Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2710.pdf: 4294730 bytes, checksum: d0fe5cecb9df30a9763959023ef77038 (MD5) Previous issue date: 2009-09-01 / Universidade Federal de Sao Carlos / The cephamycin C is a natural cephalosporin produced by Streptomyces clavuligerus, of great importance in the pharmaceutical industry; it is a β-lactam antibiotic that acts as an inhibitor of the cellular wall synthesis. Besides some activity against Gram-negative bacteria, the cephamycin C is resistant to the action of β-lactamase enzymes responsible for the resistance to penicillin. The information available in the literature, on the stages of the industrial production process of cephamycin C is scarcely found, studying the production process and the antibiotic separation is essential to provide technology to the production section. The present study aimed to develop alternative protocols to isolate and purify composites produced by Streptomyces clavuligerus DSM 738, such as the cephamycin C and penicillin, which present antibacterial activity. The sequence of purification stages proposed in this work consisted of: 1) Microfiltration of the broth for the separating cells and insoluble solids; 2) Ultrafiltration for the separation of high molecular weight sub products, such as proteins and enzymes; 3) Use of adsorption process with non ionic resin for the broth clarification; and 4) Finally, the hipotese this work, the adsorption process by ionic exchange, for the separation of composites with antibacterial activity, such as cephamycin C and Penicillin N. On the other hand, cephamycin C is not available in the market, being restricted to the industries that possess the production technology. The biological method of choice for the bacteriological activity test was the Escherichia coli ESS bacteria against all β-lactams. RMN-1H analysis showed that the use of the microfiltration and ultrafiltration are essential as first purification stages. The second purification stage with non ionic resin (Amberlite XAD-4) showed to be efficient on retaining pigments, finally, with this clarified broth, it was possible to separate two major and well defined fractions with antibacterial activity, by the use of an anion exchange resin (QXL of Amershan), utilizing NaCl and CH3COONa as mobile phase. Analysis by RMN-1H showed that the first fraction can represent a cephalosporin molecule, such as cephamycin C, among others compounds. / A cefamicina C é uma cefalosporina natural produzida por Streptomyces clavuligerus de grande importância na indústria farmacêutica, esta é um antibiótico beta-lactâmico que atua como um inibidor da síntese da parede celular. Além de possuir atividade contra bactérias Gram-negativas, a cefamicina C é resistente à ação de enzimas beta-lactamases responsáveis pela resistência à ação das penicilinas. Tendo em vista as restritas informações na literatura sobre as etapas do processo industrial de produção da cefamicina C, torna-se indispensável o estudo dos processos de produção e separação deste antibiótico para que seja possível disponibilizar sua tecnologia ao setor produtivo. O presente trabalho buscou desenvolver protocolos alternativos para isolar e purificar compostos que apresentam atividade antibacteriana produzidos por Streptomyces clavuligerus DSM 738 como a cefamicina C e penicilinas. A seqüência de etapas de purificação utilizadas nesta dissertação constou de: 1) Microfiltração do caldo para a separação de células e sólidos insolúveis; 2) Ultrafiltração para a separação de subprodutos de alto peso molecular, como proteínas e enzimas; 3) Utilização de processo de adsorção com resina não iônica para clarificação do caldo e finalmente a hipótese de trabalho desta dissertação foi de aplicar um processo de adsorção por troca iônica para a separação de compostos com atividade antibacteriana, os quais podem ser a Cefamicina C e a Penicilina N. Cabe ressaltar que a cefamicina C não está disponível no mercado, sendo restrita às indústrias que detém a tecnologia de produção. Se utilizou o metodo biologico teste de atividade bacteriológica com a bactéria Escherichia coli ESS comtra beta-lactâmicos totais. Analises realizada por RMN mostram que a utilização da microfiltração e ultrafiltração são fundamentais como etapas iniciais de purificação. A segunda etapa de purificação com resina não iônica (Amberlite XAD-4) mostrou sua eficiência na retenção de pigmentos, e por fim, com este caldo clarificado, foi possível separar duas frações majoritárias e bem definidas com atividade antibacteriana, através da utilização da resina de troca aniônica (QXL da Amershan), utilizando como eluentes NaCl e CH3COONa. As análises realizadas por RMN- 1H mostraram que a primeira fração pode representar a molécula de uma cefalosporina, tal como é a cefamicina C, dentre outros compostos.

Orientador: Maria Lucia Gonsales da Costa Araujo / Banca: José Roberto Ernandes / Banca: Alvaro de Baptista Neto / Resumo: Muitos compostos beta-lactâmicos são sintetizados por bactérias do gênero Streptomyces. As cefalosporinas, entre elas a cefamicina C (CefC) são apenas alguns exemplos de antibióticos sintetizados por Streptomyces clavuligerus. Os antibióticos beta-lactâmicos são formados, em procariotos e eucariotos, a partir de três aminoácidos, o ácido L-alfaaminoadípico (AAA), a L-cisteína e a L-valina. Em procariotos, o AAA é formado por desaminação da L-lisina pela enzima lisina ε-aminotransferase (LAT). A L-lisina exerce um papel fundamental na síntese destes compostos atuando como indutora da LAT, a primeira enzima da rota biossintética de CefC. Desta forma, uma variação adequada na concentração de lisina no meio de produção deve proporcionar melhorias na produção da CefC. Além da lisina, as fontes de carbono e nitrogênio também exercem fundamental importância, uma vez que participam de vários mecanismos reguladores, tanto do metabolismo primário como do secundário, durante o processo fermentativo. O presente trabalho teve como objetivo investigar a influência da presença e concentração de fontes de carbono, de L-lisina e de compostos relacionados à rota biossintética de antibióticos beta-lactâmicos em S. clavuligerus ATCC 27064, com ênfase no aumento da produção de CefC. Foram realizadas fermentações variando-se a natureza e a concentração de determinados compostos no meio de produção (fontes de carbono, de nitrogênio, etc) e, também, as condições de suplementação de L-lisina e outros compostos ao longo do processo. Com relação à fonte de carbono e energia (substrato limitante), os resultados demonstraram que o amido propiciou a maior produção de cefalosporinas totais, enquanto o glicerol foi mais adequado ao crescimento celular. Os resultados permitiram obter um meio padrão adequado para a...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Many beta-lactamic compounds are synthesized by bacteria from the Streptomyces ssp. The cephalosporins and among then the cephamycin C (CefC) are some examples of antibiotics synthesized by Streptomyces clavuligerus. The beta-lactam antibiotics are formed, both in eukaryote and prokaryote, by three amino acids, the L-alfa-aminoadipic acid (AAA), the L-cysteine and the L-valine. In prokaryote the AAA is formed by desamination of the Llysine by the lysine ε-aminotransferase (LAT) enzyme. The L-lysine plays a fundamental roll in the synthesis of these compounds acting as an inductor of the LAT, the first enzyme in the biosynthetic route of the CefC. Therefore, an adjusted variation on the lysine concentration in the production medium should provide improvement in the production of CefC. Besides lysine, the carbon and nitrogen sources also exert a crucial importance, once they are part of many regulating mechanisms from primary and secondary metabolism during fermentation. The objective in this paper is to investigate the influence of the presence and concentration of sources of carbon, L-lysine and composites related to the beta-lactam antibiotics biosynthetic route in S. clavuligerus ATCC 27064, with emphasis in the increase of the CefC production. Fermentation had been carried through varying the nature and concentration of certain composites in the production environment (sources of carbon, nitrogen, etc) and also the lysine and other compounds supplementation conditions along with the process. In relation to the sources of carbon and energy (limiting substrate), the results show that starch provides a higher production of total cephalosporins while glycerol has been more appropriate to cellular growth. The results allowed obtaining an appropriate standard medium to develop cephalosporins, ...(Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Maria Lucia Gonsales da Costa Araujo / Banca: Alberto Colli Badino Junior / Banca: José Gregório Cabrera Gomez / Resumo: β-lactâmicos são compostos de elevada importância clínica. Streptomyces clavuligerus produz vários destes compostos, como penicilina N (PenN), deacetilcefalosporina C, deacetoxicefalosporina C, cefamicina C (CefC) e ácido clavulânico (AC). Particularmente, CefC é um antibiótico de grande interesse por suas características de resistência a β-lactamases. A biossíntese deste antibiótico envolve uma série complexa de reações enzimáticas, iniciando-se com a etapa limitante de conversão de L-lisina em ácido L-α-aminoadípico (AAA) que, então, condensa-se com cisteína e valina para formar L-α-aminoadipil-L-cisteinil-D-valina (ACV), o precursor dos antibióticos β-lactâmicos. A formulação de meios utilizando-se estratégias racionais tem sido de fundamental importância para incrementar a produção de antibióticos β - lactâmicos em S. clavuligerus. No presente trabalho, visando contornar a etapa de conversão de L-lisina, investigou-se o efeito da adição de AAA e/ou L-lisina no processo de produção de CefC por S. clavuligerus ATCC 27064 em meio de produção complexo solúvel contendo amido e farinha de semente de algodão (ProfloTM) como principais fontes de C e energia e de N, respectivamente. Inicialmente, foram realizadas fermentações adicionando-se ao meio um ou outro aminoácido. Os resultados destes experimentos subsidiaram, então, a seleção de faixas de concentração dos aminoácidos, através de métodos de planejamento experimental, para investigar o efeito combinado destes compostos no processo. Os dados obtidos foram avaliados estatisticamente por meio de metodologia de superfície de resposta, relacionando-se concentração inicial e consumo de AAA e L-lisina com a produção de CefC. Nos experimentos com os meios contendo somente L-lisina ou AAA, como também naqueles estabelecidos através de metodologia de planejamento experimental... (resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: β-lactams are compounds of high clinical importance. Streptomyces clavuligerus produces various of these compounds, such as penicillin N (PenN), deacetiylcephalosporin C, deacetoxycephalosporin C, cephamycin C (CefC), and clavulanic acid (AC). Particularly, CefC is an antibiotic of great interest for its characteristics of β-lactamases resistance. The biosynthesis pathway of CefC involves a complex series of enzymatic reactions, starting with the rate-limiting step of the lysine conversion to α-aminoadipic acid (AAA), followed of this compound condensation with cysteine and valine to form L-α-aminoadipyl-L-cysteinyl-D-valine (ACV), the precursor of β-lactam antibiotics. In this work, the effect of the addition of AAA and / or lysine on CefC production by S. clavuligerus ATCC 27064 was investigated. It was used a complex medium containing soluble starch and cottonseed flour (ProfloTM) as main sources of C and energy, and N, respectively. Initially, fermentations were carried out by adding to the medium one or other amino acid. The results of these experiments were used to select the concentration ranges of amino acids by using methods of experimental design. A three-level full-factorial design was applied to investigate the combined effects of lysine and AAA concentrations on CefC production. Response surface methodology was used to determine statistically the optimum amino acids concentration values in order to obtain the maximum concentration of antibiotic. Positive effects of these amino acids on the production of antibiotics were observed in the experiments using media containing lysine or AAA, as well in the designed experiments. The effect of adding phosphate ions in the production medium was investigated too. It was found that there was a maximum production with the addition of 15 mM, within the range studied (0 to 25 mM phosphate). To confirm the results, a fermentation run was... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O ácido clavulânico é um potente inibidor de β-lactamases utilizado como terapêutico em associação à amoxicilina. O processo industrial de obtenção envolve o cultivo bacteriano em processo descontínuo, enquanto que a sua purificação é realizada, principalmente, por processos de extração líquido-líquido com solventes orgânicos e etapas cromatográficas. Assim, métodos alternativos como a purificação empregando sistemas micelares de duas fases aquosas (SMDFA), os quais oferecem um ambiente hidrofóbico e hidrofílico que possibilita seletividade na partição de biomoléculas de acordo com sua hidrofobicidade, são de grande interesse. Neste trabalho estudou-se a viabilidade da utilização de sistema micelar misto (não-iônico/aniônico) de duas fases aquosas formados pelos tensoativos não-iônico Triton X-114 e aniônico AOT na extração do ácido clavulânico proveniente de cultivo submerso de Streptomyces clavuligerus em processo descontínuo. A estabilidade do ácido clavulânico em relação ao pH, sais e suas concentrações, temperatura e aos tensoativos foi investigada visando limitar as regiões a serem estudadas nas extrações. Determinou-se ainda o ponto névoa dos sistemas Triton X-114/Tampão e Triton X-114/AOT/Tampão em diferentes condições, bem como, estudos de migração da biomolécula para as fases e do tempo necessário para o equilíbrio do sistema. A partir destas investigações iniciais, foram definidos os níveis das variáveis: concentração de AOT (0,50, 0,75 e 1,00 mM), Triton X-114 (1, 3 e 5% m/m), NaCl (0, 0,05 e 0,10 M) e temperatura (24, 26 e 28°C), cujas influências sobre o coeficiente de partição (KAC) e recuperação da biomolécula na fase diluída (nAC) foram investigadas através de um planejamento fatorial. A análise estatística e o modelo matemático obtido a partir dos resultados para KAC revelou ser possível obterem-se KAC≈ 1,65 e nAC≈ 71,58%. No entanto, a análise estatística empregando nAC como resposta apontou condições experimentais desprovidas de significado físico-químico. Em experimentos seriados realizados com Triton X-114 3% m/m, Tampão Mcllavine pH 6,5 e adição gradual de AOT, um aumento da concentração deste tensoativo levou a maiores KAC e Balanço de massa (BMAC)≈ 85%. Desta forma é possível concluir que o sistema micelar misto de duas fases aquosas proporciona baixa perda da biomolécula e partição para a fase diluída, que é uma vantagem devido a menores problemas em uma etapa subsequente de purificação. / Clavulanic acid is a potent inhibitor of β-lactamases that is used as a therapeutic in conjunction with amoxicillin. Its industrial process of production involves bacterial growing in a batch process, while its purification is carried out mainly by process of liquid-liquid extraction with organic solvents and chromatographic steps. Thus, alternative methods like the purification employing two-phase aqueous micellar systems, which offer both hydrophobic and hydrophilic environments to solute species and allow selectivity in partitioning depending on the hydrophobicity of biomolecules, are of great concern. This work studied the feasibility of using two-phase aqueous mixed (nonionic/anionic) micellar systems formed by nonionic surfactant Triton X-114 and anionic surfactant AOT to extract clavulanic acid from broths fermented by Streptomyces clavuligerus in batch process. The stability of clavulanic acid at different values of pH, salts and their concentration, temperature and in the presence of different surfactants was investigated so as to limit the areas to be submitted to further studies. The cloud-point of the systems Triton X-114/Buffer and Triton X-114/AOT/Buffer was also determined under different conditions, and studies were performed on partitioning the biomolecule between the phases and the time needed to balance of the system. From these initial investigations the following levels of the variables were defined: concentration of AOT (0.50, 0.75, and 1.00 mM), Triton X-114 (1, 3 and 5% w/w), NaCl (0, 0.05 and 0.10 M) and temperature (24, 26 and 28°C), whose influences on the partition coefficient (KCA) and yield in the top phase (nCA) were investigated using factorial design. Statistical analysis and the mathematical model derived from the results allowed obtaining KCA≈ 1.65 e nCA≈ 71.58%. However, the statistical analysis using the response nCA indicated experimental conditions devoid of any physico-chemical meaning. In serial experiments performed with Triton X-114 3% w/w, Mcllvaine buffer at 6.5 pH and gradual addition of AOT, an increase in the concentration of anionic surfactant led to higher KCA and mass balance (BMCA≈ 85%). Thus, is possible conclude that the two-phase aqueous mixed micellar system provides low loss and partition to dilute phase, which is an advantage because it implies less problems in a subsequent step of purification.

O ácido clavulânico é um potente inibidor de β-lactamases utilizado como terapêutico em associação à amoxicilina. O processo industrial de obtenção envolve o cultivo bacteriano em processo descontínuo, enquanto que a sua purificação é realizada, principalmente, por processos de extração líquido-líquido com solventes orgânicos e etapas cromatográficas. Assim, métodos alternativos como a purificação empregando sistemas micelares de duas fases aquosas (SMDFA), os quais oferecem um ambiente hidrofóbico e hidrofílico que possibilita seletividade na partição de biomoléculas de acordo com sua hidrofobicidade, são de grande interesse. Neste trabalho estudou-se a viabilidade da utilização de sistema micelar misto (não-iônico/aniônico) de duas fases aquosas formados pelos tensoativos não-iônico Triton X-114 e aniônico AOT na extração do ácido clavulânico proveniente de cultivo submerso de Streptomyces clavuligerus em processo descontínuo. A estabilidade do ácido clavulânico em relação ao pH, sais e suas concentrações, temperatura e aos tensoativos foi investigada visando limitar as regiões a serem estudadas nas extrações. Determinou-se ainda o ponto névoa dos sistemas Triton X-114/Tampão e Triton X-114/AOT/Tampão em diferentes condições, bem como, estudos de migração da biomolécula para as fases e do tempo necessário para o equilíbrio do sistema. A partir destas investigações iniciais, foram definidos os níveis das variáveis: concentração de AOT (0,50, 0,75 e 1,00 mM), Triton X-114 (1, 3 e 5% m/m), NaCl (0, 0,05 e 0,10 M) e temperatura (24, 26 e 28°C), cujas influências sobre o coeficiente de partição (KAC) e recuperação da biomolécula na fase diluída (nAC) foram investigadas através de um planejamento fatorial. A análise estatística e o modelo matemático obtido a partir dos resultados para KAC revelou ser possível obterem-se KAC≈ 1,65 e nAC≈ 71,58%. No entanto, a análise estatística empregando nAC como resposta apontou condições experimentais desprovidas de significado físico-químico. Em experimentos seriados realizados com Triton X-114 3% m/m, Tampão Mcllavine pH 6,5 e adição gradual de AOT, um aumento da concentração deste tensoativo levou a maiores KAC e Balanço de massa (BMAC)≈ 85%. Desta forma é possível concluir que o sistema micelar misto de duas fases aquosas proporciona baixa perda da biomolécula e partição para a fase diluída, que é uma vantagem devido a menores problemas em uma etapa subsequente de purificação. / Clavulanic acid is a potent inhibitor of β-lactamases that is used as a therapeutic in conjunction with amoxicillin. Its industrial process of production involves bacterial growing in a batch process, while its purification is carried out mainly by process of liquid-liquid extraction with organic solvents and chromatographic steps. Thus, alternative methods like the purification employing two-phase aqueous micellar systems, which offer both hydrophobic and hydrophilic environments to solute species and allow selectivity in partitioning depending on the hydrophobicity of biomolecules, are of great concern. This work studied the feasibility of using two-phase aqueous mixed (nonionic/anionic) micellar systems formed by nonionic surfactant Triton X-114 and anionic surfactant AOT to extract clavulanic acid from broths fermented by Streptomyces clavuligerus in batch process. The stability of clavulanic acid at different values of pH, salts and their concentration, temperature and in the presence of different surfactants was investigated so as to limit the areas to be submitted to further studies. The cloud-point of the systems Triton X-114/Buffer and Triton X-114/AOT/Buffer was also determined under different conditions, and studies were performed on partitioning the biomolecule between the phases and the time needed to balance of the system. From these initial investigations the following levels of the variables were defined: concentration of AOT (0.50, 0.75, and 1.00 mM), Triton X-114 (1, 3 and 5% w/w), NaCl (0, 0.05 and 0.10 M) and temperature (24, 26 and 28°C), whose influences on the partition coefficient (KCA) and yield in the top phase (nCA) were investigated using factorial design. Statistical analysis and the mathematical model derived from the results allowed obtaining KCA≈ 1.65 e nCA≈ 71.58%. However, the statistical analysis using the response nCA indicated experimental conditions devoid of any physico-chemical meaning. In serial experiments performed with Triton X-114 3% w/w, Mcllvaine buffer at 6.5 pH and gradual addition of AOT, an increase in the concentration of anionic surfactant led to higher KCA and mass balance (BMCA≈ 85%). Thus, is possible conclude that the two-phase aqueous mixed micellar system provides low loss and partition to dilute phase, which is an advantage because it implies less problems in a subsequent step of purification.

Aspartokinase is the first enzyme of the aspartate family amino acids biosynthetic pathway. Cephamycin C is a &amp / #946 / -lactam antibiotic produced as a secondary metabolite via the enzymatic reactions in the lysine branch of this pathway in Streptomyces clavuligerus. The aspartokinase activity of S. clavuligerus is under concerted feedback inhibition by two of the end product amino acids, lysine plus threonine. It is also known that carbon flow through the lysine branch of the aspartate pathway is rate limiting step in the formation of cephamycin C. Therefore, genetic alterations in the regulatory regions of the aspartokinase enzyme are expected to lead to an increased cephamycin C production. The aim of this study was to obtain S. clavuligerus mutants that possess aspartokinase enzyme insensitive to feedback inhibition by lysine and threonine, identification of the mutation(s) accounting for the resistance being the ultimate goal. For this aim, chemical mutagenesis was employed to increase random mutation rate and a population of lysine anti-metabolite resistant S. clavuligerus mutants that can grow in the presence of S-(2-aminoethyl)-L-cysteine was obtained. The mutants were screened for their aspartokinase insensitivity via enzyme assays and one mutant exhibiting the highest level of deregulation was assessed for its cephamycin C production. The results revealed a 2-fold increase in specific production of the antibiotic. As a member of &amp / #946 / -lactam class antibiotics, cephamycin C has an importance in medicine. Therefore, the mutant strain obtained might be a candidate for industrial production of the compound.

Submitted by Izabel Franco (izabel-franco@ufscar.br) on 2016-10-26T17:28:34Z No. of bitstreams: 1 TeseJBCS.pdf: 2225419 bytes, checksum: d3ec7a73f461b658739175f8e171c762 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-11-08T18:27:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseJBCS.pdf: 2225419 bytes, checksum: d3ec7a73f461b658739175f8e171c762 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-11-08T18:27:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseJBCS.pdf: 2225419 bytes, checksum: d3ec7a73f461b658739175f8e171c762 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-08T18:27:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseJBCS.pdf: 2225419 bytes, checksum: d3ec7a73f461b658739175f8e171c762 (MD5) Previous issue date: 2016-08-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Cell-associated lipases have been considered biocatalysts economically advantageous because they are produced at low cost, avoiding further recovery or purification steps. Few studies regarding Streptomyces clavuligerus lipase have reported the production of extracellular enzyme, although at first this had been considered a cell-associated enzyme. In this context, the aim of this work was the production of the cell-associated lipase from Streptomyces clavuligerus (whole-cell lipase, Sc-WCL) by submerged fermentation, the biochemical characterization of the enzyme and its use in the synthesis of butyl butyrate, an aroma ester with industrial importance. The culture conditions on rotary shaker and the operational parameters for cultivation in bioreactor were evaluated in order to establish a protocol for Sc- WCL production. The conditions for S. clavuligerus cultivation in rotary shaker that resulted in maximal hydrolytic activity of Sc-WCL (3,000 U.L-1) were: baffled flask, free-glycerol production medium, pH 6.8 and 28 °C. The operational parameters in bench reactor that resulted in maximal volumetric productivity of Sc-WCL (54 U.L-1.h-1) were agitation of 400 rpm and aeration of 1 vvm. The maximal volumetric productivity in bioreactor operated under selected conditions (52.5 U.L-1.h-1) was reached after 24 h, while similar productivity in rotary shaker (54.8 U.L-1.h -1) was achieved only after 48 h fermentation. The catalytic potential of Sc-WCL in hydrolysis reactions was comparable to the commercial lipase preparations. Sc- WCL was more active at 60 °C and pH 10.7, and stable at 30-40 °C after 1 h incubation at pH 10. For butyl butyrate synthesis catalyzed by Sc-WCL, the reaction conditions that resulted in higher ester conversion (85%) were: 5 g of Sc-WCL/ L, molar ratio of fatty acid: alcohol 1:1 in heptane and 8 h reaction. The stability at alkaline pH and organic medium (leastwise in heptane and butanol), associated with the low cost, make Sc-WCL attractive in industrial applications, such as flavors synthesis, detergent formulations, hydrolysis of vegetable oils, among others. / Lipases associadas à célula têm se destacado como biocatalisadores economicamente vantajosos, pois são produzidas a baixo custo, dispensando etapas posteriores de recuperação ou purificação. Poucos estudos sobre lipase de Streptomyces clavuligerus relatam a produção da enzima extracelular, embora esta tenha sido, a princípio, considerada uma enzima associada à célula. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi a produção de lipase associada à célula de Streptomyces clavuligerus (lipase “whole-cell”, Sc-WCL) por fermentação submersa, a caracterização bioquímica da enzima e sua aplicação na síntese de butirato de butila, um éster de aroma com importância industrial. As condições de cultivo em shaker e os parâmetros operacionais para cultivo em biorreator foram avaliados com o intuito de estabelecer um protocolo para a produção de Sc-WCL. As condições de cultivo de S. clavuligerus em shaker que resultaram em maior atividade hidrolítica de Sc-WCL (3.000 U.L- 1) foram: frasco aletado, ausência de glicerol no meio de produção, pH 6,8 e 28 ºC. Os parâmetros operacionais em reator de bancada que resultaram em maior produtividade volumétrica de Sc-WCL (54 U.L-1.h-1) foram: agitação de 400 rpm e aeração de 1 vvm. A máxima produtividade volumétrica em biorreator operado nas condições selecionadas foi alcançada após 24 h de cultivo (52,5 U.L-1.h-1), enquanto que produtividade similar em shaker foi obtida somente após 48 h de cultivo (54,8 U.L-1.h-1). O potencial catalítico de Sc-WCL em reações de hidrólise foi comparável ao de preparações comerciais de lipase. Sc-WCL foi mais ativa a 60 ºC e pH 10,7, e mais estável na faixa de 30 a 40 ºC após 1 h de incubação a pH 10. Na síntese de butirato de butila catalisada pela Sc-WCL, as condições reacionais que resultaram em maior conversão (85%) foram: 5 g de Sc-WCL/ L, razão molar ácido graxo/álcool 1:1 em heptano e 8 h de reação. A estabilidade em pH alcalino e em meio orgânico (pelo menos em heptano e butanol), associada ao baixo custo, tornam a Sc-WCL atrativa em aplicações de interesse industrial, tais como, síntese de aromas, formulações de detergentes, hidrólise de óleos vegetais, dentre outras.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6133.pdf: 10637138 bytes, checksum: 64ada7d9f618d8563b1dbee6ecf9ca2f (MD5) Previous issue date: 2013-09-30 / Universidade Federal de Sao Carlos / Due to owing to the nature of culture involving aerobic filamentous microorganisms, conventional aerated stirred-tank bioreactors using the Rushton turbine impeller are widely employed in order to achieve good mixing and oxygen mass transfer. However, this impeller presents disadvantages such as high power consumption, and generates higher shear in the medium, which can cause irreversible morphological changes in microorganisms, damaging the culture performance. In literature, impellers called "Elephant Ear" (EE), presented in down-flow (down-pumping) (EEDP) and up-flow (up-pumping) (EEUP) configurations, are indicated as suitable for cultivation of shear sensitive cells. However, this characteristic has never been demonstrated quantitatively. In the present study, the oxygen transfer and hydrodynamics parameters were evaluated and compared in a conventional aerated stirredtank bioreactor equipped with impellers as the classical impeller Rushton turbine (RT) and with EE in EEDP and EEUP modes. Firstly, prediction equations were obtained for quantifying the average shear rate (Ýav) in the different systems, as function of the operating conditions (600≤N≤1000 rpm and 0.40≤Ýavar≤1.2 vvm) and rheological properties of the pseudoplastic fluids (K and n), based on a methodology that uses the volumetric oxygen transfer coefficient as characteristic parameter. The values of Ýav obtained from the correlations for the RT impeller were within a range of values estimated from correlations of the literature, showing that the methodology utilized is valid. Based on correlations of Ýav and on results of power consumption, the energy dissipation and Kolmogorov micro-scale (micro eddy sizes) could be estimated. For non-Newtonian fluids, the RT and EEUP impellers generated micro-eddies with smaller sizes in the range from 45.0-127.0 and 80.6-123.7 μm, respectively, showing that the impellers RT and EEUP are more shear than EEDP impeller. Using the prediction equations of Ýav the effect of shear conditions in cultures of Streptomyces clavuligerus were evaluated in conventional bioreactor equipped with RT, EEDP and EEUP impellers at 800 rpm, 0.50 vvm and 30C. Profiles of the volumetric oxygen transfer coefficient and shear rate were obtained during the cultivation. The morphological changes resulted from shear conditions imposed for the different impellers were analyzed using image analysis technique. The RT and EEDP impellers imposed the highest oxygen transfer and smaller shear to the broth, respectively. The flow pattern generated by EE impellers was crucial at the beginning of the cultivation, and is highly beneficial when EEUP impeller were used, since it presented a controlled shear throughout the cultivation. The best cultivation condition for the clavulanic acid production was obtained using the EEUP impeller, which resulted in a maximum concentration of 453 mg/L and a consistency index K= 2.5 Pa.s0.27. The results suggested that the isolated hyphae are directly related to the K of the broth and clavulanic acid production. According to the rapid fragmentation of clumps and emergence of isolated hyphae, it was concluded that the RT impeller presents shear rates higher than the EEs impellers, since the size of branched and non-branched hyphae were smaller and in greater quantities. This fact shows an advantage in the EEUP impeller use in shear sensitive microorganism cultures that requiring high levels of oxygen, without affecting the process performance. This advantage is associated with the flow pattern generated for the EEUP impeller. / Devido à natureza dos caldos de cultivo envolvendo microrganismos filamentosos aeróbios, de modo de obter adequada transferência de oxigênio e homogeneização do meio são tradicionalmente empregados biorreatores convencionais tipo tanque agitado e aerado utilizando o impelidor turbina de Rushton. Porém, esse impelidor apresenta desvantagens tais como o alto consumo de energia e elevado cisalhamento imposto ao meio, que pode provocar mudanças morfológicas irreversíveis aos microrganismos, prejudicando o rendimento dos cultivos. Na literatura especializada são indicados os impelidores denominados orelha de elefante ou Elephant Ear (EE), nas configurações de escoamento descendente (down-pumping) (EEDP) e de escoamento ascendente (up-pumping) (EEUP), como adequados para cultivos de células sensíveis ao cisalhamento. No entanto, esta caraterística nunca foi demostrada quantitativamente. No presente trabalho foram avaliados e comparados parâmetros de transferência de oxigênio e hidrodinâmicos em biorreator convencional tipo tanque agitado e aerado, equipado com impelidores como a clássica turbina de Rushton (TR) e com EE nas configurações EEDP e EEUP. Inicialmente foram obtidas equações de previsão para a quantificação da velocidade de cisalhamento média (Ýav Ýav) nos diferentes sistemas em função da frequência de agitação do impelidor e vazão especifica de ar e das propriedades reológicas de fluidos pseudoplásticos, com base em metodologia que utiliza o coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio como parâmetro característico. Valores obtidos de Ýav para o impelidor TR pelas correlações obtidas ficaram dentro de uma faixa de valores estimados por correlações de literatura validando a metodologia empregada. Com base nas correlações de Ýav e nos resultados de consumo de potência, pode-se quantificar a dissipação de energia e a microescala de Kolmogorov (tamanho de micro-turbilhões). Para fluidos não-Newtonianos, os impelidores TR e EEUP geraram os menores micro-turbilhões com tamanhos nas faixas de 45,0-127,0 μm e de 80,6-123,7 μm, respectivamente, mostrando serem esses impelidores mais cisalhantes que o impelidor EEDP. Também com base nas equações de previsão de Ýav, foram avaliadas as influências das condições de transferência de oxigênio e de cisalhamento em cultivos de Streptomyces clavuligerus visando a produção de ácido clavulânico em biorreator convencional com os impelidores TR, EEDP e EEUP a 800 rpm, 0,50 vvm e 30C. A partir das amostras coletadas ao longo dos cultivos, foram obtidos perfis de kLa e de Ýav. Foram acompanhadas as mudanças morfológicas decorrentes das condições de cisalhamento impostas pelos diferentes impelidores mediante a técnica de análise de imagens. Os impelidores TR e EEDP impuseram, respectivamente, maiores e menores transferências de oxigênio e condições de cisalhamento ao caldo. A eficiência do padrão de escoamento gerado pelos impelidores EEs foi crucial nas primeiras horas do cultivo, sendo altamente benéfico quando utilizado o impelidor EEUP, o qual apresenta um cisalhamento controlado ao longo do cultivo. A melhor condição de cultivo em função da produção de ácido clavulânico foi obtida utilizando o impelidor EEUP obtendo uma produção máxima de 453 mg/L e índice de consistência K=2,5 Pa.s0,27. Os resultados sugerem que a quantidade de hifas isoladas está diretamente relacionada com o K do caldo e a produção de ácido clavulânico. De acordo com a rápida fragmentação de clumps e surgimento de hifas isoladas, conclui-se que o impelidor TR cisalha mais que os impelidores EE, isto é, pelos tamanhos das hifas ramificadas e não ramificadas que foram geradas em maiores quantidades e em menores dimensões. Tal fato mostra uma vantagem no uso do impelidor EEUP em cultivos de microrganismos sensíveis ao cisalhamento, e que necessitam de níveis superiores de oxigenação, não prejudicando o desempenho do processo. Estes resultados sugerem essa vantagem está associada ao padrão de escoamento imposto pelo impelidor EEUP.