Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JCT.pdf: 1491888 bytes, checksum: 4d9ca7cdf5589d00d6842774413d3761 (MD5) Previous issue date: 2004-03-25 / Universidade Federal de Sao Carlos / The clavulanic acid (CA) is an important inhibitor of β-lactamases, enzymes that clives the β-lactam ring of penicillins and cephalosporins, inativating these compounds. CA is traditionally produced by Streptomyces clavuligerus in batch (B) or feed batch (FB) cultivations. Considering that the products of easily assimilable catabolic carbon source catabolism repress the biosynthesis of secondary metabolite, including CA, production in FB is preferable because control of nutrient level can be performed. In the present work the effect of supplementing medium (composition, concentration of glycerol and feed flow rate) on the production of CA was evaluated in fed batch cultivations in 4L stirred-tank bioreactor. Aeration was set at 0.5 vvm, the agitation rate was controlled at 800 rpm and pH at 6.8. Initially, a batch cultivation was carried out with glycerol (15 g.L-1) and Samprosoy (20 g.L-1), a soy protein hydrolyzate, as carbon and nitrogen sources, respectively. The results obtained from this experimental, concerning CA production, were considered as standart for comparasion with furter experimental results. Also, the observed glycerol consuption rate was used to define the glycerol feed rate infurter experiments. The kinetic model considering non-associated production with CA degradation was fitted to the experimental results and cultivation in FB were simulated under different conditions of volumetric flow rate (F) and glycerol concentration on supplementary medium (Cse). The experimental results showed that the rate of production of CA and glycerol consumption, were directly related, condition not predicted by model, besides, its negative effect on the AC production after the feeding indicate a possible inhibition/repression effect of glycerol. The possible negative effect of glycerol not confirmed by the results of a batch cultivation with pulse of glycerol at 24 hours cultivation, indicating that this effects caused by others compounds in the culture medium or due to dilution of the medium. The subsequent results with different feeding conditions and glycerol concentration utilizing complete supplementary medium, with only glycerol, indicate that CA production is increased in process with high Cse and low volumetric flow rate (F) that guarantee sufficient carbon source and minimize the dilution effects. / O ácido clavulânico (AC) é um importante inibidor das enzimas β-lactamases que clivam o anel β-lactâmico de antibióticos como penicilinas e cefalosporinas, tornando esses compostos inativos. O AC é tradicionalmente produzido por Streptomyces clavuligerus em cultivos operados em batelada (B) e em batelada alimentada (BA). Pelo fato dos produtos do catabolismo de fontes de carbono facilmente assimiláveis acabarem por reprimir as enzimas responsáveis pela biossíntese de metabólitos secundários, entre os quais inclui-se o AC, a produção em BA é preferível, uma vez que torna possível controlar os níveis de nutrientes no caldo. No presente trabalho foram avaliados os efeitos da alimentação de meio de cultura suplementar (composição, concentração de glicerol e vazão) na produção de AC em batelada alimentada em biorreator de bancada de 4L em cultivos operados a 800 rpm, 0,5 vvm e pH = 6,8. Inicialmente, realizou-se um cultivo em batelada em meio de cultura contendo de glicerol (15 g.L-1) e Samprosoy 90 NB (20 g.L-1), uma proteína isolada de soja. Os resultados desse cultivo em termos de produção de AC serviram de padrão de comparação e a velocidade de consumo de glicerol como base para definir a velocidade de alimentação de glicerol nos cultivos em BA. Um modelo cinético para produto não associado ao crescimento considerando degradação do AC foi ajustado aos resultados experimentais e simulações foram realizadas para cultivos em BA, definindo as condições que deveria conduzir tais cultivos com o intuito de se obter os resultados esperados. Foram realizados cultivos em diferentes condições de vazão volumétrica de alimentação (F) e concentração de glicerol no meio suplementar (Cse). Os resultados experimentais mostraram uma relação linear entre as velocidades de AC e de consumo de glicerol, condição não prevista pelo modelo, além de um efeito negativo na produção de AC num período após o início de alimentação, indicando uma possível inibição ou repressão pelo glicerol, o que foi descartado pelos resultados de um cultivo em batelada com pulso de glicerol em 24 horas, indicando que tal influência poderia ser devido a outro (s) constituinte (s) do meio ou a diluição. Os resultados de cultivos subseqüentes, em diferentes condições de vazão e de concentração de glicerol e com meio de cultura suplementar completo e com apenas glicerol, indicaram que a produção de AC é melhorada operando o processo com alta Cse e baixas vazões (F), condições que asseguram suficiência em fonte de carbono e minimizam os efeitos de diluição

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2676.pdf: 1847822 bytes, checksum: 58fc94ed542ac5ac19abe8c829cc836d (MD5) Previous issue date: 2009-03-30 / Universidade Federal de Sao Carlos / Clavulanic acid and cephamycin C are ϐ-lactam compounds, an important group of drugs used in the treatment of several bacterial diseases, and are simultaneously produced by the bacteria Streptomyces clavuligerus. Similarly to any secondary metabolite, the production of these compounds can be controlled by the intracellular concentration of precursors and cofactors, and their availability to be used in the secondary metabolism depends directly on the nutritional composition changes in the culture media. Based on these facts, the aim of this work was to evaluate the effect of some carbon and nitrogen sources on clavulanic acid (CA) and cephamycin C (CefC) production by S. clavuligerus, and to propose a kinetic model able to represent the influence of these compounds on the behavior of this bioprocess. The fermentation runs were carried out in shakers, using synthetic media, combining glycerol, maltose, asparagine, proline, glutamic acid and ornithine. The results showed that both carbon and nitrogen sources were limitants. The fermentations with media containing maltose gave the highest CA and CefC productions, but the bacterial growth was lower. On the other hand, the fermentations with the media containing glycerol gave a higher bacterial growth and lower production, except for the fermentation using the media composed by glycerol, proline and ornithine, that gave the lowest growth and CA production, and there was no CefC production. The aditition of glutamic acid in the medium containing maltose and asparagine, and the aditition of more asparagine in this same medium favored the bacterial growth, but have no effect on production. The glutamic acid effect on the growth was more intense than that of asparagine. Based on the obtained results, a kinetic model describing the growth, CA and CefC production was proposed. The adjustment of the model to the experimental data was made in six different fermentations. The model had a good adjustment to four of all the media tested, and was able to represent the bioprocess within the conditions studied in this work. / O ácido clavulânico e a cefamicina C são compostos -lactâmicos, um importante grupo de medicamentos utilizados no tratamento de doenças bacterianas, e são produzidos simultaneamente pela bactéria Streptomyces clavuligerus. Como qualquer metabólito secundário, a produção destes compostos pode ser controlada pela concentração intracelular de precursores e cofatores, e a sua disponibilidade para uso no metabolismo secundário responde diretamente a mudanças na concentração de nutrientes presentes no meio de cultura. Baseado nestas informações, este trabalho teve como objetivo avaliar como certas fontes de carbono e nitrogênio afetam a produção do ácido clavulânico (AC) e cefamicina C (CefC) por S. clavuligerus, e desenvolver um modelo cinético que possa descrever matematicamente a influência destes componentes no bioprocesso. Para isso, foram realizados cultivos em mesa incubadora rotativa, usando meios sintéticos constituídos da combinação de glicerol, maltose, asparagina, prolina, ácido glutâmico e ornitina. Os resultados dos cultivos mostraram que tanto as fontes de carbono e energia quanto as fontes de nitrogênio foram limitantes. Os cultivos em meios com maltose apresentaram as maiores produções de AC e CefC, mas um menor crescimento. Um comportamento contrário foi observado nos cultivos com os meios contendo glicerol. O cultivo realizado no meio contendo glicerol, prolina e ornitina foi o que apresentou menor crescimento e produção de AC, e nenhuma produção de CefC. O ácido glutâmico favoreceu o crescimento no meio com maltose e asparagina, mas não alterou a produção. O aumento da concentração de asparagina no meio com maltose e asparagina também favoreceu o crescimento, mas também não apresentou nenhum efeito sobre o crescimento e produção. Baseado nos resultados obtidos, foi proposto um modelo matemático que descrevesse o crescimento e a produção de AC e CefC nos meios utilizados. O ajuste foi feito em seis meios diferentes. O modelo apresentou um bom ajuste aos dados experimentais para quatro dos meios estudados e foi capaz de representar o bioprocesso nas condições testadas neste trabalho.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-06-13T15:36:13Z No. of bitstreams: 1 Marcia Nieves Carneiro da Cunha.pdf: 1895206 bytes, checksum: 69a6b07c6d8f6d7284d8b6a3598e376d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-13T15:36:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcia Nieves Carneiro da Cunha.pdf: 1895206 bytes, checksum: 69a6b07c6d8f6d7284d8b6a3598e376d (MD5) Previous issue date: 2014-03-30 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Clavulanic acid is a β-lactam antibiotic, consisting of a β-lactam ring fused to oxazolidine ring. This compound is used clinically in combination with conventional β-lactam antibiotics. The present study evaluated the simultaneous extraction and production of clavulanic acid by Streptomyces malasyensis DPUA 1571 by extractive fermentation using Aqueous Two-Phase Systems (ATPS). Initially, a study of the stability of commercial clavulanic acid in polyethylene glycol (PEG) and citrate solutions at different concentrations and extraction of this compound in ATPS composed of PEG/citrate realized. In the following stage of the present work clavulanic acid production by Streptomyces malasyensis DPUA 1571 by conventional fermentation was performed in order to verify the ability of this microrganism to produce clavulanic acid, and the results obtained made it possible to realization of integrated production and extraction of clavulanic acid using extractive fermentation in ATPS formed by PEG / citrate. Later, there was the influence of different variables in the production of clavulanic acid by Streptomyces malasyensis DPUA 1571 in bioreactor. Studies on the degradation of the clavulanic acid have shown that it is more stable in PEG 20.000 g/mol, pH 6. Due to the results obtained ATPS used partition of clavulanic acid was performed using PEG molar mass 20.000 g/mol. The clavulanic acid was detected in the PEG-rich phase with a concentration of 30% was obtained 188.83 mg/L of clavulanic acid with coefficient K = 3.46 and partition recovery equal to Y = 139.22%. Streptomyces malasyensis DPUA 1571 was capable to produce clavulanic acid, and this production of 387.66 mg/L after 72 hours of cultivation, and production was made possible by extractive fermentation. In this process, the largest concentration of clavulanic acid (337.8 mg.L) was obtained from the PEG-rich phase, were used when higher concentrations of citrate and PEG (25%). Values of partition coefficient of 1.6 and yields of up to 98.2%. In a third step of this work, the production of clavulanic acid by Streptomyces malasyensis DPUA 1571 was performed in bioreactor bench (2.0L). After 120 hours of culture, higher high concentration of clavulanic acid (2241.38 mg/L) were observed. Results concluding that Streptomyces malasyensis DPUA 1571 is a promising source of clavulanic acid with potential for application in the pharmaceutical area. / O ácido clavulânico é um antibiótico β-lactâmico, constituído por um anel β-lactâmico condensado a um anel oxazolidina. Este composto é utilizado clinicamente em combinações com antibióticos β-lactâmicos convencionais. No presente trabalho foi avaliada a produção e extração simultânea de ácido clavulânico por Streptomyces malasyensis DPUA 1571 através de fermentação extrativa utilizando Sistemas de Duas Fases Aquosas (SDFA). Inicialmente foi realizado um estudo da estabilidade do ácido clavulânico comercial em soluções de Polietilenoglicol (PEG) e soluções de citrato em diferentes concentrações, e a extração deste composto por SDFA compostos por PEG/citrato. Na etapa seguinte do presente trabalho foi realizada a produção do ácido clavulânico por Streptomyces malasyensis DPUA 1571 por fermentação convencional, visando verificar a capacidade deste micro-organismo em produzir ácido clavulânico, e os resultados obtidos viabilizaram a realização da produção e extração integradas do ácido clavulânico utilizando fermentação extrativa em SDFA formados por PEG/citrato. Posteriormente, verificou-se a influência de diferentes variáveis na produção de ácido clavulânico por Streptomyces malasyensis DPUA 1571 em biorreator. Os estudos sobre a degradação do ácido clavulânico demonstraram que este é mais estável em PEG 20.000 g/mol, a pH 6. Devido aos resultados obtidos os SDFA utilizados para a partição do ácido clavulânico foram realizados utilizando PEG com massa molar 20.000 g/mol. O ácido clavulânico foi detectado na fase rica em PEG com concentração de 30%, sendo obtido 188,83 mg/L de ácido clavulânico, com coeficiente de partição de K=3,46 e com recuperação igual a Y=139,22%. Streptomyces malasyensis DPUA 1571 foi capaz de produzir ácido clavulânico, sendo esta produção de 387.66 mg/L após 72 horas de cultivo, e a produção por fermentação extrativa foi viabilizada. Neste processo a maior concentração de ácido clavulânico (337, 8 mg.L-1) foi obtida na fase rica em PEG, quando foram utilizadas as maiores concentrações de PEG e citrato (25%). Valores de coeficiente de partição de 1,6 e rendimentos de até 98,2% foram obtidos. Em uma terceira etapa deste trabalho, foi realizada a produção do ácido clavulânico por Streptomyces malasyensis DPUA 1571 em biorreator de bancada (2.0L). Após 120 horas de cultivo foi observada alta concentração de ácido clavulânico (2241,38 mg/L). Resultados que permitem concluir que Streptomyces malasyensis DPUA 1571 é uma promissora fonte de ácido clavulânico com potencial para aplicação na área farmacêutica.

Orientador: Francisco Maugeri Filho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-18T02:03:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_AndreaLimoeiro_D.pdf: 2076758 bytes, checksum: 0190971971b90ab3f96544e50f0d9933 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A nanofiltração é um processo com membrana por diferença de pressão, enolvendo também mecanismos de sorção e difusão, que pode ser aplicado na etapa de concentração do caldo clarificado na produção de ácido clavulânico. No presente trabalho, o ácido clavulânico foi concentrado, avaliou-se a eficiência do processo e estudaram-se os parâmetros envolvidos na transferência de massa e aplicados ao modelo matemático SEDE-VCh, assim como avaliou-se a ampliação de escala do processo. Esse estudo foi dividido nas seguintes etapas: seleção e caracterização das membranas; aplicação do modelo matemático, nos quais foram realizados experimentos para avaliar o desempenho das membranas NF e NF90 (ambas da FilmtecTM), e NP010 e NP030 (ambas da Microdyn Nadir®); ampliação de escala do processo, na qual a membrana que apresentou os melhores resultados nas etapas anteriores foi utilizada. Quanto à seleção da membrana, as respostas avaliadas foram o coeficiente de retenção, a produtividade e o fator de purificação. Na etapa de caracterização da membrana, foi avaliada a morfologia de superfície das quatro membranas, obtendo-se o tamanho e a distribuição de poros, a rugosidade, a dimensão fractal e a permeabilidade das mesmas, além de estudos que forneceram dados referentes aos efeitos estéricos e elétricos sobre o transporte através das membranas, como suas densidades superficiais e volumétricas de carga, a concentração do soluto nas suas superfícies externas e o coeficiente de transferência de massa do processo. A partir desses dados foi gerado um modelo para explicar o transporte através das membranas. Por fim foram feitos experimentos para verificar o comportamento do processo em uma escala piloto. Os resultados obtidos demonstram que a membrana NF é a melhor para o processo de concentração de ácido clavulânico com coeficiente de retenção médio de 0,988 em escala de bancada e aproximadamente 1,0 em escala piloto. As quatro membranas apresentaram raios de poro inferiores a 1 nm e ponto isoelétrico em pH entre 5 e 6. A membrana NP010 apresentou maior permeabilidade à água, e as demais na seguinte ordem: NP010 > NP030 > NF > NF90. Esse parâmetro se relaciona de forma linear com o diâmetro médio de poros e sua redução aumenta com a diferença entre a dimensão fractal antes e depois do uso das membranas. Foi possível verificar também que em altas adsorções a rugosidade das membranas tendem a ser similares. A membrana NF90 apresentou um maior coeficiente de transferência de massa, seguido da NF, NP010 e NP030, nessa ordem, sendo que a rejeição variou com o pH para as membranas NF e NF90. A constante dielétrica dentro dos poros aumenta inversamente ao tamanho médio dos poros das membranas até quando a mesma atinge o valor da água livre. A seletividade da membrana ao KCl e ácido clavulânico apresenta a mesma tendência da densidade volumétrica de cargas: NF > NF90 > NP030 _ NP010. Com os estudos de ampliação de escala foi possível determinar que o sistema convencional que simula o processo de fluxo tangencial pode ser usado em outros estudos de avaliação de processos e de seleção de membranas visando à aplicação industrial, e que peptídeos e aminoácidos podem atuar melhorando o processo de concentração de ácido clavulânico por nanofiltração. A produtividade final obtida foi de até 6.4 [CA]RET/[CA]0.L.h. / Abstract: Nanofiltration is a pressure driven membrane process, with desorption and diffusion, which is also applied to the concentration of clavulanic acid from a clarified juice. In this study, clavulanic acid was concentrated, and the process had its efficiency evaluated and its mass transfer parameters studied and applied to the mathematical model SEDE-VCh, and in addition scale up was also evaluated. This study was divided into the following stages: selection and characterization of the membranes, and the application of the model, in which experiments were performed to evaluate the performance of the NF and NF90 membranes (both FilmtecTM), and NP010 and NP030 (both Microdyne Nadir®), and the scale up of the process, in which the membrane that showed the best results in the previous steps was used. Concerning the selection of the membrane, the evaluated responses were the retention coefficient, productivity and purification factor. In the characterization of the membrane step, we evaluated the surface morphology of the four membranes, targeting the pore size and pore size distribution, roughness, fractal dimension and permeability, in addition to studies that provided data on the electrical and steric effects over the transport through the membranes, as their surface and volumetric density charges, the concentration of solute in its external surfaces and the mass transfer coefficient of the process. From these data a model was created to explain the transport through the membranes. Finally experiments were carried out to verify the behavior of the process in a pilot scale. The results showed that the NF membrane is best for the process of concentration of clavulanic acid with retention coefficient average of 0.988 in bench scale and almost 1.0 in the pilot plant. All the four membranes had pore radii below 1 nm and an isoelectric point between pH 5 and 6. The NP010 membrane showed the higher water permeability, in the following order: NP010 > NP030 > NF > NF90. This parameter is related linearly with the average pore size and its reduction increases with the difference between the fractal dimension before and after the use of the membranes. It was also verified that at high adsorption the roughness of the membranes tends to be similar. The NF90 membrane showed a higher mass transfer coefficient, followed by NF, NP010 and NP030, in that order and the rejection varied with the pH for the NF and NF90 membranes. The dielectric constant inside the pores increases inversely with pore size of the membranes even when it reaches the value of free water. The selectivity of the membrane to KCl and clavulanic acid shows the same trend as the volumetric density charge: NF > NF90 > NP030 _ NP010. By means of the studies of scale up it was determined that the conventional system with a stirrer that promotes the convection movement in the process can be used in other studies of process evaluation and selection of membranes in view of industrial application, and also that peptide and mino acid substances improve the process concentration of clavulanic acid by nanofiltration. The final productivity was about 6.4 [CA]RET/[CA]0.L.h. / Doutorado / Engenharia de Alimentos / Doutor em Engenharia de Alimentos

Ácido clavulânico (AC) é um potente inibidor de β-lactamases, produzido por Streptomyces clavuligerus, usado clinicamente em combinação com antibióticos β-lactâmicos para tratar infecções bacterianas resistentes. Apesar da produção industrial de AC já ser bem estabelecida muitos aspectos importantes relacionados com sua biossíntese permanecem carentes de estudo. Sabe-se que a via de síntese do AC envolve no mínimo 8 passos enzimáticos sendo os primeiros passos mais abordados. Por exemplo, as enzimas N2-(2-carboxietil) arginina sintase (CEAS), β-lactama sintase (BLS) e proclavaminato amidino hidrolase (PAH) são as responsáveis pela primeira, segunda e quarta reações enzimáticas respectivamente. Estudos mutagênicos recentes em S.clavuligerus relacionaram cópias extras dos genes ceas, bls e pah (ceas1, bls1 e pah1) com essa via porém nenhum ensaio enzimático foi relatado. Embora os passos finais da via ainda não estejam completamente estabelecidos, a ação de algumas enzimas putativas, como a codificada por orf12, mostraram ser essenciais a produção do AC. Assim, com o objetivo de aumentar a informação disponível sobre a biossíntese do AC estudamos quatro de seus membros: CEAS1, BLS1, PAH1 e a proteína putativa codificada pela orf12. Os genes foram isolados a partir do DNA genômico de S. clavuligerus por PCR e clonados em vetores para produção das proteínas recombinantes em E.coli. Os protocolos de expressão foram estabelecidos para CEAS1, PAH1 e ORF12 e as proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade por metal. BLS foi obtida de forma isolúvel. As proteínas solúveis foram caracterizadas por meio de técnicas bioquímicas e estruturais. As análises de CEAS1 e PAH1 foram comparadas com informações já obtidas para as isozimas CEAS2 e PAH2, respectivamente. Assim, as análises de oligomerização das proteínas resultaram em uma mistura de oligômeros (monômero, dímero e tetrâmero) para CEAS1, na forma hexamérica para PAH1 e na forma dimérica para ORF12, estando de acordo com as formas solúvel e cristalográfica de CEAS2 (dímero e tetrâmero) e PAH2 (hexâmero). Espectros de dicroísmo circular mostraram que CEAS1 e PAH1 possuem um enovelamento do tipo α/β sendo estáveis até 35ºC e numa ampla faixa de pH. Os parâmetros termodinâmicos da interação entre CEAS1 e o cofator Mg+2 foram determinados mostrando que é entropicamente dirigida, com uma estequiometria de ligação de 4 : 1, com uma constante de afinidade na ordem de micromolar (KD = 1,76 ± 0.23 µM). Análises realizadas com as técnicas de reação acoplada, de Cromatografia Líquida de Alta Pressão acoplada a Espectrometria de Massas (LC-MS) e de Calorimetria de Titulação Isotérmica mostraram que CEAS1, assim como CEAS2, apresenta atividade sob o substrato gliceraldeído-3-fosfato, porém sem a formação do produto final N2-(2-carboxietil)arginina. Por outro lado, a proteína recombinante PAH1 mostrou ser inativa sobre o substrato análogo, N-α-acetil-L-arginina. Assim, apesar das isozimas manterem um padrão estrutural, podem ter mecanismos de ação distintos. Em relação a ORF12 esta proteína foi classificada com uma β-lactamase com atividade esterase de acordo com nossos estudos realizados com os substratos cefalosporina C e p-nitrofenil acetato. / Clavulanic acid (CA) is a potent inhibitor of β-lactamases, produced by Streptomyces clavuligerus, clinically used in combination with β-lactam antibiotics to treat resistant bacterial infections. Although CA industrial production is well-established, many important aspects related to its biosynthesis remains under study. It is known that CA pathway involves at least 8 enzymatic steps, being the earliest stages more addressed. For instance, N2-(2-carboxyethyl) arginine synthase (CEAS), β-lactam synthase (BLS) and proclavaminate amidinohydrolase (PAH) are responsible for the first, second and fourth enzymatic reaction, respectively. Recent mutagenic studies in S.clavuligerus have related extra copies of ceas, bls and pah genes ((ceas1, bls1 e pah1) to this pathway but none enzymatic assay was further reported. Although later stages the pathway remain unclear, the action of some putative enzymes like the codified by orf12 showed essential to CA production. Thus, aiming to increase the information available about CA biosynthesis we studied four of its members: CEAS1, BLS1, PAH1, and the putative protein codified by orf12. The genes were isolated from S.clavuligerus genomic DNA by PCR and further cloned into expression vectors in order to produce recombinant proteins in E.coli. Protocols of protein expression were established to CEAS1, PAH1 and ORF12 and recombinant proteins were purified by metal affinity chromatography. BLS was obtained as an insoluble form. Soluble proteins were characterized by means of biochemical and structural approaches. Analyses of CEAS1 and PAH1 were compared with information ever conducted to the isozymes CEAS2 and PAH2, respectively. Thus, oligomerization analysis of proteins resulted respectively in a mix of oligomers forms (monomer, dimer, tetramer) to CEAS1, hexameric form to PAH1 and dimeric form to ORF12, according to the soluble and crystallographic form of CEAS2 (dimer and tetramer) and PAH2 (hexamer). Circular Dichroism spectra showed that CEAS1 and PAH1 have an α-β conformation and were stable up to 35ºC over a wide pH range. Thermodynamic parameters of CEAS1 cofactor (Mg+2) binding were determined showing that is entropic driven, with a 4:1 binding stoichiometry, with a micro-molar affinity (KD = 1.76 ± 0.23 µM). Analyses by coupled assay, High Pressure Liquid Chromatography coupled to Mass Spectroscopy (LC-MS) and Isothermal Titration Calorimetry showed that CEAS1, as well as the CEAS2, presents activity at the substrate glyceraldehydes-3-phosphate, however without formation of final product, N2-(2-carboxyethyl)arginine. Meanwhile recombinant PAH1 showed none activity at analogous substrate, N-α-acetil-L-arginine. Thus despite isozymes maintain a structural pattern, they may have distinct action mechanism. Regards to ORF12, this protein was classified as a β-lactamase with an esterase activity according to our studies performed with the substrates cephalosporin C and p-nitrophenyl acetate.

A viabilidade da produção em escala industrial de produtos biotecnológicos de interesse comercial e terapêutico, como os fármacos, depende significativamente das técnicas de separação e purificação utilizadas. A aplicação do sistema de duas fases aquosas (SDFA) é proposta como alternativa para a purificação, pois permite a separação e análise de biomoléculas, de modo que estas não percam sua atividade ou propriedades desejadas. Esta técnica é interessante para a purificação em larga escala, pois permite partição seletiva, com potencial de obtenção de altos rendimentos, além de apresentar boa relação custo-benefício. O presente trabalho estudou a purificação por extração líquido-líquido do ácido clavulânico em SDFA utilizando um novo sistema polimérico aquoso, formado pelos polímeros polietileno glicol (PEG) e ácido poliacrílico (APA). Foram estudadas diferentes composições do sistema polimérico aquoso PEG/APA, empregando diferentes massas molares e concentrações para o PEG e utilizando a massa molar 8000g/mol para o APA. Com base nas informações obtidas o melhor ponto de extração para o ácido clavulânico na presença de Na2SO4 foi definido como MPEG=400 g/mol, CPEG=17,5% (m/m) e CNaPA=22,5% (m/m) com K= 19,14, ηT=91,21%, BM=101,69 e R=0,45. Enquanto que na presença de NaCl, o melhor ponto encontrado foi: MPEG=400 g/mol, CPEG=35% (m/m) e CNaPA=10% (m/m) com K=11,96 ηT=80,04%, BM=90,18 e R=0,66. No trabalho será avaliada, também, a influência da temperatura, pH e força iônica nesse sistema. Estabeleceram-se os melhores parâmetros de separação do ácido clavulânico presente em meio fermentado produzido por Streptomyces clavuligerus utilizando a metodologia de fermentação extrativa com SDFA PEG/APA. O efeito do ácido clavulânico no diagrama de fases do sistema PEG-APA, bem como sua partição na forma pura e na presença de homogeneizado celular, foi estudado principalmente através da determinação do coeficiente de partição e recuperação do respectivo fármaco. / The viability of industrial scale production of commercial and therapeutical biotechnological products, such as drugs, is significantly dependent on the separation and purification techniques applied. The use of two-aqueous phase systems (ATPS) is proposed as an alternative to purification because it allows the separation and analysis of biomolecules, so that they do not lose their activities or desired properties. This technique is interesting for large scale purification because it allows selective partition with high potential yield and good cost/benefit ratio. The present work studied the purification of clavulanic acid (CA) by liquid-liquid extraction in ATPS applying a new aqueous polymeric system composed of two polymers, namely polyethylene-glicol (PEG) and sodium polyacrylate (NaPA). Different compositions of the aqueous polymeric system (PEG/PAA) were utilized, employing different PEG molar masses (MPEG) and concentrations (CPEG) and a molar mass of PAA of 8000 g/mol. In the light of the results obtained, the best conditions for clavulanic acid extraction, in the presence of Na2SO4, were MPEG = 400 g/mol, CPEG = 17.5% (m/m) and CNaPA = 22.5% (m/m), which allowed obtaining a partition coefficient (K) of 19.14, a yield in the top phase (ηT) of 91.21%, a mass balance (MB) of 101.69 and a volume ratio (R) of 0.45. On the other hand, in the presence of NaCl, the best results (K = 11.96, ηT = 80.04%, MB = 90.18 and R = 0.66) were found at: MPEG = 400 g/mol, CPEG = 35% m/m and CNaPA = 10% m/m. The effect of clavulanic acid in the PEG-PAA system phase diagram and its partition either in its pure form or in the cell homogenate were studied mainly through both the determination of the partition coefficient and the recovery of the drug selected for this study.

A viabilidade da produção em escala industrial de produtos biotecnológicos de interesse comercial e terapêutico, como os fármacos, depende significativamente das técnicas de separação e purificação utilizadas. A aplicação do sistema de duas fases aquosas (SDFA) é proposta como alternativa para a purificação, pois permite a separação e análise de biomoléculas, de modo que estas não percam sua atividade ou propriedades desejadas. Esta técnica é interessante para a purificação em larga escala, pois permite partição seletiva, com potencial de obtenção de altos rendimentos, além de apresentar boa relação custo-benefício. O presente trabalho estudou a purificação por extração líquido-líquido do ácido clavulânico em SDFA utilizando um novo sistema polimérico aquoso, formado pelos polímeros polietileno glicol (PEG) e ácido poliacrílico (APA). Foram estudadas diferentes composições do sistema polimérico aquoso PEG/APA, empregando diferentes massas molares e concentrações para o PEG e utilizando a massa molar 8000g/mol para o APA. Com base nas informações obtidas o melhor ponto de extração para o ácido clavulânico na presença de Na2SO4 foi definido como MPEG=400 g/mol, CPEG=17,5% (m/m) e CNaPA=22,5% (m/m) com K= 19,14, ηT=91,21%, BM=101,69 e R=0,45. Enquanto que na presença de NaCl, o melhor ponto encontrado foi: MPEG=400 g/mol, CPEG=35% (m/m) e CNaPA=10% (m/m) com K=11,96 ηT=80,04%, BM=90,18 e R=0,66. No trabalho será avaliada, também, a influência da temperatura, pH e força iônica nesse sistema. Estabeleceram-se os melhores parâmetros de separação do ácido clavulânico presente em meio fermentado produzido por Streptomyces clavuligerus utilizando a metodologia de fermentação extrativa com SDFA PEG/APA. O efeito do ácido clavulânico no diagrama de fases do sistema PEG-APA, bem como sua partição na forma pura e na presença de homogeneizado celular, foi estudado principalmente através da determinação do coeficiente de partição e recuperação do respectivo fármaco. / The viability of industrial scale production of commercial and therapeutical biotechnological products, such as drugs, is significantly dependent on the separation and purification techniques applied. The use of two-aqueous phase systems (ATPS) is proposed as an alternative to purification because it allows the separation and analysis of biomolecules, so that they do not lose their activities or desired properties. This technique is interesting for large scale purification because it allows selective partition with high potential yield and good cost/benefit ratio. The present work studied the purification of clavulanic acid (CA) by liquid-liquid extraction in ATPS applying a new aqueous polymeric system composed of two polymers, namely polyethylene-glicol (PEG) and sodium polyacrylate (NaPA). Different compositions of the aqueous polymeric system (PEG/PAA) were utilized, employing different PEG molar masses (MPEG) and concentrations (CPEG) and a molar mass of PAA of 8000 g/mol. In the light of the results obtained, the best conditions for clavulanic acid extraction, in the presence of Na2SO4, were MPEG = 400 g/mol, CPEG = 17.5% (m/m) and CNaPA = 22.5% (m/m), which allowed obtaining a partition coefficient (K) of 19.14, a yield in the top phase (ηT) of 91.21%, a mass balance (MB) of 101.69 and a volume ratio (R) of 0.45. On the other hand, in the presence of NaCl, the best results (K = 11.96, ηT = 80.04%, MB = 90.18 and R = 0.66) were found at: MPEG = 400 g/mol, CPEG = 35% m/m and CNaPA = 10% m/m. The effect of clavulanic acid in the PEG-PAA system phase diagram and its partition either in its pure form or in the cell homogenate were studied mainly through both the determination of the partition coefficient and the recovery of the drug selected for this study.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 623.pdf: 1119771 bytes, checksum: 03ec886c5b7c1e6b64f80f767a197553 (MD5) Previous issue date: 2005-03-28 / Financiadora de Estudos e Projetos / The importance of the airlift bioreactor has grown in the biotechnology field by aspects as high oxygen transfer, with power input low. In this work were study the conditions heat and mass transfer, as well as the condenser efficiency in the water retention, of an airlift bench bioreactor of internal circulation of useful capacity 6 L. Such bioreactor is endowed with hollow draft tube working as a heat charger for temperature control and of aspersor type crosspiece for aspersion of air. Values of the heat transfer global coefficient (U) were certain in different operation conditions starting from applied energy balance in the system after the same to reach the steady state. Values of U varied in the range from 300 to 700 W.m-2.°C-1, showing that the device of thermal change proposed was efficient to heat removal. The results were correlated with the water flow inside the draft tube and with the feeding air flow in the bioreactor. After this stage, it was evaluated water drags of the bioreactor system plus condenser in different conditions of air flow and temperatures in the bioreactor and in the condenser. The condenser was shown efficient in the water retention, obtaining efficiency superior values to 80%, but it didn't solve the problem of water loss by water drag for the high air flows in that the airlift bioreactor is operated. The variable air flow was the variable that influenced more significantly water drags. The transfer oxygen was evaluated through the oxygen transfer volumetric coefficient (kLa). For comparison, kLa values were obtained in the airlift bioreactor operated in a range of specific feeding air flow from 1 to 5 vvm and in conventional bioreactor of 4 L, in different agitation conditions (600, 800 and 1000 rpm) and aeration (0,5 and 1,0 vvm). Two methods for kLa determination were employees, the sulfite method and the dynamic method considering the delay of the electrode answer. This last one that generated results between 2 and 6 times inferior, depending of bioreactor type, because it evaluates the kLa in coalescent media, similar to most of the media fermentation. Finally, to validate the use of the system as bioreactor, cultivations with Streptomyces clavuligerus seeking to the production of clavulanic acid, a potent inhibitor of β-lactamase, enzyme producted by patogenics microorganism that broke β-lactamic rings of antibiotics. Four cultivations were accomplished, two in airlift bioreactor and two in bioreactor conventional (Bioflo III) in two different conditions of oxygen transfer (kLa) and the results were compared in terms of clavulanic acid production. The maximum clavulanic acid concentrations obtained in the cultivations in airlift bioreactor were superior those obtained in conventional bioreactor, with minors consistence index (K), showing larger shear rate in the airlift bioreactors in the same conditions of transfer oxygen. In global terms, the obtained results suggest that bioreactor as the most appropriate for this cultivation type, justified for the appropriate heat and mass transfers formed an alliance with the smallest energy consumption. / A importância do biorreator airlift tem crescido no campo da biotecnologia por aspectos como a sua alta transferência de oxigênio, obtida através de consumo de potência. No presente trabalho foram avaliadas as condições de transferência de calor e massa, bem como a eficiência do condensador na retenção de água, de um biorreator airlift de circulação interna, onde o ar é injetado pelo centro do tubo interno, de bancada de 6 L de capacidade útil. Tal biorreator é dotado de tubo interno ( draft tube ) oco funcionando como um trocador de calor para controle de temperatura e de aspersor tipo cruzeta para aspersão de ar. Valores do coeficiente global de transferência de calor (U) foram determinados em diferentes condições de operação a partir de balanço de energia aplicado no sistema após o mesmo atingir o estado estacionário. Valores de U variaram na faixa de 300 a 700 W.m-2.°C-1, mostrando que o dispositivo de troca térmica proposto foi eficiente na remoção de calor.Os resultados foram correlacionados com a vazão de água no interior do tubo interno e com a vazão de alimentação de ar no biorreator. Após esta etapa, avaliou-se o arraste de água do sistema biorreator mais condensador em diferentes condições de vazão de ar e de temperaturas no biorreator e no condensador. O condensador mostrou-se eficiente na retenção de água, obtendo valores de eficiência superiores a 80%, mas não solucionou por completo o problema de perda de água do sistema por arraste pelos altos fluxos de ar em que se opera o biorreator airlift. A variável vazão de ar foi a variável que influenciou mais significativamente o arraste de água. A transferência de oxigênio foi avaliada através do coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa). Para efeito de comparação, valores de kLa foram obtidos no biorreator airlift operado numa faixa de vazão específica de alimentação de ar de 1 a 5 vvm e em biorreator convencional de 4 L, em diferentes condições de agitação (600, 800 e 1000 rpm) e aeração (0,5 e 1,0 vvm). Dois métodos para determinação do kLa foram empregados, o método do sulfito e o método dinâmico considerando o atraso da resposta do eletrodo. Este último que gerou resultados entre 2 e 6 vezes inferiores, dependendo do tipo do biorreator, pois avalia o kLa em meios coalescentes, similares à maioria dos caldos de fermentação. Por fim, para validar a utilização do sistema como biorreator, foram realizados cultivos com Streptomyces clavuligerus visando à produção de ácido clavulânico, um potente inibidor de β-lactamases, enzimas produzidas por microrganismos patogênicos que clivam o anel dos antibióticos β-lactâmicos. Foram realizados quatro cultivos, dois em biorreator airlift e dois em biorreator convencional (Bioflo III) em duas diferentes condições de transferência de oxigênio (kLa) e os resultados foram comparados em termos de produção do ácido clavulânico. As concentrações máximas de ácido clavulânico obtidas nos cultivos em biorreator airlift foram superiores àquelas obtidas em biorreator tipo tanque agitado e aerado, com menores índices de consistência (K), mostrando maior cisalhamento nos biorreatores airlift nas mesmas condições de transferência de oxigênio. Em termos globais, os resultados obtidos sugerem esse biorreator como o mais adequado para este tipo de cultivo, justificado pelas adequadas transferências de calor e massa aliadas ao menor consumo de energia.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1771.pdf: 1457129 bytes, checksum: 013319207cf51a783696430206a0ceed (MD5) Previous issue date: 2008-03-26 / Universidade Federal de Sao Carlos / The clavulanic acid (CA) is a powerful inhibitor of β-lactamases, enzymes that clives the β- lactam ring of penicillins and cephalosporins, inactivating these compounds. CA is traditionally produced by Streptomyces clavuligerus in batch and fed-batch cultivations. Considering that the products of the catabolism of easily assimilable carbon source repress the biosynthesis of secondary metabolites, including CA, its production in fed-batch mode is preferable because the control of nutrient level can be performed. In the present work the influence of glycerol and ornithine feeding on the clavulanic acid (CA) production by S. clavuligerus in batch and fed-batch cultivations was studied. Batch and fed-batch cultivations were performed at 800 rpm, 0.5 vvm and pH at 6.8. In batch experiments under different concentrations of ornithine, the maximum concentration of CA was within of a closed range between 0.46 and 0.56 g.L-1. Nevertheless, the maximum value of volumetric productivity in CA (Ppmax=13.7 mg.L-1.h-1) was obtained in the experiment with ornithine at concentration of 0.66 g.L-1, a value that is 40% higher than the Ppmax obtained in run control without ornithine. In fed-batch experiments in 5 L bioreactor, with different ornithine feeding conditions, the maximum concentration of CA varied within the limited range of 1.254 and 1.405 g.L-1. Therefore, under these experimental conditions, it can be concluded that the presence of ornithine increases the Ppmax in CA but not its maximum concentration, contradicting literature. The kinetic model considering non-associated production with CA degradation was fitted to the experimental results of the batch and fed-batch cultivations. The experimental results showed that the rate of production of CA and glycerol consumption, were directly related, condition not predicted by model, besides, its negative effect on the AC production after the feeding indicate a possible inhibition/repression effect of glycerol. With the model, it was possible to simulate conditions that the cultivations should be performed with the intention of obtaining larger production of AC. With respect to the influence of glycerol in fed-batch experiments, in the presence of ornithine at the concentration of 3.7 g.L−1 in feeding medium, the maximum CA concentration of 1.506 g.L-1 was obtained in the run BA7 showing a positive effect of the combination ornithine/glycerol in the biosynthesis of CA. In fed-batch experiments in 10-L bioreactor, with different ornithine feeding conditions, the maximum concentrations of CA were near of 1.6 g.L-1, validating the results obtained in 5-L bioreactor. / O ácido clavulânico (AC) é um potente inibidor de enzimas β-lactamases que clivam o anel β- lactâmico de antibióticos como penicilinas e cefalosporinas, tornando esses compostos inativos. O AC é tradicionalmente produzido por Streptomyces clavuligerus em cultivos operados em batelada (B) e em batelada alimentada (BA). Pelo fato dos produtos do catabolismo de fontes de carbono facilmente assimiláveis acabarem por reprimir as enzimas responsáveis pela biossíntese de metabólitos secundários, entre os quais se inclui o AC, a produção em BA é preferível, uma vez que torna possível controlar os níveis de nutrientes no caldo. No presente trabalho foi estudado a influência da alimentação de glicerol e ornitina na produção de ácido clavulânico (AC) por S. clavuligerus em cultivos em batelada e batelada alimentada operados a 800 rpm, 0,5 vvm e pH 6,8. Nos experimentos em batelada com diferentes concentrações de ornitina, as concentrações máximas de AC obtidas variaram na estreita faixa entre 0,46 e 0,56 g.L-1. Contudo, o valor máximo da produtividade volumétrica em AC (Ppmax=13,7 mg.L-1.h-1) obtida no experimento com concentração de ornitina de 0,66 g.L-1, foi 40% superior que o valor de Ppmax obtido no cultivo padrão sem adição de ornitina. Nos experimentos em batelada alimentada operados em biorreator de 5L, com diferentes concentrações de ornitina na alimentação, a concentração de AC variou entre 1,254 e 1,405 g.L-1. Portanto, sob as condições experimentais utilizadas, pode-se concluir que a presença de ornitina proporciona aumentos na Ppmax em CA, mas não sua produção máxima, contrariando trabalhos publicados recentemente na literatura. Um modelo cinético para produto não associado ao crescimento considerando degradação do AC foi ajustado aos resultados experimentais dos cultivos em batelada e batelada alimentada, a partir do qual foi possível simular condições que se deveria conduzir os cultivos em batelada alimentada com o intuito de se obter maior produção de AC. Com respeito à influência do glicerol na presença de ornitina no meio de alimentação numa concentração de 3,7 g.L−1, a concentração máxima de AC de 1,506 g.L-1 foi obtida no cultivo BA7 mostrando o efeito positivo da combinação ornitina/glicerol na biossíntese de AC. Nos experimentos em BA em biorreator de 10 L, com diferentes alimentações de ornitina, as produções máximas de AC foram próximas, em torno de 1,6 g.L-1, validando os resultados obtidos em escala de 5 L. Como principal conclusão, a presença de ornitina aumentou a produtividade volumétrica máxima em AC (Ppmax), mas não sua produção máxima, contrariando resultados anteriores publicados em literatura.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2572.pdf: 799090 bytes, checksum: 4abf7acc4d34d2e0c1659207352d35aa (MD5) Previous issue date: 2009-08-04 / Universidade Federal de Sao Carlos / Clavulanic acid (CA) is a β-lactam antibiotic produced industrially by submerged cultures of the filamentous bacterium Streptomyces clavuligerus. Due to its importance, several studies on the purification of clavulanic acid have been conducted at the Department of Chemical Engineering of the Federal University of São Carlos DEQ-UFSCar. As a natural sequence of these works, a need has been identified for greater knowledge about the CA adsorption process by mathematically modeling the incorporation of the phenomenon of CA degradation in the sites of resin through a first order reaction. Because amino acids stand out among the principal molecules that are found in fermented broth, it has become imperative for the development of the process to evaluate purification in terms of the amino acids present during the purification process. Some of these amino acids, e.g., tyrosines, present physicochemical properties similar to those of clavulanic acid. The process of batch absorption can be simulated by a mathematical model, providing kinetic and transport parameters involved in absorption. A mathematical model of the clavulanic acid purification process in a fixed-bed absorption column was developed to determine the rupture curve. The modeling allowed for the determination of several important process parameters, such as transport parameters and the intrinsic kinetic constants of absorption. A sensitivity analysis demonstrated that the mass transfer coefficient strongly influences the results of the model. The simulation of the process led to the conclusion that the process is limited both by the degradation stage during absorption and by the mass transfer, indicating that both factors must be taken into account in the analysis of this type of process in a fixed-bed column. It was also found that the degradation of CA in the resin sites is a factor that does not allow the rupture curve to reach the value of C/Co equal to 1, which explains the low yield of the CA process during absorption. This work also aimed to apply the sequencing method to solve the partial differential equations that represent the mathematical model which describes the adsorption of CA in Amberlite IRA-400 resin and to compare it with the finite difference method which is more commonly employed. The application of the proposed methodology in the clavulanic acid purification process in a packed column showed a good performance, with a rupture curve very similar to that obtained by the finite difference method, thus demonstrating the efficiency of the proposed method. / O ácido clavulânico (AC) é um antibiótico beta-lactâmico produzido industrialmente por culturas submersas da bactéria filamentosa Streptomyces clavuligerus. Devido a esta importância, alguns trabalhos sobre purificação do ácido clavulânico vêm sendo desenvolvidos no DEQ-UFSCar. Como seqüência natural desses trabalhos, surgiu a necessidade de um conhecimento maior do processo de adsorção do AC por meio da modelagem matemática a incorporação do fenômeno de degradação do AC nos sítios da resina, através de uma reação de primeira ordem. Como dentre as principais moléculas que se encontram no caldo fermentado destacam-se os aminoácidos, tornou-se imprescindível para o desenvolvimento do processo avaliar a purificação em termos dos aminoácidos presentes durante o processo de purificação. Alguns destes aminoácidos, como por exemplo, as tirosinas apresentam propriedades físico-químicas próximas à do ácido clavulânico. O processo de adsorção em batelada pode ser simulado através de um modelo matemático, obtendo-se parâmetros cinéticos e de transporte envolvidos na adsorção. Uma modelagem matemática do processo de purificação do ácido clavulânico em coluna de leito fixo foi desenvolvida para obter a curva de ruptura. A modelagem permitiu a determinação de vários parâmetros importantes do processo tais como parâmetros de transporte e as constantes cinéticas intrínsecas de adsorção. Análise de sensibilidade demonstrou que a coeficiente de transferência de massa exerce forte influência nos resultados do modelo. Pela simulação do processo foi possível concluir que o processo é limitado tanto pela etapa de degradação durante a adsorção quanto pela transferência de massa, indicando que ambos devem ser levados em conta na análise do processo deste tipo de processo em coluna de leito fixo. E, também, verificou-se a degradação do AC nos sítios da resina é um fator que não permite que a curva de ruptura não atinja o valor de C/Co igual a 1 o que explica o baixo rendimento do processo do AC durante o processo de adsorção. Este trabalho teve também como finalidade aplicar o método da seqüência na resolução das equações diferenciais parciais que representam o modelo matemático que descreve a adsorção de AC na resina Amberlite IRA- 400 e compará-lo com o método de diferenças finitas que é mais comumente utilizado. A aplicação da metodologia proposta ao processo de purificação do ácido clavulânico em coluna recheada mostrou seu bom desempenho, cuja curva de ruptura é bem próxima da curva de ruptura obtida pelo método de diferenças finitas, mostrando, assim, a eficiência da metodologia proposta.