Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-09-18T19:15:37Z No. of bitstreams: 2 Carolina C. de Queiroz Brito Cunha - 2012.pdf: 4678972 bytes, checksum: aa3da530028732bcbc87f49ba9ea6725 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Rejected by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com), reason: Há problemas nos campos de palavras chaves e citação. Foi acrescentado da seguinte forma: Streptomyces - bagaço de cana. De acordo com as orientações seria: Streptomyces Bagaço de cana Foi acrescentado no campo de citação: Citação: Cunha, Carolina Cândida de Queiroz Brito - Caracterização de celulases e xilanases produzidas por Streptomyces sp. cultivado em resíduos lignocelulósicos - 2012 - 99 f. - Dissertação - Programa de Pós-graduação em Biologia (ICB) - Universidade Federal de Goiás - Goiânia, 2012. Deve-se usar a NBR6023, ex.: ALCÂNTARA, Guizelle Aparecida de. Caracterização farmacognostica e atividade antimicrobiana da folha e casca do caule da myrciarostratadc.(myrtaceae). 2012. 41 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2012. on 2014-09-19T13:12:18Z (GMT) / Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-09-22T18:04:37Z No. of bitstreams: 2 Carolina C. de Queiroz Brito Cunha - 2012.pdf: 4678972 bytes, checksum: aa3da530028732bcbc87f49ba9ea6725 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2014-09-22T19:09:30Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Carolina C. de Queiroz Brito Cunha - 2012.pdf: 4678972 bytes, checksum: aa3da530028732bcbc87f49ba9ea6725 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-09-22T19:09:30Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Carolina C. de Queiroz Brito Cunha - 2012.pdf: 4678972 bytes, checksum: aa3da530028732bcbc87f49ba9ea6725 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2012-10-27 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / An actinomycete strain, isolated from cane sugar bagasse (CSB), identified as Streptomyces sp was selected for its ability to produce cellulases. The production of cellulases was analyzed by submerged fermentation by cultivation on minimal medium (MM) containing CSB, wheat bran (WB) or carboxymethylcellulose (CMC) as carbon source, and yeast extract (YE) as nitrogen source. The results show that WB was the best inducer of CMCases (2.0 U.mL-1). Aiming to analyze the production of cellulases and xylanases kinetics, the isolate was inoculated in minimal medium containing 0.5% (w/v) WB and maintained for 12 days at 45°C under constant agitation of 180 rpm. The highest yield of Avicelase was observed after 264 h of cultivation (5.646 Uml-1), after 144 h for CMCase (3.872 Uml-1), after 144 h for FPase (0.0947 Uml-1) and after 288 h for Xylanase (92.40 Uml- 1). Culture supernatants with maximum activity of Avicelase, CMCase, Fpase and Xylanase were analyzed for optima pH and temperature of the respective enzymes. The highest enzyme activities were detected at pH 7.0 at 35°C for Avicelase, pH 4.5/75°C for CMCase, pH 5.5/45°Cfor FPase and pH 5.5/70°C for Xylanase. The enzymes retained more than 70% of the initial activity after 2 h incubation at 50°C. The profile proteins analyzed by zymogram demonstrated a set of secreted cellulases (37, 21 and 17 kDa) and xylanases (39, 21, 18 and 17 kDa) when grown on FT for 144 h. The saccharification assay with CSB as substrate showed that the enzyme complex was able to release 19% of glucose and 62.9% of xylose. / Uma linhagem de Actinomiceto, isolada do bagaço de cana-de-açúcar (BCA), identificada como Streptomyces sp foi selecionada pela sua capacidade de produzir celulases. A produção de celulases foi analisada por fermentação submersa (FS) pelo cultivo do isolado em meio mínimo (MM) contendo BCA, farelo de trigo (FT) ou carboximetilcelulose (CMC) como fonte de carbono, e extrato de levedura (EL) como fonte de nitrogênio. Os resultados demostraram que o FT foi o melhor indutor da produção de CMCases (2,0 U.mL-1). Com o objetivo de analisar a cinética de produção de celulases e xilanases pelo isolado, este foi inoculado em meio mínimo contendo 0,5% (w/v) FT e mantido por 12 dias a 45°C sob agitação constante de 180 rpm. A maior produção de Avicelase foi observada após 264 h de cultivo (5,646 UmL-1), de CMCase após 144 h (3,872 UmL-1), de FPase após 144 h (0,0947 UmL-1) e de Xilanase após 288 h (92,40 UmL-1). Os sobrenantes de cultura com atividade máxima de Avicelase, CMCase, FPase e Xilanase foram analisados quanto ao pH e temperatura ótimos das respectivas enzimas. Os resultados obtidos demonstraram que a maior atividade de Avicelase foi detectada em pH 7,0 a 35°C; CMCase apresentou melhor atividade em pH 4,5 a 75°C; FPase apresentou melhor atividade em pH 5,5 a 45°C e Xilanase apresentou melhor atividade em pH 5,5 a 70°C. Quanto à termoestabilidade, as enzimas presentes mantiveram mais de 70% da atividade inicial após 2 h de incubação a 50°C. O perfil de proteínas analisado por zimograma demonstrou que o isolado secretou um conjunto de celulases (37, 21 e 17 KDa) e xilanases (39, 21, 18 e 17 KDa) quando cultivado em FT por 144 h. No ensaio de sacarificação de BCA o complexo enzimático foi capaz de liberar 19% de glicose e 62,9% de xilose.

Streptomycetes são bactérias filamentosas Gram-positivas bastante conhecidas pela capacidade de produzir uma grande variedade de metabólitos secundários e substâncias biologicamente ativas. Essas atividades são controladas por alguns compostos de baixo peso molecular, denominados butirolactonas autoreguladoras. A maioria desses compostos com propriedades autoreguladoras possuem como característica estrutural comum a presença de um esqueleto g-butirolactônico 2,3-dissubstituído, mas mostram pequenas diferenças estruturais na cadeia lateral. Essas moléculas, cujas estruturas são mostradas abaixo, são classificadas nos tipos: virginiae butanolidas (VB) A-E, fatores de Gräfe, butanolida IM-2, o fator-I e o fator-A. Neste trabalho foram desenvolvidos estudos visando testar um novo caminho sintético para a obtenção de análogos do fator-A e, através da redução enantiosseletiva da carbonila da cadeia lateral dos compostos obtidos, seria possível sintetizar também as outras butirolactonas autoreguladoras. Inicialmente, o intermediário necessário para a síntese dos compostos desejados foi preparado através de uma reação de transesterificação, a qual foi amplamente estudada. Em seguida, uma reação de ciclização intramolecular deste intermediário daria origem aos análogos do fator-A de interesse. Entretanto, após várias tentativas empregando diferentes condições reacionais, não foi possível obter tais compostos. Com intuito de explicar e confirmar os resultados experimentais obtidos realizou-se cálculos teóricos que possibilitaram concluir este estudo de maneira apropriada. Outras duas abordagens sintéticas para a preparação de análogos do fator-A foram também desenvolvidas e testadas. No entanto, apresentaram dificuldades no decorrer da execução e, consequentemente, não forneceram resultados promissores. Então, um novo estudo de reações químicas, baseado em um método de síntese de butirolactonas através de uma reação intermolecular, foi desenvolvido. Esta nova estratégia sintética possibilitaria a obtenção de análogos do fator-A em apenas 3 etapas, constituindo-se de uma reação de abertura de um anel oxirano, seguida de uma reação de ozonólise e de uma redução seletiva de um grupo aldeído. Os diferentes substituintes presentes nos epóxidos testados apresentaram efeitos bastante distintos, os quais foram mais bem entendidos com o auxílio de cálculos teóricos. A obtenção, com 52% de rendimento, da butirolactona desejada, um produto intermediário contendo uma olefina terminal em uma das cadeias laterais, demonstra o sucesso desta nova estratégia sintética. Entretanto, com os reagentes utilizados até o momento, a reação de ozonólise que forneceria o aldeído desejado não apresentou resultados satisfatórios. Provavelmente, a dificuldade encontrada nesta etapa está relacionada com a volatilidade, a solubilidade em água e/ou a degradação do aldeído formado, tornando difícil o seu isolamento. No entanto, como esse tipo de reação já foi descrito com sucesso na literatura empregando-se K2OsO4, N-óxido de N-metilmorfolina (NMO) e NaIO4 como reagentes da reação de clivagem da dupla ligação olefínica, temos a convicção de que o nosso objetivo será alcançado em breve com as modificações das condições reacionais e/ou dos reagentes necessários para efetuar com sucesso essa última etapa. / Streptomycetes are Gram-positive filamentous bacteria well known for the ability to produce a wide variety of secondary metabolites and biologically active substances. These activities are controlled by low-molecular-weight compounds called butyrolactone autoregulators. The greater number of these compounds with autoregulators properties have as common characteristic a 2,3-disubstituted-g-butyrolactone sketeton, but show minor structural differences in the side chain. These molecules, whose structures are shown below, are classified following the types: virginiae butanolides (VB) A-E, Gräfe\'s factors, IM-2 butanolide, I-factor and A-factor. In this work, studies were developed with aim to test a new synthetic pathway to obtain A-factor analogous, which by enantioselective reduction of the carbonyl group of the side chain can be converted into others butyrolactone autoregulators. First of all, the necessary intermediary for the synthesis of the desired compounds was prepared by a transesterification reaction, which was widely studied. After that, an intramolecular cyclization reaction of this intermediary could to produce the A-factor analogous. However, after several attempts employing different reactional conditions, the desired compounds were not obtained. Theoretical calculation was realized as an attempt to explain the experimental results obtained and should possible to conclude this study adequately. Two other two synthetic approaches for the preparation A-factor analogous were developed and tested, but the results were not good enough. Thus, a new study based on a method of intermolecular synthesis of butyrolactones was developed. This new synthetic strategy would allow to obtain the A-factor in only 3 steps: a reaction of oxirane ring opening, followed by an ozonolysis reaction and a selective reduction of an aldehyde group. The different groups present in the epoxides tested showed different effects, which were better understood with the aid of theoretical calculation. The attainment of the desired butyrolactone with 52% yield, a product containing a terminal olefin, confirm the success of this new synthetic strategy. However, up to this moment, the ozonolysis reaction was not giving good results. The difficulty for this step is probably associated with the volatileness, the high solubility in water and/or the degradation of the aldehyde formed, making difficult its isolation. However, as this type of reaction is already reported in the literature employing the reagents K2OsO4, N-methylmorpholine N-oxide (NMO) and NaIO4 to cleave the terminal double, we have the conviction that our aim could be accomplished with modifications on the reactional conditions and/or of the reagents which are necessary to realize with success this final step.

Bactérias do gênero Streptomyces produzem diversos tipos de butirolactonas, cujos exemplos importantes são o cyclophostin, os compostos da família cyclipostin e as -butirolactonas autorreguladoras. O cyclophostin é um potente inibidor da enzima acetilcolinesterase, os compostos da família cyclipostin são inibidores de lipases, enquanto que as -butirolactonas autorreguladoras estimulam a produção de antibióticos em culturas de bactérias do gênero Streptomyces. Neste trabalho foram realizados estudos para a obtenção de derivados do cyclophostin e de derivados das -butirolactonas autorreguladoras. Para isso foram propostos dois planejamentos sintéticos mostrados nos esquemas 8 e 10 (Seção: III. Planejamento Sintético). Os estudos realizados de acordo com o planejamento sintético mostrado no esquema 8 tiveram como etapa chave uma reação de Barbier entre a butenolida 43, diversos aldeídos e um metal (zinco ou índio), em meio aquoso. Apesar dessa reação ser bem conhecida, em nenhum dos testes realizados foram obtidos os compostos de interesse, sendo que o principal produto obtido foi o composto 56, proveniente da redução da butenolida 43. Diante disso, foi proposta uma explicação para esses resultados com foco em possíveis mecanismos para a reação de Barbier, comparando com substratos similares a butenolida 43 que foram utilizados com sucesso na reação de Barbier. Os estudos realizados de acordo com o planejamento sintético mostrado no esquema 10 forneceram resultados satisfatórios. A reação entre o monóxido de butadieno e diferentes -cetoésteres possibilitou a obtenção de -butirolactonas 2,3-dissubstituídas na forma de um único diastereoisômero e -butirolactonas 2,4-dissubstituídas na forma de mistura de diastereoisômeros (mostradas na Tabela 7). Através das análises de NOEDiff-RMN, juntamente com dados da literatura e cálculos computacionais das constantes de acoplamento, foi possível determinar a configuração relativa dos grupos substituintes das -butirolactonas 2,3-dissubstituídas como sendo trans. Com três -butirolactonas 2,3-dissubstituídas foram realizadas reações de ozonólise, com clivagem redutiva do ozonídeo por boro-hidreto de sódio, fornecendo três compostos na forma de misturas de diastereoisômeros com estruturas análogas ao IM-2 e às virginiae butanolidas (mostrados na Tabela 8). Com a -butirolactona 54a foi realizada a formação do enol-fosfato 55a, utilizando dietil-clorofosfato como agente de fosforilação (reação mostrada no Esquema 23). Com este composto foram realizadas reações de ozonólise, utilizando boro-hidreto de sódio ou sulfeto de dimetila para a clivagem do ozonídeo, porém em nenhuma dessas tentativas foram obtidos resultados satisfatórios (reação mostrada no Esquema 24). Outras tentativas foram realizadas com intuito de obter derivados do cyclophostin utilizando outros materiais de partidas, porém todas as tentativas falharam, seja na etapa de ozonólise ou na etapa de ciclização para a formação do esqueleto de enol-fosfato cíclico presente no cyclophostin. Apesar dos resultados insatisfatórios descritos acima, alguns intermediários obtidos foram submetidos a um ensaio biológico em que foi monitorada a produção do antibiótico nigericina em culturas de actinobactérias do gênero Streptomyces. Nesse ensaio biológico foram obtidos resultados satisfatórios, sendo que alguns compostos estimularam a produção do antibiótico nigericina, outros inibiram e outros não mostraram efeitos significativos, indicando a existência de uma relação estrutura-atividade dos compostos testados. / Bacteria of the genus Streptomyces produce many kinds of butyrolactones; e.g., cyclophostin, compounds belonging to the cyclipostin family, and -butyrolactones autoregulators. Cyclophostin is a potent inhibitor of the enzyme acetylcholinesterase, the compounds of the cyclipostin family inhibit lipases, and -butyrolactones autoregulators stimulate antibiotics production in bacterial cultures of the genus Streptomyces. This work aimed to obtain cyclophostin derivatives and -butyrolactones autoregulators derivatives via two proposed synthesis designs as illustrated in schemes 8 and 10 (Section: III. Synthetic Planning). The key step in the design shown in scheme 8 consisted of a Barbier reaction between butenolide 43, several aldehydes, and a metal (zinc or indium), in aqueous medium. Although this reaction has long been known, the tests performed here did not afford any of the target compounds. The main product was compound 56, arising from the reduction of butenolide 43. An explanation for the results was proposed on the basis of possible mechanisms for the Barbier reaction and of comparison with similar compounds of butenolide 43, which have been successfully used in the Barbier reaction. Studies carried out according to the synthesis design presented in scheme 10 provided satisfactory results. The reaction between butadiene monoxide and various -ketoesters furnished 2,3-disubstituted--butyrolactones as a single diastereoisomer and 2,4-disubstituted--butyrolactones as a mixture of diastereoisomers (shown in Table 7). NOEDiff-NMR analysis together with literature data and computer calculations of coupling constants helped to determine the relative configuration of the 2,3-disubstituted--butyrolactones substituent groups as trans. Three 2,3-disubstituted--butyrolactones ozonolysis reactions were conducted by reductive cleavage of the ozonide with sodium borohydride, which afforded three compounds as diastereoisomers mixtures bearing structures analogous to those of IM-2 and virginiae butanolides (shown in Table 8). Reaction of -butyrolactone 54a with diethyl chlorophosphate as phosphorylating agent produced the enol-phosphate 55a (reaction shown in Scheme 23). Ozonolysis reactions of this compound using sodium borohydride or dimethyl sulfide to cleave the ozonide did not provide satisfactory results (reaction shown in Scheme 24). Other attempts to achieve cyclophostin derivatives using different starting materials failed during the ozonolysis step or the cyclization to form the cyclic enol-phosphate skeleton present in cyclophostin. Despite the poor results described above, some of the intermediates were submitted to a biological assay to monitor production of the antibiotic nigericin in Streptomyces actinomycetes cultures. Some of the tested compounds stimulated, others inhibited, and others did not affect nigericin production, indicating existence of a structure-activity relationship.

Orientador: Helia Harumi Sato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-13T21:55:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bagagli_MarcelaPavan_M.pdf: 2162265 bytes, checksum: 1def96dba6cfee03d3797c85fd357d3c (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A transglutaminase (TGase, EC 2.3.2.13) é uma enzima que catalisa a formação de ligações cruzadas entre resíduos de glutamina e aminas livres de proteínas formando agregados protéicos. Foi estudado o aumento da escala de produção da transglutaminase de Streptomyces sp. P20, de frascos Erlenmeyer agitados de 50 mL contendo 15 mL de meio de cultivo para fermentador de bancada de 6 L com volume útil de 3 L. Para a fermentação em frascos agitados foi utilizado o meio de cultivo otimizado por MACEDO et al. (2007) e para a fermentação do microrganismo em reator de bancada foi utilizado esse útimo meio de cultivo modificado, composto de extrato de 2,5% de farinha de soja, 2% de amido de batata, 1% de peptona, 0,1% de glicose, 04% de KH2PO4 e 0,2% de MgSO4, ajustado para pH 7,0. Foi estudado, através de delineamento fatorial, os efeitos da temperatura, agitação e aeração na fermentação da linhagem de Streptomyces sp. P20 no reator de bancada e a produção de transglutaminase. O aumento da escala de 200 vezes proporcionou uma elevação na atividade enzimática de 7,2 vezes, e o tempo para obtenção desta atividade foi reduzido de 120 horas para 42 horas de fermentação, utilizando dois estágios de temperatura. A atividade máxima obtida em reator de bancada foi de 2,05 U/mL de caldo fermentado. No estudo da produção da transglutaminase de Streptomyces sp. P20, por fermentação em meio semi-sólido, utilizando-se como substratos farinha de feijão branco e farinha de amendoim, foram obtidos, respectivamente, atividade de transglutaminase iguais a 0,88 U/g de substrato seco e 0,77 U/g de substrato seco. A caracterização bioquica da transglutaminase bruta de Streptomyces sp. P20 foi estudada, bem como a aplicação da enzima em carne bovina e proteína texturizada de soja. Os valores de temperatura ótima e pH ótimo desta enzima foram avaliados, sendo verificado que a temperatura ótima de atividade foi de 35°C e o pH 6,5, sendo encontrada uma segunda faixa de pH ótimo em 9,0, o que pode indicar a presença de isoenzimas. A MTGase mostrou-se estável na faixa de pH 6,0 ¿ 9,0, e at·a temperatura de 35°C em pH 6,0 por 30 minutos. O aminoácido L-cisteína aumentou a estabilidade térmica da MTGase de Streptomyces sp. P20. O efeito de íons metálicos, do EDTA, L-cisteína, L-glutationa e PEG 6000 na atividade da MTGase foram avaliados. Os íons Hg2+, Cu2+, Zn2+ e Mn2+, inativaram a enzima, sugerindo a presença de grupos tiol no seu sítio ativo. O íon Mg2+ aumentou a atividade da MTGase cerca de 100%. A aplicação da MTGase de Streptomyces sp. P20 em carne bovina e em prote?a texturizada de soja foi eficiente quando comparada a aplicação da enzima comercial Activa TG-BP aplicada nas mesmas condições / Abstract: Transglutaminase (TGase, EC 2.3.3.13) is an enzyme that catalyzes cross-linking between the glutamine and free amine residues of proteins leading to the formation of protein aggregates. The scale up of the production of transglutaminase by Streptomyces sp. P20 from shaken flasks to a bench fermenter was studied. Initially, the effect of temperature and agitation on the microorganism was studied in 50 mL conical flasks containing 15 mL of culture medium previously optimized by MACEDO et al. (2007). The production in 250 mL conical flasks containing 50 mL of the same culture medium was then studied. For fermentation in the bench reactor the same medium was used, modified, containing extract of 2.5% powdered soy, 2% potato starch, 1% peptone, 0.1% glucose, 0.4% KH2PO4 and 0.2% MgSO4, pH 7.0. A factorial design was used to study the effects of temperature, agitation and aeration on the fermentation of the strain Streptomyces sp. P20 in a 6L bench fermenter. The x200 scale up led to a x7.2 enhancement in enzymatic activity, and the fermentation time decreased from 120 h to 42 h using two temperature (from 34°C during the first 24 hours to 26°C for the remaining time) and agitation (from 350 rpm during the first 24 hours to 150 rpm for the remaining time) shifts. The maximum transglutaminase activity obtained was 2.05 U/mL. In the solid state fermentation study using semi-solid media containing white bean flour and peanut flour, transglutaminase activities of 0.88 U/mg dried substrate and 0.77 U/mg dried substrate, respectively, were obtained. The biochemical characterization of the crude transglutaminase obtained from Streptomyces sp. P20 and its application in beef and texturized soy protein were studied. The optimum temperature and pH values for MTGase activity were investigated, exhibiting optimum activity at 35°C and at both pH 6.5 and pH 9.0, probably due to the presence of an isoenzyme. The enzyme was stable in the pH range from 6.0 ¿ 9.0, and at temperatures of up to 35?C it was stable for 30 minutes at pH 6.0. The amino acid Lcysteine enhanced the thermal stability of the MTGase from Streptomyces sp. P20. The effects of metal ions, EDTA, L-cysteine, L-glutathione and PEG 6000 on the activity of MTGase were investigated. The ions Hg2+, Cu2+, Zn2+ and Mn2+ inhibited enzyme activity, suggesting the presence of a thiol group at the active site of the enzyme. The ion Mg2+ increased MTGase activity by 100%. The application of MTGase from Streptomyces sp. P20 in beef and texturized soy protein was efficient when compared to the application of commercial Activa TG-BP under the same conditions / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

Streptomycetes são bactérias filamentosas Gram-positivas bastante conhecidas pela capacidade de produzir uma grande variedade de metabólitos secundários e substâncias biologicamente ativas. Essas atividades são controladas por alguns compostos de baixo peso molecular, denominados butirolactonas autoreguladoras. A maioria desses compostos com propriedades autoreguladoras possuem como característica estrutural comum a presença de um esqueleto g-butirolactônico 2,3-dissubstituído, mas mostram pequenas diferenças estruturais na cadeia lateral. Essas moléculas, cujas estruturas são mostradas abaixo, são classificadas nos tipos: virginiae butanolidas (VB) A-E, fatores de Gräfe, butanolida IM-2, o fator-I e o fator-A. Neste trabalho foram desenvolvidos estudos visando testar um novo caminho sintético para a obtenção de análogos do fator-A e, através da redução enantiosseletiva da carbonila da cadeia lateral dos compostos obtidos, seria possível sintetizar também as outras butirolactonas autoreguladoras. Inicialmente, o intermediário necessário para a síntese dos compostos desejados foi preparado através de uma reação de transesterificação, a qual foi amplamente estudada. Em seguida, uma reação de ciclização intramolecular deste intermediário daria origem aos análogos do fator-A de interesse. Entretanto, após várias tentativas empregando diferentes condições reacionais, não foi possível obter tais compostos. Com intuito de explicar e confirmar os resultados experimentais obtidos realizou-se cálculos teóricos que possibilitaram concluir este estudo de maneira apropriada. Outras duas abordagens sintéticas para a preparação de análogos do fator-A foram também desenvolvidas e testadas. No entanto, apresentaram dificuldades no decorrer da execução e, consequentemente, não forneceram resultados promissores. Então, um novo estudo de reações químicas, baseado em um método de síntese de butirolactonas através de uma reação intermolecular, foi desenvolvido. Esta nova estratégia sintética possibilitaria a obtenção de análogos do fator-A em apenas 3 etapas, constituindo-se de uma reação de abertura de um anel oxirano, seguida de uma reação de ozonólise e de uma redução seletiva de um grupo aldeído. Os diferentes substituintes presentes nos epóxidos testados apresentaram efeitos bastante distintos, os quais foram mais bem entendidos com o auxílio de cálculos teóricos. A obtenção, com 52% de rendimento, da butirolactona desejada, um produto intermediário contendo uma olefina terminal em uma das cadeias laterais, demonstra o sucesso desta nova estratégia sintética. Entretanto, com os reagentes utilizados até o momento, a reação de ozonólise que forneceria o aldeído desejado não apresentou resultados satisfatórios. Provavelmente, a dificuldade encontrada nesta etapa está relacionada com a volatilidade, a solubilidade em água e/ou a degradação do aldeído formado, tornando difícil o seu isolamento. No entanto, como esse tipo de reação já foi descrito com sucesso na literatura empregando-se K2OsO4, N-óxido de N-metilmorfolina (NMO) e NaIO4 como reagentes da reação de clivagem da dupla ligação olefínica, temos a convicção de que o nosso objetivo será alcançado em breve com as modificações das condições reacionais e/ou dos reagentes necessários para efetuar com sucesso essa última etapa. / Streptomycetes are Gram-positive filamentous bacteria well known for the ability to produce a wide variety of secondary metabolites and biologically active substances. These activities are controlled by low-molecular-weight compounds called butyrolactone autoregulators. The greater number of these compounds with autoregulators properties have as common characteristic a 2,3-disubstituted-g-butyrolactone sketeton, but show minor structural differences in the side chain. These molecules, whose structures are shown below, are classified following the types: virginiae butanolides (VB) A-E, Gräfe\'s factors, IM-2 butanolide, I-factor and A-factor. In this work, studies were developed with aim to test a new synthetic pathway to obtain A-factor analogous, which by enantioselective reduction of the carbonyl group of the side chain can be converted into others butyrolactone autoregulators. First of all, the necessary intermediary for the synthesis of the desired compounds was prepared by a transesterification reaction, which was widely studied. After that, an intramolecular cyclization reaction of this intermediary could to produce the A-factor analogous. However, after several attempts employing different reactional conditions, the desired compounds were not obtained. Theoretical calculation was realized as an attempt to explain the experimental results obtained and should possible to conclude this study adequately. Two other two synthetic approaches for the preparation A-factor analogous were developed and tested, but the results were not good enough. Thus, a new study based on a method of intermolecular synthesis of butyrolactones was developed. This new synthetic strategy would allow to obtain the A-factor in only 3 steps: a reaction of oxirane ring opening, followed by an ozonolysis reaction and a selective reduction of an aldehyde group. The different groups present in the epoxides tested showed different effects, which were better understood with the aid of theoretical calculation. The attainment of the desired butyrolactone with 52% yield, a product containing a terminal olefin, confirm the success of this new synthetic strategy. However, up to this moment, the ozonolysis reaction was not giving good results. The difficulty for this step is probably associated with the volatileness, the high solubility in water and/or the degradation of the aldehyde formed, making difficult its isolation. However, as this type of reaction is already reported in the literature employing the reagents K2OsO4, N-methylmorpholine N-oxide (NMO) and NaIO4 to cleave the terminal double, we have the conviction that our aim could be accomplished with modifications on the reactional conditions and/or of the reagents which are necessary to realize with success this final step.

Bactérias do gênero Streptomyces produzem diversos tipos de butirolactonas, cujos exemplos importantes são o cyclophostin, os compostos da família cyclipostin e as -butirolactonas autorreguladoras. O cyclophostin é um potente inibidor da enzima acetilcolinesterase, os compostos da família cyclipostin são inibidores de lipases, enquanto que as -butirolactonas autorreguladoras estimulam a produção de antibióticos em culturas de bactérias do gênero Streptomyces. Neste trabalho foram realizados estudos para a obtenção de derivados do cyclophostin e de derivados das -butirolactonas autorreguladoras. Para isso foram propostos dois planejamentos sintéticos mostrados nos esquemas 8 e 10 (Seção: III. Planejamento Sintético). Os estudos realizados de acordo com o planejamento sintético mostrado no esquema 8 tiveram como etapa chave uma reação de Barbier entre a butenolida 43, diversos aldeídos e um metal (zinco ou índio), em meio aquoso. Apesar dessa reação ser bem conhecida, em nenhum dos testes realizados foram obtidos os compostos de interesse, sendo que o principal produto obtido foi o composto 56, proveniente da redução da butenolida 43. Diante disso, foi proposta uma explicação para esses resultados com foco em possíveis mecanismos para a reação de Barbier, comparando com substratos similares a butenolida 43 que foram utilizados com sucesso na reação de Barbier. Os estudos realizados de acordo com o planejamento sintético mostrado no esquema 10 forneceram resultados satisfatórios. A reação entre o monóxido de butadieno e diferentes -cetoésteres possibilitou a obtenção de -butirolactonas 2,3-dissubstituídas na forma de um único diastereoisômero e -butirolactonas 2,4-dissubstituídas na forma de mistura de diastereoisômeros (mostradas na Tabela 7). Através das análises de NOEDiff-RMN, juntamente com dados da literatura e cálculos computacionais das constantes de acoplamento, foi possível determinar a configuração relativa dos grupos substituintes das -butirolactonas 2,3-dissubstituídas como sendo trans. Com três -butirolactonas 2,3-dissubstituídas foram realizadas reações de ozonólise, com clivagem redutiva do ozonídeo por boro-hidreto de sódio, fornecendo três compostos na forma de misturas de diastereoisômeros com estruturas análogas ao IM-2 e às virginiae butanolidas (mostrados na Tabela 8). Com a -butirolactona 54a foi realizada a formação do enol-fosfato 55a, utilizando dietil-clorofosfato como agente de fosforilação (reação mostrada no Esquema 23). Com este composto foram realizadas reações de ozonólise, utilizando boro-hidreto de sódio ou sulfeto de dimetila para a clivagem do ozonídeo, porém em nenhuma dessas tentativas foram obtidos resultados satisfatórios (reação mostrada no Esquema 24). Outras tentativas foram realizadas com intuito de obter derivados do cyclophostin utilizando outros materiais de partidas, porém todas as tentativas falharam, seja na etapa de ozonólise ou na etapa de ciclização para a formação do esqueleto de enol-fosfato cíclico presente no cyclophostin. Apesar dos resultados insatisfatórios descritos acima, alguns intermediários obtidos foram submetidos a um ensaio biológico em que foi monitorada a produção do antibiótico nigericina em culturas de actinobactérias do gênero Streptomyces. Nesse ensaio biológico foram obtidos resultados satisfatórios, sendo que alguns compostos estimularam a produção do antibiótico nigericina, outros inibiram e outros não mostraram efeitos significativos, indicando a existência de uma relação estrutura-atividade dos compostos testados. / Bacteria of the genus Streptomyces produce many kinds of butyrolactones; e.g., cyclophostin, compounds belonging to the cyclipostin family, and -butyrolactones autoregulators. Cyclophostin is a potent inhibitor of the enzyme acetylcholinesterase, the compounds of the cyclipostin family inhibit lipases, and -butyrolactones autoregulators stimulate antibiotics production in bacterial cultures of the genus Streptomyces. This work aimed to obtain cyclophostin derivatives and -butyrolactones autoregulators derivatives via two proposed synthesis designs as illustrated in schemes 8 and 10 (Section: III. Synthetic Planning). The key step in the design shown in scheme 8 consisted of a Barbier reaction between butenolide 43, several aldehydes, and a metal (zinc or indium), in aqueous medium. Although this reaction has long been known, the tests performed here did not afford any of the target compounds. The main product was compound 56, arising from the reduction of butenolide 43. An explanation for the results was proposed on the basis of possible mechanisms for the Barbier reaction and of comparison with similar compounds of butenolide 43, which have been successfully used in the Barbier reaction. Studies carried out according to the synthesis design presented in scheme 10 provided satisfactory results. The reaction between butadiene monoxide and various -ketoesters furnished 2,3-disubstituted--butyrolactones as a single diastereoisomer and 2,4-disubstituted--butyrolactones as a mixture of diastereoisomers (shown in Table 7). NOEDiff-NMR analysis together with literature data and computer calculations of coupling constants helped to determine the relative configuration of the 2,3-disubstituted--butyrolactones substituent groups as trans. Three 2,3-disubstituted--butyrolactones ozonolysis reactions were conducted by reductive cleavage of the ozonide with sodium borohydride, which afforded three compounds as diastereoisomers mixtures bearing structures analogous to those of IM-2 and virginiae butanolides (shown in Table 8). Reaction of -butyrolactone 54a with diethyl chlorophosphate as phosphorylating agent produced the enol-phosphate 55a (reaction shown in Scheme 23). Ozonolysis reactions of this compound using sodium borohydride or dimethyl sulfide to cleave the ozonide did not provide satisfactory results (reaction shown in Scheme 24). Other attempts to achieve cyclophostin derivatives using different starting materials failed during the ozonolysis step or the cyclization to form the cyclic enol-phosphate skeleton present in cyclophostin. Despite the poor results described above, some of the intermediates were submitted to a biological assay to monitor production of the antibiotic nigericin in Streptomyces actinomycetes cultures. Some of the tested compounds stimulated, others inhibited, and others did not affect nigericin production, indicating existence of a structure-activity relationship.

Le sujet de thèse porte sur l’étude de l’accumulation de vésicules de TriAcylGlycérol (TAG) chez Streptomyces, une bactérie du sol filamenteuse utilisée dans l’industrie pour sa production d’antibiotiques. Le TAG est un précurseur direct du bio-diesel puisqu’il permet, suite à une transestérification, l’obtention de glycérol et de bio-diesel.L’objectif principal de la thèse est de regarder l’effet de la source de carbone présente dans le milieu nutritif sur la production de TAG par la bactérie lors d’études cinétiques afin de trouver des souches sur-productrices. Deux sources de carbone sont utilisés : Le glucose, source de carbone classique généralement utilisé en microbiologie, et le glycérol qui est un « déchet » de l’industrie. Afin de suivre le contenu lipidique, une première étude globale utilisant un spectrophotomètre infra-rouge (IR), nous a permis de suivre l’évolution de la production de TAG par la bactérie au sein de notre milieu de culture lors d’études cinétiques de 96h. Il a été montré, par exemple, que pour la souche sauvage S. lividans, la source de carbone introduite (glucose ou glycérol) n’a pas d’influence observable sur la production de TAG par la bactérie au cours de la cinétique. Cependant, la technique FTIR nous donne uniquement une information globale sur la production de TAG mais ne nous donne aucune indication sur l’évolution des vésicules à l’intérieur de la bactérie au cours du temps. C’est pourquoi une deuxième étude, plus locale, à l’aide d’un nanoIR, couplage entre un Microscope à Force Atomique (AFM) et un laser IR pulsé permet de localiser au sein de la bactérie les vésicules lipidiques. Cela permet d'observer la dynamique de production du TAG et d'obtenir des pistes sur le métabolisme de production par la bactérie. / Streptomyces is a genus of Gram+ filamentous soil bacteria well known for their ability to produce antibiotics and other molecules useful as therapeutic or phytosanitary agents in medicine or agriculture. Under specific growth conditions some strains can store an excess of carbon into TriAcylGlycerols (TAGs), a direct Bio-diesel precursor. Streptomyces is thus an interesting canditate to generate bio-oils by fermentation. In this study, our goal is to evaluate, at the subcellular scale, the size/shape and localization of storage lipid inclusions in different Streptomyces strains (such as Streptomyces lividans (TK24), Streptomyces coelicolor (M145)…).In a previous study, the global TAGs content of those strains was easily and precisely quantified using infrared (IR) spectroscopy and thin layer chromatography revealing among other things that S. coelicolor has a very low TAGs content whereas S. lividans has an high TAG content. This was possible since TAG molecules show a specific response in the mid-infrared (IR) region, quite distinct from that of the other cellular constituants.Triacylglycerols posses several absorption bands in IR. In particular we can easily distinguish the band of the C=O stretching of the esters at 1741 cm-1 from the amide I band (protein signature) of the bacterium.For the study of the local repartition of TAG inside the cells, a combination of atomic force microscopy and infrared spectroscopy was employed in order to create sub-cellular chemical maps that allow label-free identification of TAG inclusions in Streptomyces cytoplasm using their specific absorption properties at 1741 cm-1. AFM-IR is a user-friendly benchtop technique that enables infrared spectroscopy with a spatial resolution well below conventional optical diffraction limits. It acquires IR absorption imaging with lateral resolution down to 100 nm.This technique coupled with classical FTIR measurements constitutes a powerful tool to study TAG metabolism in Streptomyces and can be easily used to control the rate of lipid accumulation during the fermentation process. Hence, the AFM-IR technique is likely to provide new insights into the constitution of the fatty inclusions and the role of TAGs in the morphological and metabolic differentiation processes that characterize Streptomyces developmental cell cycle.

Salvage of pyrimidine nucleosides and bases by S. griseus and the regulation of aspartate transcarbamoylase (ATCase) were studied. The velocity-substrate curve for S. griseus ATCase was hyperbolic for both aspartate and carbamoylphosphate. The enzyme activity was diminished in the presence of ATP, CTP, or UTP. The synthesis of ATCase was repressed in cells grown in the presence of exogenous uracil. The specific activity of cells grown with uracil was 43 percent of that for cells grown in minimal medium only. Maximal ATCase and dihydroorotase activities were found in the same column fraction after size-exclusion chromatography, suggesting that both activities could reside in the same polypeptide. The pyrimidine salvage enzymes cytosine deaminase and uridine phosphorylase were identified in S. griseus using HPLC reversed-phase chromatography.

Aspartate transcarbamoylase (ATCase) of Streptomyces was characterized and its interaction with other pyrimidine enzymes explored.

Genetic and biochemical studies were conducted on S. toyocaensis NRRL 15009, a gram-positive spomlating filamentous bacterium, and producer of the glycopeptide antibiotic A47934. This compound is structurally similar to the clinically important antibiotic vancomycin, and the recent spread of vancomycin-resistant enterococci (VRE) in North American hospitals has driven the need for new glycopeptides with enhanced activities. Studies were aimed at developing an understanding of the mechanism of A47934 biosynthesis inS. toyocaensis NRRL 15009, as well as the mechanism of resistance employed by this organism. Two cosmid clones, containing a partial A47934 biosynthesis gene cluster on a total of65 kilobases of S. toyocaensis NRRL 15009 chromosomal DNA, were isolated for study. Preliminary sequencing indicates the presence of several genes predicted in glycopeptide assembly, such as peptide synthetases and glycosyltransfe~ases. Furthermore, using a oligonucleotide probe designed to identify D-alanine-D-alanine ligases, an 8.1 kilobase chromosomal fragment was isolated from S. toyocaensis NRRL 15009 and found to contain genes very similar to VRE vanH, vanA and vanX. Phylogenetic analysis of the predicted products of these genes showed them to be more similar to the VRE enzymes than any other in each enzyme class. These genes were also found in the vancomycin producer A. orienta/is C329.2 and several other glycopeptide antibiotic producing organisms. Not only does this imply that these organisms employ a mechanism of resistance similar to clinical VRE, it also suggests that these organisms may have been the source of the VRE genes. The enzymes VanHst and DdlN were studied in some detail and found to have biochemical properties similar to their corresponding VRE enzymes VanH and VanA, respectively. Given that the latter group of enzymes has physical properties that have impeded detailed analysis of enzyme mechanism, these new enzymes could find use as model systems in drug development programs. / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD)