Orientador: Maria Lucia Gonsales da Costa Araujo / Banca: Sandra Regina Pombeiro Sponchiado / Banca: Carlos Osamu Hokka / Resumo: O ácido clavulânico (AC) é um composto β-lactâmico que, apesar de não ter atividade antibiótica significativa, é um potente inibidor de β-lactamases produzidas por bactérias resistentes a antibióticos β-lactâmicos. O efeito sinérgico do AC com penicilinas e cefalosporinas resulta no bloqueio do sítio ativo de β-lactamases e, assim, protege aqueles antibióticos conferindo-lhes um maior espectro de ação. O AC é produzido industrialmente por linhagens de Streptomyces clavuligerus em meios contendo fontes de N provenientes de matérias primas vegetais de baixo custo que rendem altas concentrações de produto. Porém, estes complexos protéicos, assim como estimulam o crescimento e a produção, também podem conter componentes desconhecidos que afetam negativamente o processo. Neste contexto, a utilização de meios sintéticos contendo aminoácidos (AA) pode ser uma boa alternativa. A maioria dos AA é bem assimilada por S. clavuligerus mas apenas alguns favorecem a produção de AC. Asn e Pro, por exemplo, favorecem o crescimento celular, enquanto Orn e Arg são precursores do AC e estimulam sua síntese. Desta forma, meios contendo aminoácidos como fontes de N podem apresentar vantagens significativas, pois, além de direcionar o processo de produção de AC, resultam em caldos mais homogêneos e menos viscosos que promovem melhorias na transferência de massa e calor, nas condições de monitoramento e controle, bem como nos processos de separação, recuperação e purificação do produto. No presente trabalho, utilizou-se a metodologia de planejamento fatorial de experimentos 22, com replicatas do ponto central, para otimizar empiricamente a proporção molar entre glicerol e Orn do meio suplementar sintético de processo contínuo intermitente em frascos agitados agitados (250 rpm, 28ºC). A etapa contínua era iniciada após 48 h de batelada...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The clavulanic acid (CA) is a β - lactam compound that despite not having significant bioactivity, is a potent inhibitor of β - lactamases produced by bacteria resistant to β - lactam antibiotics. The synergistic effect of CA with penicillins and cephalosporins results in blockade of the active site of β - lactamases and protects those antibiotics by giving them a greater spectrum of action. The CA is industrially produced by strains of Streptomyces clavuligerus in media containing N source of low-cost vegetable raw materials that yield high concentrations of the product. However these complex media, as well as stimulates growth and the production, may also contain unknown components that affect negatively the process. Then the use of synthetic media containing amino acid (AA) may be a good alternative. Most of AA is well metabolized by S. clavuligerus but only some of them induce the production of CA. Asn and Pro, for example, promote cell growth, while Orn and Arg are precursors of CA and stimulate its synthesis. Thus media containing amino acids may be significantly advantageous because, in addition to provide a direction for the process, result in more homogeneous and less viscous broths that promote improvements in heat and mass transfer, monitoring and controlling of the process, as well as in the processes of separation, recovery and purification of the product. In this work, the factorial design 22 of experiments methodology was used to optimize empirically the molar ratio between glycerol and Orn of the synthetic supplementary medium of an intermittent continuous process in shaken flasks (250rpm, 28ºC). The continuous process started after 48 h of batch process in a medium containing glycerol as limiting substrate, proteic extract from soybean (Soytone) as the main source of N and salts (pH 6,8 ± 0,2). Sampling and medium supplementation were accomplished every 24 h,...(Complete abstract, click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-11-26Bitstream added on 2014-06-13T20:10:36Z : No. of bitstreams: 1 domingues_lcg_me_araiq.pdf: 462848 bytes, checksum: ffbbb623452b0cbc8d35581e18111652 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O ácido clavulânico (AC) é um composto β-lactâmico que, apesar de não ter atividade antibiótica significativa, é um potente inibidor de β-lactamases produzidas por bactérias resistentes a antibióticos β-lactâmicos. O efeito sinérgico do AC com penicilinas e cefalosporinas resulta no bloqueio do sítio ativo de β-lactamases e, assim, protege aqueles antibióticos conferindo-lhes um maior espectro de ação. O AC é produzido industrialmente por linhagens de Streptomyces clavuligerus em meios contendo fontes de N provenientes de matérias primas vegetais de baixo custo que rendem altas concentrações de produto. Porém, estes complexos protéicos, assim como estimulam o crescimento e a produção, também podem conter componentes desconhecidos que afetam negativamente o processo. Neste contexto, a utilização de meios sintéticos contendo aminoácidos (AA) pode ser uma boa alternativa. A maioria dos AA é bem assimilada por S. clavuligerus mas apenas alguns favorecem a produção de AC. Asn e Pro, por exemplo, favorecem o crescimento celular, enquanto Orn e Arg são precursores do AC e estimulam sua síntese. Desta forma, meios contendo aminoácidos como fontes de N podem apresentar vantagens significativas, pois, além de direcionar o processo de produção de AC, resultam em caldos mais homogêneos e menos viscosos que promovem melhorias na transferência de massa e calor, nas condições de monitoramento e controle, bem como nos processos de separação, recuperação e purificação do produto. No presente trabalho, utilizou-se a metodologia de planejamento fatorial de experimentos 22, com replicatas do ponto central, para otimizar empiricamente a proporção molar entre glicerol e Orn do meio suplementar sintético de processo contínuo intermitente em frascos agitados agitados (250 rpm, 28ºC). A etapa contínua era iniciada após 48 h de batelada... / The clavulanic acid (CA) is a β – lactam compound that despite not having significant bioactivity, is a potent inhibitor of β – lactamases produced by bacteria resistant to β – lactam antibiotics. The synergistic effect of CA with penicillins and cephalosporins results in blockade of the active site of β – lactamases and protects those antibiotics by giving them a greater spectrum of action. The CA is industrially produced by strains of Streptomyces clavuligerus in media containing N source of low–cost vegetable raw materials that yield high concentrations of the product. However these complex media, as well as stimulates growth and the production, may also contain unknown components that affect negatively the process. Then the use of synthetic media containing amino acid (AA) may be a good alternative. Most of AA is well metabolized by S. clavuligerus but only some of them induce the production of CA. Asn and Pro, for example, promote cell growth, while Orn and Arg are precursors of CA and stimulate its synthesis. Thus media containing amino acids may be significantly advantageous because, in addition to provide a direction for the process, result in more homogeneous and less viscous broths that promote improvements in heat and mass transfer, monitoring and controlling of the process, as well as in the processes of separation, recovery and purification of the product. In this work, the factorial design 22 of experiments methodology was used to optimize empirically the molar ratio between glycerol and Orn of the synthetic supplementary medium of an intermittent continuous process in shaken flasks (250rpm, 28ºC). The continuous process started after 48 h of batch process in a medium containing glycerol as limiting substrate, proteic extract from soybean (Soytone) as the main source of N and salts (pH 6,8 ± 0,2). Sampling and medium supplementation were accomplished every 24 h,...(Complete abstract, click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2001Bitstream added on 2014-06-13T18:09:16Z : No. of bitstreams: 1 bersanetti_pa_me_araiq.pdf: 408293 bytes, checksum: bd4796bb7b8735c621e3ef612dc5b87d (MD5) / O ácido clavulânico é um metabólito secundário isolado de culturas de Streptomyces clavuligerus que possui uma atividade antibacteriana fraca, mas é um potente inibidor de b-lactamases. O uso combinado desse composto com penicilinas e cefalosporinas tem se mostrado uma estratégia terapêutica eficiente na luta contra a resistência bacteriana. Esse composto b-lactâmico é produzido por fermentação simultaneamente com outros intermediários metabólicos e sua purificação envolve uma série de etapas, que incluem: adsorção, troca-iônica, extração líquido-líquido, precipitação e cristalização. O objetivo deste trabalho foi a investigação da eficiência de diferentes resinas na purificação do ácido clavulânico por adsorção e troca-iônica. No entanto, como esse composto b-lactâmico apresenta velocidades de degradação elevadas em soluções aquosas, inicialmente estabeleceu-se a faixa de pH de maior estabilidade, situada entre 4,5 e 7,5. Os estudos cinéticos de adsorção em batelada mostraram que somente a resina de troca iônica IRA400 foi eficiente na recuperação do ácido clavulânico, a partir de soluções aquosas. Assim, analisou-se a influência de parâmetros como temperatura, concentração de resina, força iônica e pH no processo de troca-iônica. A caracterização termodinâmica do processo foi possível através da determinação da entalpia de adsorção por microcalorimetria e da afinidade da resina pelo composto em questão. Esses estudos foram importantes para o estabelecimento das melhores condições de adsorção que podem ser empregadas na purificação do ácido clavulânico a partir do caldo fermentativo. / Clavulanic acid is a secondary metabolite isolated from cultures of Streptomyces clavuligerus and presents a low antibacterial activity but is a potent inhibitor of ß-lactamases. Its use in combination with penicillins and cephalosporins has shown to be an efficient therapeutic strategy to face bacterial resistance to antibiotics. This ß-lactam compound is produced by fermentation simultaneously with other metabolic intermediates and its purification involves several steps: liquid-liquid extraction, adsorption, ion-exchange chromatography, precipitation and crystallization. In this work the performance of several resins for the purification of clavulanic acid by adsorption and ion-exchange chromatography was investigated. However, since this ß-lactam compound presents high degradation rates in aqueous solution, inicially the pH range leading to higher stability was determined. The adsorption studies, performed batchwise, has shown that only the Amberlite IRA400 ion exchange resin was effective for the recovery of the clavulanic acid in aqueous solutions. Then, the influence of temperature, resin concentration, ionic strength and pH in the ion exchange process was analyzed. Thermodynamic characterization of the process was achieved by the determination of the adsorption entalphy in a microcalorimetry and by the resin affinity the target compound. This studies were essential for the establishment of the best adsorption conditions which could be applied for the clavulanic acid purification from the fermentation broth.

Orientador: Marcel Otavio Cerri / Resumo: O ácido clavulânico (AC) é um antibiótico β-lactâmico com potente atividade inibitória de β-lactamases, enzimas que hidrolisam o anel β-lactâmico, destruindo o local onde os fármacos β-lactâmicos se ligam às PBPs (proteínas ligadoras de penicilina), exercendo sua ação. O AC tem sido aplicado como adjuvante no tratamento de infecções em combinação com outros antibióticos sensíveis à ação β-lactamases. O AC é produzido a partir de Streptomyces clavuligerus, uma bactéria filamentosa. Em geral, o cultivo para produção de AC é sujeito a efeitos de parâmetros, como temperatura, fontes nitrogênio, agitação e aeração, entre outros. Sabe-se que temperatura influencia o crescimento do microrganismo e a produção do AC, assim como o íon amônio resultante do metabolismo bacteriano é um importante composto quando se trata de degradação e estabilidade da molécula de AC no meio de cultivo. Contudo, não são encontrados na literatura trabalhos que correlacionem o efeito conjunto dois fatores sobre a produção do AC. No presente trabalho foram realizados inicialmente 3 cultivos em mesa incubadora rotativa, C-30 (30°C), C-25 (25°C) E C-20 (20°C), avaliando-se a produção de AC, o consumo de glicerol e a produção de amônio. Um cultivo em biorreator utilizando a melhor condição para produção de AC obtida a partir dos ensaios anteriores, avaliando os mesmos parâmetros dos cultivos iniciais. Por fim foram realizados testes de degradação de AC utilizando solução aquosa e componentes do meio de cultura ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Clavulanic Acid (CA) is a β-lactam antibiotic with a potent inhibitory activity of βlactamases, enzymes that hydrolyze β-lactam ring binding, destroying the site where β-lactam drugs bind to PBPs (penicillin binding proteins), exercising its actions. The CA has been being applied as an adjuvant in the treatment of infections in combination with other β-lactamases action-sensitive antibiotics. CA is produced from Streptomyces clavuligerus, a filamentous bacterium. In general, the cultivation process for CA production is subject to effects of operational parameters, such as temperature, nitrogen sources, agitation and aeration, among others. It is known that temperature influences the growth of microorganism and the production of CA, as well as ammonium, as well as ammonium resulting from bacterial cell metabolism, an important compound when it comes to degradation and stability of the molecule at growing medium. Although, no study has been found in literature, that correlates the effects of these two influents under CA production. In this present study, initially has been elaborated three cultures carried out in a rotating incubator table, C-30 (30ºC), C25 (25 ºC) and C- 20 (20 ºC), evaluating the production of CA, the consumption of glycerol, the production of ammonium in the growth medium, with growth in a bioreactor, using the best conditions for the production of CA, from previous trials, evaluating the same parameters of the initial cultures and degradation tests of CA us... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:57:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissSCAO.pdf: 855834 bytes, checksum: 77a02bfbc98ba9f0aa20131d9b60c2e6 (MD5) Previous issue date: 2005-08-29 / Universidade Federal de Sao Carlos / Clavulanic acid (CA), a secondary metabolite from Streptomyces clavuligerus, is a potent inhibitor of β-lactamases, being formulated by pharmaceutical industries with other β- lactams antibiotics to produce drugs that overcome the resistance to antibiotics of many pathogenic bacteria. Studies on culture medium composition, as well as how each component is added to the broth are essential for improving and developing fermentation processes both in obtaining high productivity, as well as in simplifying the separation and purification of the final product. The lipids become an interesting alternative to be used in CA production process, once they constitute a concentrated source of energy slowly assimilated by microorganisms. With relation to the nitrogen source, soybean derivatives, as flours and protein isolates, have been used successfully in the production of CA, by supplying precursors for its biosynthesis; however, the appropriate amount of this nutrient in culture media has not been properly established so far. The general objective of the present work was to study the culture medium composition on the improvement of CA production by S. clavuligerus in bench scale bioreactor, using complex nitrogen sources, and lipids as supplementary carbon source. In preliminary cultivations in shake flasks, the effects of nitrogen source and concentration, using soybean flour and Samprosoy 90NB (soybean protein isolate), were studied. The total nitrogen concentrations of 1.6 and 3.2 g.L-1, and soybean oil concentration of 16, 23 and 30 g.L-1 were tested. The results obtained showed that, when the concentrations of soybean oil and initial soybean flour were 23 g.L-1 and 20 g.L-1, respectively, the CA production obtained was 700 mg.L-1 in 132 hours cultivation, and at pH values above 7.0 the production process was severely harmed. In conventional bioreactor cultivations, under pH control with acid or base addition, all the cultivations were marked by the high CA production and productivity, accompanied by small degradation of the product. The culture medium composition and cultivation conditions that generated best results, concerning CA production, were as follows: 800 rpm, 0.5 vvm and pH 6.8, soybean flour and soybean oil concentrations of 40 g.L-1 and 16 g.L-1, respectively. Under these conditions, a maximum production of 906 mg.L-1 of CA in 84 hours cultivation was obtained. / O ácido clavulânico (AC), produto do metabolismo secundário da bactéria filamentosa Streptomyces clavuligerus, é um potente inibidor de enzimas β-lactamases, sendo utilizado pela indústria farmacêutica em conjunto com outros antibióticos β-lactâmicos, na formulação de medicamentos que diminuem a resistência de muitas bactérias patogênicas a estes antibióticos. Estudos de composição de meio de cultura, assim como o modo que cada componente é adicionado ao caldo é de vital importância nos processos fermentativos, tanto no que se refere à obtenção de alta produtividade do produto desejado, assim como na facilidade de manipulação, separação e purificação do produto final. Os lipídios apresentam-se como uma alternativa a ser utilizada em processos para produção de ácido clavulânico, uma vez que constituem uma fonte concentrada de energia lentamente assimilável pelos microrganismos. Quanto à fonte de nitrogênio, derivados de soja como farinhas e hidrolisados têm sido utilizados com sucesso na produção de AC, fornecendo precursores para biossíntese deste composto, no entanto, a quantidade adequada desse nutriente não foi ainda estabelecida em meios de cultura até o momento. O presente trabalho teve como objetivo geral o estudo da composição do meio de cultura para produção de ácido clavulânico por Streptomyces clavuligerus em biorreator de bancada, utilizando fontes complexas de nitrogênio e lipídios como fonte de carbono suplementar. Em ensaios preliminares em mesa incubadora rotativa para determinação das concentrações da fonte/ teor de nitrogênio utilizando farinha de soja e Samprosoy 90NB nas concentrações 1,6, e 3,2 g.L-1 de nitrogênio total e concentração de óleo de soja (16, 23 e 30 g.L-1), os resultados obtidos mostraram que quando as concentrações de óleo de soja e farinha de soja iniciais foram 23 g.L-1 e 20 g.L-1, respectivamente, a produção de AC obtida foi 700 mg.L-1 em 132 horas de cultivo, e que valores de pHs acima de 7,0 prejudicam o processo de produção. Nos ensaios em biorreator de bancada convencional, em condições de controle de pH por adição de ácido e base, todos os cultivos foram marcados pela alta produção e produtividade de AC ocorrendo aparente pequena degradação do produto. A composição de meio de cultura que gerou os melhores resultados de produção de AC nas seguintes condições: 800 rpm, 0,5 vvm e pH 6,8, foi o que apresentou farinha de soja e óleo de soja nas concentrações de 40 g.L-1 e 16 g.L-1, respectivamente, na composição do meio de produção, alcançando a produção máxima de 906 mg.L-1 de AC em 84 horas de cultivo.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2477.pdf: 853103 bytes, checksum: cf8d502909db7590755b118f3a0c49b5 (MD5) Previous issue date: 2008-08-28 / Universidade Federal de Minas Gerais / A great deal of microbiological and genetic research in the pharmaceutical industry is directed towards the development of effective strategies in the handling of microorganisms seeking the production of antibiotics that already known. In the process of obtaining clavulanic acid (CA) from Streptomyces clavuligerus, it is necessary to implement a system of strain conservation to maintain the capacity of microorganisms. Therefore, the purpose of this study was to test different preservation strategies of spores and vegetative cells of S. clavuligerus ATCC 27064 in order to ensure optimum conditions for the production of CA. Eight sets of vegetative cells stored in cryotubes were prepared, and they were evaluated for 12 months according to the number of growth stages (one or two 24-hour stages), the influence of the mycelium washing stage (washed or not), and the concentration of the cryoprotective agents (glycerol 10 or 20% v/v). Two sets of spores stored in cryotubes were also evaluated according to the concentration of cryoprotective agents. All cultures were performed in a rotating table incubator using the culture medium ISP1 for reactivation and complex medium for the production of CA. Morphology, cell growth, and the production of CA were evaluated in all cultures. The major findings were that the conservation of spores with 10% glycerol (E-10) allowed a more viable condition that the E-20 during the 360 days of storage, and the loss of CA production after 360 days was 18% but the condition E-20 was 50%. CL1-20 and CL2-20 were the best preservation conditions (more stable) for vegetative cells stored in cryotubes. Regarding the production of CA obtained, the maximum value was 1300 mg.L-1 at 144 h in the CNL 2-20 preservation condition. / Muitas pesquisas microbiológicas e genéticas na indústria farmacêutica são direcionadas para o desenvolvimento de estratégias eficazes na manipulação de microrganismos, visando à produção de antibióticos conhecidos. No processo de obtenção de ácido clavulânico (AC) a partir de Streptomyces clavuligerus faz necessário à implementação de um sistema de conservação da linhagem para manter a capacidade do microrganismo em questão. Baseado neste propósito o objetivo deste trabalho foi testar diferentes estratégias de preservação nas formas de esporos e células vegetativas de S. clavuligerus ATCC 27064 para garantir condições ótimas de produção de AC. Foram preparados 8 conjuntos de criotubos de células vegetativas e avaliados durante 12 meses em relação ao número de etapas de crescimento (uma ou duas etapas de 24 horas), à influência da etapa de lavagem do micélio (lavados ou não) e a concentração do agente crioprotetor (glicerol 10 ou 20% v/v). Dois conjuntos de criotubos de esporos também foram avaliados em relação à concentração do agente crioprotetor. Todos os cultivos foram realizados em mesa incubadora rotativa utilizando-se o meio de cultura ISP1 para reativação e, meio complexo para produção de AC. Avaliou-se em todos os cultivos a morfologia, o crescimento celular, e a produção de AC. Como resultados principais obteve-se que à conservação de esporos com 10% de glicerol permitiu uma viabilidade maior que a condição E-20 durante os 360 dias de armazenamento, sendo que a perda de produção de AC após 360 dias foi de 18% em comparação com a condição E-20 que foi de 50%. As formas de preservação CL1-20 e CL2-20 foram as melhores condições de preservação (mais estável) entre os criotubos preservados na forma de células vegetativas. Em relação às produções de AC obtidas, o valor máximo alcançado foi de 1300 mg.L-1 em 144 h, no modo de preservação CNL 2-20.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2376.pdf: 4470220 bytes, checksum: 644c37c19e76d1210fdcb9459057052a (MD5) Previous issue date: 2008-12-18 / Financiadora de Estudos e Projetos / The clavulanic acid is a powerful inhibitor of the beta-lactamases produced by bacterias resistants to penicillin and cefalosporin. This acid is produced industrially by strains of Streptomyces clavuligerus in complex medium whose carbon and nitrogen source are supplied by inexpensive substances that provide high production. The clavulanic acid has a high affinity for enzymes that attach to penicillin derivatives, what enable to be used with semi-synthetic penicillin, being the combination with amoxilin the best exemple of substances inhibitor of beta-lactamases. The genetic improvement using physical and chemical agents is a necessary strategy in programs of production of bioactive metabolit whereas the industrial strains lost its productivity due phenomenon of genetic instability. In this work it appraised morphologic and biochemistry characteristic of some mutant strains obtained by treatment with UV light and with MMS, always comparing the caracteristics of the mutants with the wild type (Streptomyces clavuligerus ATCC 27064). The results indicated that the mutations originated strains with differents phenotypes, and the larger changes were demonstrated through mutants strains AC116, MMS 150 and MMS 54, that exhibited absence of pigmentation in its mature spores. The strains MMS 150 presented a larger production of AC when cultured in semisynthetics mediums. Among the others mediums the wild type strain obtained a larger production, however when used the modifed complex medium, the MMS 150 strain showed changes in its lipolitic activity and a larger production of AC. / O ácido clavulânico é um poderoso inibidor de enzimas -lactamases produzidas por bactérias resistentes a penicilinas e cefalosporinas. Esse ácido é produzido industrialmente através de cultivos submersos de Streptomyces clavuligerus, em meios complexos cujas fontes de carbono e de nitrogênio são supridas por matérias primas de baixo custo que propiciam altas produtividades. O ácido clavulânico mostra uma grande afinidade por enzimas que se ligam a derivados da penicilina, facilitando a sua utilização frequente com penicilinas semi-sintéticas, sendo a combinação com a amoxicilina o melhor exemplo do uso de substâncias inibidoras de beta-lactamases. O melhoramento genético utilizando agentes físicos e químicos é uma estratégia necessária em programas de produção de metabólitos bioativos já que as linhagens de porte industrial perdem sua produtividade devido a fenômenos de instabilidade genética. Neste trabalho foram avaliadas características morfológicas e bioquímicas de algumas linhagens mutantes obtidas por tratamento com luz UV e com metil metano sulfonato, comparando sempre as características dos mutantes com as da linhagem selvagem (Streptomyces clavuligerus ATCC 27064). Os resultados indicaram que as mutações deram origem a linhagens fenotipicamente diferentes, sendo que as maiores mudanças foram demonstradas pelas linhagens mutantes AC116, MMS 150 e MMS 54, que apresentaram ausência de pigmentação dos seus esporos maduros. A linhagem MMS 150 apresentou uma maior produção de AC diante os cultivos realizados com os meios de cultura semi-sintéticos. Perante os outros meios de cultura a linhagem selvagem obteve uma maior produção, porém quando utilizado o meio de cultura complexo modificado, a linhagem MMS 150 apresentou mudanças na sua atividade lipolítica e uma maior produção de AC.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2034.pdf: 8108586 bytes, checksum: d4e20d9750cebd7ff8374a74f5005c00 (MD5) Previous issue date: 2008-08-29 / Clavulanic acid is a potent inhibitor of many β-lactamase enzymes producing bacteria, which attribute bacterial resistant against cephalosporins and penicillins. The combination of CA with amoxicillin is the most successful example, that clavulanic acid have the ability to enhance the effectives of β-lactam antibiotic, which was β-lactamase sensitive, allowing the use of amoxicillin in treatment of a lot of diseases. Clavulanic acid is obtained by a fermentation method from various microorganisms belonging to many Streptomyces strains such as Streptomyces clavuligerus. CA itself is an unstable hygroscopic oil which is not used for the preparation of pharmaceutical compounds, for this suitable salts are more appropriated. Among these compounds potassium clavulante is the most stable compound which is normally used for pharmaceutical preparations. In the present work a precipitation of potassium clavulanate starting from the clavulanic acid present in the fermentation broth (cultivated at DEQ-UFSCar) was proposed. Therefore were necessary preliminary studies such as the characterization, monitoramment, standardization of CA (Clavulin®) and improvement of the previously purification steps employed before precipitation step. The directly precipitation (R0) which occurred the reaction of CA with potassium 2-ethyl hexanoate resulting in the potassium clavulante and the precipitation with an intermediate step which occurred an previously reaction of CA with the t-octylamine (R1) allowing a formation of a amine salt of CA (stable intermediate) that afterward it was reacted with the potassium 2-ethyl hexanoate for the formation of potassium clavulanate (R2) were evaluated. The studied reactions were optimized through by response surface methodology (experimental design) in order to permit maximize the yield and to evaluate the stability of the potassium clavulanate precipitated. The results obtained were excellent and demonstrated that the reaction of precipitation employed is very appropriate to be used as the final stage of the process of AC purification from fermentation broth, allowing to obtain a raised yield of the potassium clavulanate associated to a high purity. / O ácido clavulânico (AC) é um potente inibidor de certas β-lactamases produzidas por bactérias resistentes às penicilinas e cefalosporinas. A combinação do AC com a amoxicilina é o exemplo de maior sucesso do uso de um antibiótico β-lactâmico sensível a β- lactamase juntamente com um inibidor desta enzima, permitindo assim que a amoxicilina continue sendo efetiva no tratamento de muitas doenças. É produzido via fermentação por linhagens do Streptomyces e dentre estas se encontra o Streptomyces clavuligerus. O ácido clavulânico é um óleo altamente instável e higroscópico, não sendo viável a sua utilização em medicamentos nessa forma, mas sim na sua forma de sal, mais especificamente a de clavulanato de potássio, na qual apresenta maior estabilidade. Assim no presente trabalho foi proposto a precipitação do clavulanato de potássio a partir do ácido clavulânico presente no caldo de fermentação, cultivado no DEQ-UFSCar. Para tanto foram necessários estudos preliminares como a caracterização, monitoramento e padronização do AC (Clavulin®) e também o melhoramento das etapas de purificação empregadas anteriormente a etapa da precipitação. Foram avaliadas a reação direta (R0), na qual ocorreu a precipitação do AC com o 2-etilexanoato de potássio, e a reação indireta, com a passagem por um intermediário estável, na qual ocorreu a precipitação do AC com a t-octilamina (R1), formando um sal de amina do AC (intermediário estável) que posteriormente foi reagido com o 2-etilexanoato de potássio para a formação de clavulanato de potássio (R2). As reações estudadas foram otimizadas através da análise por superfície de resposta (planejamento fatorial) de forma a maximizar o rendimento além de avaliar a estabilidade do clavulanato de potássio precipitado. Foram obtidos excelentes resultados que demonstraram que a reação de precipitação empregada é adequada para ser utilizada como a etapa final do processo de purificação do AC proveniente do caldo de fermentação, permitindo a obtenção do clavulanato de potássio com bom rendimento associado a uma pureza elevada.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DoutRMRGA.pdf: 2980067 bytes, checksum: 99b0c61acbd88a69a219fe18747afa23 (MD5) Previous issue date: 2003-10-02 / Universidade Federal de Minas Gerais / Clavulanic acid (CA), a beta-lactam antibiotic, has been known for its commercial and therapeutic importance. This antibiotic is produced by an actinomicete, Streptomyces clavuligerus, and has a combined use with penicillins, acting as inhibitor of beta-lactamase enzymes. Due this importance, some studies on clavulanic acid production has been developed at DEQ-UFSCar. As a natural consequence of these studies and the global knowledge of this process it was necessary to develop a work studying clavulanic acid purification. The adsorption process was chosen to be studied as the process of clavulanic acid recovery and purification. In the present work a continuous adsorption process for clavulanic acid purification was proposed. This process utilized two stirred tanks (CSTR) with recycle of the adsorbent material. The adsorbent chosen to this process was the ion exchange resin Amberlite IRA 400 in the chloride cycle. First, it was necessary to study the adsorption and desorption kinetics and the clavulanic acid equilibrium isotherms in that resin to investigate the influence of temperature, pH and clavulanic acid initial concentration. The degradation rate of clavulanic acid in basic and acidic solutions is very high; high temperatures also increase the degradation rate. Consequently, studies on clavulanic acid degradation were carried out in the same temperature and pH conditions of the kinetics studies. A mathematical model was proposed to describe the adsorption and desorption processes and the kinetics and transport parameters were determined. The continuous process was also mathematically modeled to obtain preliminary data to carry out the clavulanic acid continuous experiments. The parameters utilized in the continuous adsorption process were optimized by response surface analysis to maximize yield and concentration and purification factors. Experiments of the continuous adsorption process were carried out in some different conditions. The continuous process like proposed was operationally viable, but the concentration and purification factors obtained were lesser than those obtained in fixedbed experiments. / O ácido clavulânico (AC), um antibiótico beta-lactâmico, vem se destacando por sua importância terapêutica e comercial. Esse antibiótico é produzido por um actinomiceto, Streptomyces clavuligerus, e tem seu uso combinado com penicilinas, agindo como inibidor das enzimas beta-lactamases. Devido a esta importância, alguns trabalhos sobre o estudo da produção de ácido clavulânico vêm sendo desenvolvidos no DEQ-UFSCar. Como seqüência natural desses trabalhos, tornou-se necessário o desenvolvimento de um trabalho sobre purificação de ácido clavulânico. Dentre os processos de recuperação de antibióticos destaca-se o processo de adsorção. No presente trabalho foi proposto o estudo do processo contínuo de purificação de ácido clavulânico por adsorção, utilizando para tal dois reatores de mistura (CSTR) com reciclo de resina. O adsorvente escolhido para esse processo foi a resina de troca iônica Amberlite IRA 400 no ciclo cloreto. Inicialmente foi necessário fazer um estudo cinético de adsorção e dessorção e das isotermas de equilíbrio do AC nessa resina, investigando a influência de fatores como concentração inicial de AC, temperatura e pH. A velocidade de degradação do ácido clavulânico é bastante alta principalmente em regiões básicas e ácidas; temperaturas altas também aumentam a velocidade de degradação deste composto. Portanto, foi necessária a realização de um estudo de degradação nas condições de temperatura e pH utilizadas no estudo cinético de adsorção. O processo de adsorção e dessorção em batelada pôde ser simulado através de um modelo matemático, obtendo-se os parâmetros cinéticos e de transporte envolvidos na adsorção. Uma modelagem matemática para o processo contínuo também foi proposta visando a obtenção de dados preliminares para realização de experimentos contínuos de adsorção de AC. Os parâmetros utilizados no processo contínuo foram otimizados através da análise por superfície de resposta de forma a maximizar o rendimento e os fatores de concentração e purificação. Os ensaios do processo de adsorção contínua foram realizados. Esse processo mostrou-se operacionalmente viável apesar de se obter fatores de concentração e purificação menores que aqueles obtidos no processo em leito fixo.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseABN.pdf: 1445725 bytes, checksum: 38e5e0b190be727b51de40dfdf21ac01 (MD5) Previous issue date: 2004-11-29 / Universidade Federal de Minas Gerais / The use of β-lactamase inhibitor in conjunction with β-lactam antibiotics was proposed to improve the efficiency of these antibiotics. The clavulanic acid is an important inhibitor of β-lactamase due its ability to inhibit several classes of β-lactamases. The clavulanic acid is a product from the secondary metabolism of Streptomyces clavuligerus and its production rate is higher after the fast growing phase. Higher productivities can be achieved in cultivations with high cell density. Therefore, the objective of this work was to study the continuous clavulanic acid production process with high cell density, possible with the recycle of cells. Initially, experiments to determine the proper pH and medium compositions to improve clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus were performed. Experiments to examine the effect of inhibition and/or repression by glycerol were also carried out. Continuous culture without cell recycling was performed to develop a kinetic model, including parameter determination, to simulate the process of clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus. Classic models failed to describe the process and a kinetic model which takes into account the simultaneous consumption of glycerol and nitrogen source, as energy sources, was proposed. To obtain high cell density, continuous cultivation with cell recycling was carried out. Among the methods examine to concentrate the cell mass, microfiltration was chosen because it is easily operated and allows the obtention of a limpid broth, as it is able to separate the totality of the cells from cultivation broth. This process eliminates the separation of cells in downstream processes. Concerning the problems such as oxygen transfer limitation and increase in the viscosity of culture broth, it has been observed that it does not hinder the applicability of continuous culture with cell recycling. The present work shows that continuous culture with cell recycling maximizes the productivity, suggesting its utilization for clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus. / O ácido clavulânico é um potente inibidor de β-lactamase, sendo utilizado em associação com antibióticos β-lactâmicos para combater bactérias patogênicas resistentes a ação de antibióticos. É um produto oriundo do metabolismo secundário do Streptomyces clavuligerus produzido à maior velocidade após a fase de crescimento célula. Assim, cultivos com concentrações maiores de células podem resultar em maiores produtividades do processo. Por essa razão o objetivo principal do trabalho foi o estudar o processo contínuo de produção de ácido clavulâncio obtida através de reciclo de células. Inicialmente, foram realizados testes preliminares para determinar o melhor valor de pH bem como a melhor composição de meio de cultivo. Também, foram realizados experimentos para verificar efeitos de inibição de glicerol na produção de ácido clavulânico. Após essa etapa, foram realizados experimentos contínuos sem reciclo celular para determinar os parâmetros cinéticos do modelo, descrevendo o processo de produção de ácido clavulânico por Streptomyces clavuligerus. Para a modelagem matemática, foi proposto um modelo cinético de crescimento celular que considerava o consumo simultâneo do glicerol e da fonte de nitrogênio. Com o objetivo de obter altas concentrações celulares, foram realizados cultivos contínuos com reciclo celular. O processo de microfiltração foi escolhido devido a sua facilidade de operação e por apresentar separação celular de 100%, fato importante, pois elimina a separação celular na etapa de purificação do ácido clavulânico. Problemas relativos à transferência de massa e aumento da viscosidade também foram investigados, verificando-se que limitações decorrentes destes fenômenos são contornáveis através de modificações de condições operacionais. O presente trabalho mostra que a produtividade obtida nos cultivos contínuos com reciclou (25,2mg.L-1.h-1) celular é maior que aquela em batelada (11,7mg.L-1.h-1) e em processos contínuos sem reciclo celular (18,3 mg.L-1.h-1), sugerindo a utilização do sistema com reciclo celular para a produção de ácido clavulânico por Streptomyces clavuligerus.