélios, devido à ruptura das hifas vegetativas.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-11-26Bitstream added on 2014-06-13T20:10:36Z : No. of bitstreams: 1 domingues_lcg_me_araiq.pdf: 462848 bytes, checksum: ffbbb623452b0cbc8d35581e18111652 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O ácido clavulânico (AC) é um composto β-lactâmico que, apesar de não ter atividade antibiótica significativa, é um potente inibidor de β-lactamases produzidas por bactérias resistentes a antibióticos β-lactâmicos. O efeito sinérgico do AC com penicilinas e cefalosporinas resulta no bloqueio do sítio ativo de β-lactamases e, assim, protege aqueles antibióticos conferindo-lhes um maior espectro de ação. O AC é produzido industrialmente por linhagens de Streptomyces clavuligerus em meios contendo fontes de N provenientes de matérias primas vegetais de baixo custo que rendem altas concentrações de produto. Porém, estes complexos protéicos, assim como estimulam o crescimento e a produção, também podem conter componentes desconhecidos que afetam negativamente o processo. Neste contexto, a utilização de meios sintéticos contendo aminoácidos (AA) pode ser uma boa alternativa. A maioria dos AA é bem assimilada por S. clavuligerus mas apenas alguns favorecem a produção de AC. Asn e Pro, por exemplo, favorecem o crescimento celular, enquanto Orn e Arg são precursores do AC e estimulam sua síntese. Desta forma, meios contendo aminoácidos como fontes de N podem apresentar vantagens significativas, pois, além de direcionar o processo de produção de AC, resultam em caldos mais homogêneos e menos viscosos que promovem melhorias na transferência de massa e calor, nas condições de monitoramento e controle, bem como nos processos de separação, recuperação e purificação do produto. No presente trabalho, utilizou-se a metodologia de planejamento fatorial de experimentos 22, com replicatas do ponto central, para otimizar empiricamente a proporção molar entre glicerol e Orn do meio suplementar sintético de processo contínuo intermitente em frascos agitados agitados (250 rpm, 28ºC). A etapa contínua era iniciada após 48 h de batelada... / The clavulanic acid (CA) is a β – lactam compound that despite not having significant bioactivity, is a potent inhibitor of β – lactamases produced by bacteria resistant to β – lactam antibiotics. The synergistic effect of CA with penicillins and cephalosporins results in blockade of the active site of β – lactamases and protects those antibiotics by giving them a greater spectrum of action. The CA is industrially produced by strains of Streptomyces clavuligerus in media containing N source of low–cost vegetable raw materials that yield high concentrations of the product. However these complex media, as well as stimulates growth and the production, may also contain unknown components that affect negatively the process. Then the use of synthetic media containing amino acid (AA) may be a good alternative. Most of AA is well metabolized by S. clavuligerus but only some of them induce the production of CA. Asn and Pro, for example, promote cell growth, while Orn and Arg are precursors of CA and stimulate its synthesis. Thus media containing amino acids may be significantly advantageous because, in addition to provide a direction for the process, result in more homogeneous and less viscous broths that promote improvements in heat and mass transfer, monitoring and controlling of the process, as well as in the processes of separation, recovery and purification of the product. In this work, the factorial design 22 of experiments methodology was used to optimize empirically the molar ratio between glycerol and Orn of the synthetic supplementary medium of an intermittent continuous process in shaken flasks (250rpm, 28ºC). The continuous process started after 48 h of batch process in a medium containing glycerol as limiting substrate, proteic extract from soybean (Soytone) as the main source of N and salts (pH 6,8 ± 0,2). Sampling and medium supplementation were accomplished every 24 h,...(Complete abstract, click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2001Bitstream added on 2014-06-13T18:09:16Z : No. of bitstreams: 1 bersanetti_pa_me_araiq.pdf: 408293 bytes, checksum: bd4796bb7b8735c621e3ef612dc5b87d (MD5) / O ácido clavulânico é um metabólito secundário isolado de culturas de Streptomyces clavuligerus que possui uma atividade antibacteriana fraca, mas é um potente inibidor de b-lactamases. O uso combinado desse composto com penicilinas e cefalosporinas tem se mostrado uma estratégia terapêutica eficiente na luta contra a resistência bacteriana. Esse composto b-lactâmico é produzido por fermentação simultaneamente com outros intermediários metabólicos e sua purificação envolve uma série de etapas, que incluem: adsorção, troca-iônica, extração líquido-líquido, precipitação e cristalização. O objetivo deste trabalho foi a investigação da eficiência de diferentes resinas na purificação do ácido clavulânico por adsorção e troca-iônica. No entanto, como esse composto b-lactâmico apresenta velocidades de degradação elevadas em soluções aquosas, inicialmente estabeleceu-se a faixa de pH de maior estabilidade, situada entre 4,5 e 7,5. Os estudos cinéticos de adsorção em batelada mostraram que somente a resina de troca iônica IRA400 foi eficiente na recuperação do ácido clavulânico, a partir de soluções aquosas. Assim, analisou-se a influência de parâmetros como temperatura, concentração de resina, força iônica e pH no processo de troca-iônica. A caracterização termodinâmica do processo foi possível através da determinação da entalpia de adsorção por microcalorimetria e da afinidade da resina pelo composto em questão. Esses estudos foram importantes para o estabelecimento das melhores condições de adsorção que podem ser empregadas na purificação do ácido clavulânico a partir do caldo fermentativo. / Clavulanic acid is a secondary metabolite isolated from cultures of Streptomyces clavuligerus and presents a low antibacterial activity but is a potent inhibitor of ß-lactamases. Its use in combination with penicillins and cephalosporins has shown to be an efficient therapeutic strategy to face bacterial resistance to antibiotics. This ß-lactam compound is produced by fermentation simultaneously with other metabolic intermediates and its purification involves several steps: liquid-liquid extraction, adsorption, ion-exchange chromatography, precipitation and crystallization. In this work the performance of several resins for the purification of clavulanic acid by adsorption and ion-exchange chromatography was investigated. However, since this ß-lactam compound presents high degradation rates in aqueous solution, inicially the pH range leading to higher stability was determined. The adsorption studies, performed batchwise, has shown that only the Amberlite IRA400 ion exchange resin was effective for the recovery of the clavulanic acid in aqueous solutions. Then, the influence of temperature, resin concentration, ionic strength and pH in the ion exchange process was analyzed. Thermodynamic characterization of the process was achieved by the determination of the adsorption entalphy in a microcalorimetry and by the resin affinity the target compound. This studies were essential for the establishment of the best adsorption conditions which could be applied for the clavulanic acid purification from the fermentation broth.

Orientador: Maria Lucia Gonsales da Costa Araujo / Banca: Oswaldo Garcia Junior / Banca: Alberto Colli Baldino Junior / Resumo: Os grupos de antibióticos mais importantes clinicamente são os dos b-lactâmicos, aminoglicosídeos e tetraciclinas. Streptomyces clavuligerus produz vários compostos b- lactâmicos, com destaque para os antibióticos envolvidos na rota biossintética da cefalosporina C (penicilina N, deacetoxicefalosporina C e cefamicina C) e o ácido clavulânico (AC) que, embora não tenha atividade biológica significativa, é um potente inibidor de b-lactamases (penicilinases e cefalosporinases). A cefamicina C (CefC) é uma 7-metoxi-cefalosporina que apresenta maior atividade que a cefalosporina C (CPC), produzida somente por fungos, por ser resistente a b-lactamases. Apesar das rotas biossintéticas de AC e CefC serem completamente independentes em S. clavuligerus, são controladas pelo mesmo elemento multifuncional (ccaR), o que dificulta a indução da produção de um ou outro composto durante o processo fermentativo. No presente trabalho, procurou-se obter maiores concentrações de CefC manipulando-se componentes em meio solúvel de cultivo de S. clavuligerus, selecionados dentre compostos que, segundo a literatura, atuam como agentes reguladores da síntese daquele antibiótico. As fermentações foram realizadas em frascos agitados (28ºC, 260 rpm) para selecionar fontes de C e de N e, então, avaliar o processo no melhor meio-padrão, variando-se concentrações combinadas de L-lisina (10 a 108 mM) e -cetoglutarato (3 a 110 mM) através de metodologia de planejamento experimental. A presença de -cetoglutarato acarretou em aumento indesejável de pH, afetando negativamente o processo e os melhores resultados (entre 300 e 400 mg CPC totais/L após 72 horas de fermentação) foram obtidos no meio adotado como meio-controle, contendo amido e extrato protéico de semente de algodão como principais fontes de C e N, respectivamente, e L-lisina. / Abstract: The most important groups of antibiotics, from a clinical standpoint, are -lactams, aminoglycosides and tetracyclines. Streptomyces clavuligerus produces several -lactam compounds, primarily the antibiotics involved in the biosynthetic route of cephalosporin C (penicillin N, deacetoxycephalosporin C and cephamycin C) and clavulanic acid (CA), which, despite its slight biological activity, is a potent inhibitor of -lactamases (penicillinases and cephalosporinases). Cephamycin C (CMC) is a 7-methoxycephalosporin with higher bioactivity than cephalosporin C (CPC) because it is more resistant to -lactamases. Although the biosynthetic routes of CA and CMC are completely independent in S. clavuligerus, they are controlled by a common multi-functional element (ccaR), which hinders induction of the production of one or the other compound during the fermentation process. In this work, we sought to obtain higher concentrations of CMC by handling compounds in a soluble medium of S. clavuligerus, which were selected from compounds that, according to the literature, act as regulating agents in the synthesis of that antibiotic. Fermentation was carried out in flasks under shaking (28ºC, 260 rpm), in order to select sources of C and N. The process was then evaluated in the best standard medium, by varying combined concentrations of lysine (10 to 108 mM) and -ketoglutarate (3 to 110 mM) using an experimental planning methodology. The presence of -ketoglutarate caused an undesirable increase in pH, negatively affecting the process. The best results (between 300 and 400 mg/L of total CPC after 72 h of fermentation) were obtained in the medium used as the control, which contained starch and cottonseed protein extract as main sources, respectively, of C and N, and L-lysine. / Mestre

Ácido clavulânico (AC) é um potente inibidor de β-lactamases, produzido por Streptomyces clavuligerus, usado clinicamente em combinação com antibióticos β-lactâmicos para tratar infecções bacterianas resistentes. Apesar da produção industrial de AC já ser bem estabelecida muitos aspectos importantes relacionados com sua biossíntese permanecem carentes de estudo. Sabe-se que a via de síntese do AC envolve no mínimo 8 passos enzimáticos sendo os primeiros passos mais abordados. Por exemplo, as enzimas N2-(2-carboxietil) arginina sintase (CEAS), β-lactama sintase (BLS) e proclavaminato amidino hidrolase (PAH) são as responsáveis pela primeira, segunda e quarta reações enzimáticas respectivamente. Estudos mutagênicos recentes em S.clavuligerus relacionaram cópias extras dos genes ceas, bls e pah (ceas1, bls1 e pah1) com essa via porém nenhum ensaio enzimático foi relatado. Embora os passos finais da via ainda não estejam completamente estabelecidos, a ação de algumas enzimas putativas, como a codificada por orf12, mostraram ser essenciais a produção do AC. Assim, com o objetivo de aumentar a informação disponível sobre a biossíntese do AC estudamos quatro de seus membros: CEAS1, BLS1, PAH1 e a proteína putativa codificada pela orf12. Os genes foram isolados a partir do DNA genômico de S. clavuligerus por PCR e clonados em vetores para produção das proteínas recombinantes em E.coli. Os protocolos de expressão foram estabelecidos para CEAS1, PAH1 e ORF12 e as proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade por metal. BLS foi obtida de forma isolúvel. As proteínas solúveis foram caracterizadas por meio de técnicas bioquímicas e estruturais. As análises de CEAS1 e PAH1 foram comparadas com informações já obtidas para as isozimas CEAS2 e PAH2, respectivamente. Assim, as análises de oligomerização das proteínas resultaram em uma mistura de oligômeros (monômero, dímero e tetrâmero) para CEAS1, na forma hexamérica para PAH1 e na forma dimérica para ORF12, estando de acordo com as formas solúvel e cristalográfica de CEAS2 (dímero e tetrâmero) e PAH2 (hexâmero). Espectros de dicroísmo circular mostraram que CEAS1 e PAH1 possuem um enovelamento do tipo α/β sendo estáveis até 35ºC e numa ampla faixa de pH. Os parâmetros termodinâmicos da interação entre CEAS1 e o cofator Mg+2 foram determinados mostrando que é entropicamente dirigida, com uma estequiometria de ligação de 4 : 1, com uma constante de afinidade na ordem de micromolar (KD = 1,76 ± 0.23 µM). Análises realizadas com as técnicas de reação acoplada, de Cromatografia Líquida de Alta Pressão acoplada a Espectrometria de Massas (LC-MS) e de Calorimetria de Titulação Isotérmica mostraram que CEAS1, assim como CEAS2, apresenta atividade sob o substrato gliceraldeído-3-fosfato, porém sem a formação do produto final N2-(2-carboxietil)arginina. Por outro lado, a proteína recombinante PAH1 mostrou ser inativa sobre o substrato análogo, N-α-acetil-L-arginina. Assim, apesar das isozimas manterem um padrão estrutural, podem ter mecanismos de ação distintos. Em relação a ORF12 esta proteína foi classificada com uma β-lactamase com atividade esterase de acordo com nossos estudos realizados com os substratos cefalosporina C e p-nitrofenil acetato. / Clavulanic acid (CA) is a potent inhibitor of β-lactamases, produced by Streptomyces clavuligerus, clinically used in combination with β-lactam antibiotics to treat resistant bacterial infections. Although CA industrial production is well-established, many important aspects related to its biosynthesis remains under study. It is known that CA pathway involves at least 8 enzymatic steps, being the earliest stages more addressed. For instance, N2-(2-carboxyethyl) arginine synthase (CEAS), β-lactam synthase (BLS) and proclavaminate amidinohydrolase (PAH) are responsible for the first, second and fourth enzymatic reaction, respectively. Recent mutagenic studies in S.clavuligerus have related extra copies of ceas, bls and pah genes ((ceas1, bls1 e pah1) to this pathway but none enzymatic assay was further reported. Although later stages the pathway remain unclear, the action of some putative enzymes like the codified by orf12 showed essential to CA production. Thus, aiming to increase the information available about CA biosynthesis we studied four of its members: CEAS1, BLS1, PAH1, and the putative protein codified by orf12. The genes were isolated from S.clavuligerus genomic DNA by PCR and further cloned into expression vectors in order to produce recombinant proteins in E.coli. Protocols of protein expression were established to CEAS1, PAH1 and ORF12 and recombinant proteins were purified by metal affinity chromatography. BLS was obtained as an insoluble form. Soluble proteins were characterized by means of biochemical and structural approaches. Analyses of CEAS1 and PAH1 were compared with information ever conducted to the isozymes CEAS2 and PAH2, respectively. Thus, oligomerization analysis of proteins resulted respectively in a mix of oligomers forms (monomer, dimer, tetramer) to CEAS1, hexameric form to PAH1 and dimeric form to ORF12, according to the soluble and crystallographic form of CEAS2 (dimer and tetramer) and PAH2 (hexamer). Circular Dichroism spectra showed that CEAS1 and PAH1 have an α-β conformation and were stable up to 35ºC over a wide pH range. Thermodynamic parameters of CEAS1 cofactor (Mg+2) binding were determined showing that is entropic driven, with a 4:1 binding stoichiometry, with a micro-molar affinity (KD = 1.76 ± 0.23 µM). Analyses by coupled assay, High Pressure Liquid Chromatography coupled to Mass Spectroscopy (LC-MS) and Isothermal Titration Calorimetry showed that CEAS1, as well as the CEAS2, presents activity at the substrate glyceraldehydes-3-phosphate, however without formation of final product, N2-(2-carboxyethyl)arginine. Meanwhile recombinant PAH1 showed none activity at analogous substrate, N-α-acetil-L-arginine. Thus despite isozymes maintain a structural pattern, they may have distinct action mechanism. Regards to ORF12, this protein was classified as a β-lactamase with an esterase activity according to our studies performed with the substrates cephalosporin C and p-nitrophenyl acetate.

Ácido clavulânico (AC) é um potente inibidor de β-lactamases, produzido por Streptomyces clavuligerus, usado clinicamente em combinação com antibióticos β-lactâmicos para tratar infecções bacterianas resistentes. Apesar da produção industrial de AC já ser bem estabelecida muitos aspectos importantes relacionados com sua biossíntese permanecem carentes de estudo. Sabe-se que a via de síntese do AC envolve no mínimo 8 passos enzimáticos sendo os primeiros passos mais abordados. Por exemplo, as enzimas N2-(2-carboxietil) arginina sintase (CEAS), β-lactama sintase (BLS) e proclavaminato amidino hidrolase (PAH) são as responsáveis pela primeira, segunda e quarta reações enzimáticas respectivamente. Estudos mutagênicos recentes em S.clavuligerus relacionaram cópias extras dos genes ceas, bls e pah (ceas1, bls1 e pah1) com essa via porém nenhum ensaio enzimático foi relatado. Embora os passos finais da via ainda não estejam completamente estabelecidos, a ação de algumas enzimas putativas, como a codificada por orf12, mostraram ser essenciais a produção do AC. Assim, com o objetivo de aumentar a informação disponível sobre a biossíntese do AC estudamos quatro de seus membros: CEAS1, BLS1, PAH1 e a proteína putativa codificada pela orf12. Os genes foram isolados a partir do DNA genômico de S. clavuligerus por PCR e clonados em vetores para produção das proteínas recombinantes em E.coli. Os protocolos de expressão foram estabelecidos para CEAS1, PAH1 e ORF12 e as proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade por metal. BLS foi obtida de forma isolúvel. As proteínas solúveis foram caracterizadas por meio de técnicas bioquímicas e estruturais. As análises de CEAS1 e PAH1 foram comparadas com informações já obtidas para as isozimas CEAS2 e PAH2, respectivamente. Assim, as análises de oligomerização das proteínas resultaram em uma mistura de oligômeros (monômero, dímero e tetrâmero) para CEAS1, na forma hexamérica para PAH1 e na forma dimérica para ORF12, estando de acordo com as formas solúvel e cristalográfica de CEAS2 (dímero e tetrâmero) e PAH2 (hexâmero). Espectros de dicroísmo circular mostraram que CEAS1 e PAH1 possuem um enovelamento do tipo α/β sendo estáveis até 35ºC e numa ampla faixa de pH. Os parâmetros termodinâmicos da interação entre CEAS1 e o cofator Mg+2 foram determinados mostrando que é entropicamente dirigida, com uma estequiometria de ligação de 4 : 1, com uma constante de afinidade na ordem de micromolar (KD = 1,76 ± 0.23 µM). Análises realizadas com as técnicas de reação acoplada, de Cromatografia Líquida de Alta Pressão acoplada a Espectrometria de Massas (LC-MS) e de Calorimetria de Titulação Isotérmica mostraram que CEAS1, assim como CEAS2, apresenta atividade sob o substrato gliceraldeído-3-fosfato, porém sem a formação do produto final N2-(2-carboxietil)arginina. Por outro lado, a proteína recombinante PAH1 mostrou ser inativa sobre o substrato análogo, N-α-acetil-L-arginina. Assim, apesar das isozimas manterem um padrão estrutural, podem ter mecanismos de ação distintos. Em relação a ORF12 esta proteína foi classificada com uma β-lactamase com atividade esterase de acordo com nossos estudos realizados com os substratos cefalosporina C e p-nitrofenil acetato. / Clavulanic acid (CA) is a potent inhibitor of β-lactamases, produced by Streptomyces clavuligerus, clinically used in combination with β-lactam antibiotics to treat resistant bacterial infections. Although CA industrial production is well-established, many important aspects related to its biosynthesis remains under study. It is known that CA pathway involves at least 8 enzymatic steps, being the earliest stages more addressed. For instance, N2-(2-carboxyethyl) arginine synthase (CEAS), β-lactam synthase (BLS) and proclavaminate amidinohydrolase (PAH) are responsible for the first, second and fourth enzymatic reaction, respectively. Recent mutagenic studies in S.clavuligerus have related extra copies of ceas, bls and pah genes ((ceas1, bls1 e pah1) to this pathway but none enzymatic assay was further reported. Although later stages the pathway remain unclear, the action of some putative enzymes like the codified by orf12 showed essential to CA production. Thus, aiming to increase the information available about CA biosynthesis we studied four of its members: CEAS1, BLS1, PAH1, and the putative protein codified by orf12. The genes were isolated from S.clavuligerus genomic DNA by PCR and further cloned into expression vectors in order to produce recombinant proteins in E.coli. Protocols of protein expression were established to CEAS1, PAH1 and ORF12 and recombinant proteins were purified by metal affinity chromatography. BLS was obtained as an insoluble form. Soluble proteins were characterized by means of biochemical and structural approaches. Analyses of CEAS1 and PAH1 were compared with information ever conducted to the isozymes CEAS2 and PAH2, respectively. Thus, oligomerization analysis of proteins resulted respectively in a mix of oligomers forms (monomer, dimer, tetramer) to CEAS1, hexameric form to PAH1 and dimeric form to ORF12, according to the soluble and crystallographic form of CEAS2 (dimer and tetramer) and PAH2 (hexamer). Circular Dichroism spectra showed that CEAS1 and PAH1 have an α-β conformation and were stable up to 35ºC over a wide pH range. Thermodynamic parameters of CEAS1 cofactor (Mg+2) binding were determined showing that is entropic driven, with a 4:1 binding stoichiometry, with a micro-molar affinity (KD = 1.76 ± 0.23 µM). Analyses by coupled assay, High Pressure Liquid Chromatography coupled to Mass Spectroscopy (LC-MS) and Isothermal Titration Calorimetry showed that CEAS1, as well as the CEAS2, presents activity at the substrate glyceraldehydes-3-phosphate, however without formation of final product, N2-(2-carboxyethyl)arginine. Meanwhile recombinant PAH1 showed none activity at analogous substrate, N-α-acetil-L-arginine. Thus despite isozymes maintain a structural pattern, they may have distinct action mechanism. Regards to ORF12, this protein was classified as a β-lactamase with an esterase activity according to our studies performed with the substrates cephalosporin C and p-nitrophenyl acetate.

Streptomyces clavuligerus is well-known for synthesizing several &beta / -lactam antibiotics like cephamycin C which is produced through aspartic acid pathway initiated by aspartokinase (Ask) enzyme encoded by ask. Four different strains were constructed in our laboratory to increase cephamycin C production by S. clavuligerus. TB3585 and BA39 contained extra copies of ask gene on a multicopy plasmid, control strains TBV and BAV contained vector only in wild type strain NRRL3585 and hom-minus background, AK39, respectively. In this study, the effects of carbon and nitrogen sources incorporated into chemically defined medium were investigated for optimum growth and cephamycin C production by AK39. A modified-chemically defined medium (mCDM) was obtained by increasing the asparagine concentration two-fold and replacing glycerol with sucrose. Subsequently, growth and cephamycin C production by recombinant S. clavuligerus strains (TB3585, AK39, BA39, BAV, TBV) in Tryptic Soy Broth (TSB) and mCDM were compared. The specific antibiotic production in mCDM by TB3585 was 3.3- and 3.2-fold higher than TBV at 72h and 96h, respectively. Aspartokinase activity of S. clavuligerus recombinants was measured to verify the ask overexpression. TB3585 showed the highest activity at 48h. Finally, intracellular amino acid pools of the strains were measured to relate the Ask activity and antibiotic production to the amino acid content within the cells. AK39 was shown to have the highest intracellular levels of lysine, leading to cephamycin C precursor synthesis / lysine plus threonine, exerting concerted feedback inhibition on Ask enzyme / methionine, which cannot be produced by AK39 like threonine due to hom disruption.