Stuttgart, Univ., Diss., 2006.

Universiẗat, Diss., 2004--Düsseldorf.

Neisseria meningitidis is a commensal bacterium which sometimes causes serious disease in humans. Recent studies in numerous human pathogenic bacteria have shown that the stringent response contributes to bacterial virulence. Therefore, this study analyzed the regulation of the stringent response in meningococci and in particular of RelA as well as its contribution to ex vivo fitness in a strain- and condition- dependent manner by using the carriage strain α522 and the hyperinvasive strain MC58 in different in vitro and ex vivo conditions. Growth experiments revealed that both wild-type strains were almost indistinguishable in their ex vivo phenotypes. However, quantitative real time PCR (qRT-PCR) found differences in the gene expression of relA between both strains. Furthermore, in contrast to the MC58 RelA mutant strain α522 deficient in RelA was unable to survive in human whole blood, although both strains showed the same ex vivo phenotypes in saliva and cerebrospinal fluid. Moreover, strain α522 was depended on a short non-coding AT-rich repeat element (ATRrelA) in the promoter region of relA to survive in human blood. Furthermore, cell culture experiments with human epithelial cells revealed that in both strains the deletion of relA resulted in a significantly decreased invasion rate while not significantly affecting adhesion. In order to better understand the conditional lethality of the relA deletion, computational and experimental analyses were carried out to unravel differences in amino acid biosynthetic pathways between both strains. Whereas strain MC58 is able to synthesize all 20 amino acids, strain α522 has an auxotrophy for cysteine and glutamine. In addition, the in vitro growth experiments found that RelA is required for growth in the absence of external amino acids in both strains. Furthermore, the mutant strain MC58 harboring an ATRrelA in its relA promoter region showed improved growth in minimal medium supplemented with L-cysteine and/or L-glutamine compared to the wild-type strain. Contrary, in strain α522 no differences between the wild-type and the ATRrelA deletion mutant were observed. Together this indicates that ATRrelA interferes with the complex regulatory interplay between the stringent response pathway and L-cysteine as well as L-glutamine metabolism. It further suggests that meningococcal virulence is linked to relA in a strain- and condition- depended manner. In conclusion, this work highlighted the role of the stringent response and of non-coding regulatory elements for bacterial virulence and indicates that virulence might be related to the way how meningococci accomplish growth within the host environments. / Neisseria meningitidis ist ein kommensal lebendes, fakultativ pathogenes Bakterium, welches unter nicht vollständig verstandenen Umständen lebensbedrohliche Krankheitsbilder bei Menschen verursacht. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass die stringente Antwort einen Einfluss auf die bakterielle Virulenz haben kann. Aus diesem Grund untersucht diese Arbeit die Regulation der stringenten Antwort, insbesondere die Rolle von RelA, sowie den Einfluss der stringenten Antwort auf die Ex-vivo-Fitness der Meningokokken. Die Ergebnisse wurden für den Trägerstamm α522 und den hyperinvasiven Stamm MC58 erhoben und miteinander verglichen. Wachstumsexperimente zeigten, dass sich beide Wildtyp-Stämme in ihren Ex-vivo-Phänotypen nicht unterscheiden. Jedoch wurden mittels quantitativer Echtzeit-PCR (qRT-PCR) Unterschiede zwischen beiden Stämmen in der Genexpression von relA gefunden. Zudem war die α522 relA Mutante im Gegensatz zu der MC58 relA Mutante nicht in der Lage, in menschlichem Vollblut zu überleben. Allerdings zeigten in Saliva und Liquor beide Stämme den gleichen Phänotyp. Außerdem war der Trägerstamm auf eine kurze, nicht-codierende AT-reiche Region (ATRrelA) in der Promotorregion von relA angewiesen, um im menschlichen Blut überleben zu können. Darüber hinaus zeigten Zellkulturexperimente mit humanen Epithelzellen, dass die Deletion relA die Invasionsrate in beiden Stämmen signifikant verringerte, obwohl die Adhäsionsrate durch die Deletion unbeeinflusst blieb. Um besser verstehen zu können, weshalb die Deletion von relA unter bestimmten Bedingungen letal ist, wurden mit In-silico- und experimentellen Analysen nach Unterschieden in den Aminosäurebiosynthesewegen beider Stämme gesucht. Es zeigte sich, dass Stamm MC58 in der Lage ist alle 20 Aminosäuren zu synthetisieren, während Stamm α522 eine Auxotrophie für Cystein und Glutamin aufweist. Ferner zeigten die In-vitro-Wachstumsversuche, dass RelA bei Aminosäuremangel essentiell für beide Stämme ist. Darüber hinaus zeigte eine MC58 Mutante mit einer ATRrelA –Kopie in der relA Promotorregion ein im Vergleich zum Wildtyp-Stamm verbessertes Wachstum in mit L-Cystein und/oder L-Glutamin angereichertem Minimalmedium. Gegensätzlich dazu zeigte der Stamm α522 keine Unterschiede im Wachstum zwischen dem Wildtyp und einer ATRrelA Deletions-Mutante. Dies deutet darauf hin, dass ATRrelA an dem komplexen regulatorischen Zusammenspiel der stringenten Antwort und dem L-Cystein- beziehungsweise dem L-Glutamin-Metabolismus beteiligt ist. Es lässt sich vermuten, dass RelA zu der Virulenz von Meningokokken in einer stamm- und umgebungsspezifischen Weise beiträgt. Abschließend hebt diese Arbeit die Rolle von kleinen regulatorischen Elementen für die bakterielle Virulenz hervor und postuliert, dass die Virulenz der Meningokokken auf ihrer Fähigkeit basiert, sich der durch den Wirt gegebenen Umgebung anzupassen.

Universiẗat, Diss., 2005--Düsseldorf.

La réponse stringente est un processus mis en place lors d'une carence nutritionnelle qui permet l'arrêt coordonné de la croissance. Cette réponse essentielle à la survie des bactéries est très conservée. Elle se caractérise par la production et l'accumulation de guanosine tretra- et pentaphosphate (ppGpp). Le ppGpp, en se fixant sur l'ARN polymérase modifie ses propriétés cinétiques et affecte ainsi de manière globale la transcription de très nombreux gènes. Principalement, l'accumulation de ppGpp inhibe la biosynthèse des ARNs stables (ARNr et ARNt) et en conséquence inhibe la biogenèse des ribosomes. Chez Escherichia coli, le niveau de ppGpp est régulé par les deux enzymes RelA et SpoT. Lors d'une carence en acides aminés, RelA fixée au ribosome détecte le blocage de la machinerie traductionnelle causée par la fixation d'un ARNt déacylé au site A du ribosome, et synthétise du ppGpp. SpoT quant à elle serait capable de détecter et de synthétiser le ppGpp en réponse à d'autres carences nutritionnelles notamment en source de carbone, mais les mécanismes et les signaux détectés sont inconnus. Il a été proposé que la protéine CgtA serait impliquée dans le contrôle de la réponse stringente, en interagissant avec SpoT au niveau des ribosomes. CgtA est une GTPase conservée et essentielle de la famille Obg, mais sa fonction précise est inconnue. Elle a été impliquée à la fois dans la maturation des ribosomes et dans la ségrégation des chromosomes et la division. Le gène cgtA est situé en aval des gènes rplU, rpmA, et yhbE codant respectivement pour les protéines L21 et L27 de la sous-unité 50S du ribosome et pour une protéine intégrale de membrane interne de fonction inconnue. / The stringent response is a physiological process that occurs when bacterial cells encounter nutritional stresses, and allowing coordinated growth arrest. This conserved response is characterized by the accumulation of tetra- and pentaphosphate guanosine (ppGpp). ppGpp bind to RNA polymerase and modifies its kinetic properties, thereby affecting the transcription of many genes. Prinicpaly, ppGpp accumulation inhibits stable RNAs (rRNA and tRNA) biosynthesis, which in consequence inhibits ribosome biogenesis. Escherichia coli contains two enzymes involved in ppGpp metabolism, RelA and SpoT. During amino acid starvation, RelA bound to ribosomes produces ppGpp in response to the presence of uncharged tRNA in the ribosomal A-site. In contrast, SpoT produces ppGpp in response to other types of nutrient limitations, such as carbon starvation, but the detected signals and mechanism involved are still unknown. It has been proposed that the CgtA protein is involved in the stringent response control by interacting with SpoT at the ribosome. CgtA is a conserved and essential small GTPase of the Obg family. CgtA has also been implicated in ribosome maturation, chromosome segregation and division, but its precise function remains unknown. The cgtA gene is located downstream of rplU, rpmA and yhbE genes coding respectively for L21 and L27 proteins of the 50S subunit of the ribosome, and an integral inner membrane protein of unknown function. This genetic proximity with rplU and rpmA genes is highly conserved in bacteria. My thesis work was therefore organized around three questions. First, understanding the role of CgtA in growth control and in the stringent response.

Les mécanismes d'adaptation d'Escherichia coli à une alternance quotidienne entre des conditions de croissance et de carence ont été étudiés grâce à une stratégie d'évolution expérimentale. Douze populations d'E. coli, dérivant d'un ancêtre commun, ont été propagées pendant plus de 40 000 générations par transferts journaliers dans un milieu minimum contenant une quantité limitante de glucose. L'évolution des 12 populations se caractérise par un degré important de parallélisme phénotypique (augmentation du fitness et du volume cellulaire, ...) et génétique, les mêmes gènes étant ciblés par la sélection naturelle dans la majorité des populations. Des mutations bénéfiques ciblant le gène spoT, acteur majeur de la réponse stringente permettant l'adaptation aux carences, avaient été identifiées dans 8 populations. Nous avons mis en évidence des mutations bénéfiques ciblant des gènes impliqués dans la biosynthèse de la paroi (pbpA-rodA) et la superhélicité de l'ADN (topA, fis). L'étude moléculaire de 2 mutations bénéfiques touchant l'opéron pbpA-rodA révèle qu'elles diminuent la quantité de protéine PBP2. L'analyse de 3 mutations ciblant le gène spoT montre qu'elles atténuent le contrôle stringent lors de l'entrée en phase stationnaire sans modifier les niveaux cellulaires de (p)ppGpp. Différentes mutations d'un même gène ayant les mêmes effets, l'évolution révèle un parallélisme moléculaire important. Près de la moitié des mutations bénéfiques affecte les réseaux de régulation globale de l'expression des gènes (spoT, fis, topA). La plasticité des réseaux de régulation globale joue donc un rôle primordial au cours de l'évolution et l'adaptation des bactéries.

Bien que divers mécanismes coopèrent pour empêcher les erreurs lors de la synthèse des protéines chez les bactéries, des erreurs traductionnelles de type « frameshift » (ETFs) ou « faux-sens » peuvent avoir lieu. En particulier, les ETFs ont été détectées à de faibles niveaux lors de la phase de croissance exponentielle et à des niveaux plus élevés durant la phase de croissance stationnaire chez Escherichia coli et Bacillus subtilis. Ces observations ont conduit les chercheurs à revoir le rôle de la "réponse stringente" dans la survenue des ETFs, qui constitue l’un des mécanismes clé de l'adaptation bactérienne aux changements nutritionnels. Elle découle de l'interaction entre un ribosome en cours de traduction et la protéines RelA/SpoT ce qui permet de détecter les ARNs de transfert (ARNts) non chargés et résulte en la production d'une molécule appelée (p)ppGpp . Dans une souche mutante relA incapable de synthétiser le (p)ppGpp, les ETFs sont fortement augmentées.Dans ce contexte, notre objectif principal a été de revisiter le rôle de la réponse stringente dans le contrôle des erreurs traductionnelles et de clarifier le rôle des deux métabolites antagonistes GTP et (p)ppGpp. Par exemple, le GTP stimule l'initiation de la traduction (en ciblant le facteur d'initiation IF2) alors que le (p)ppGpp inhibe l'initiation de la traduction (en rentrant en concurrence avec le GTP pour se fixer sur IF2).A cette fin, nous avons utilisé le modèle des bactéries à Gram positif B. subtilis, conçu trois systèmes rapporteurs distincts pour détecter les ETFs et construit une souche incapable de synthétiser du (p)ppGpp (appelée "(p)ppGpp0"). Nous avons observé qu'au cours de la croissance dans des milieux pauvres, les ETFs augmentent en l'absence de (p)ppGpp durant la phase exponentielle et que, contrairement à la souche sauvage, la souche (p)ppGpp0 présente un pic d’ETFs en milieu riche pendant la transition à la phase stationnaire. En contrôlant les niveaux intracellulaires de GTP dans la souche (p)ppGpp0, nous avons montré que l'abondance de GTP est le facteur qui déclenche l'apparition des ETFs. Néanmoins, après une "faible" induction de la biosynthèse du GTP conduisant à des taux de croissance sous-optimaux, le niveau d’ETFs forme toujours un pic lors de la transition vers la phase stationnaire, ce qui montre que le mode d'action du (p)ppGpp pour prévenir l'apparition des ETFs ne repose pas uniquement sur son action inhibitrice de la biosynthèse du GTP. Nous nous sommes alors concentrés sur l'effet inhibiteur du (p)ppGpp sur IF2 et avons mimé son action en injectant des drogues connues pour inhiber l'initiation de la traduction. Nous avons ainsi démontré qu'en réduisant l'initiation de la traduction lors de l'épuisement des aminoacyl-ARNts, la souche "(p)ppGpp0" est capable de contrôler de façon optimale le taux d’ETFs lors de la transition vers la phase stationnaire.Dans une deuxième partie, nous avons étudié comment la transcription et la traduction sont affectées par les variations du niveau de GTP et de (p)ppGpp. Nous avons observé que les gènes possédant un "+1" de transcription (TSS, « transcription start site ») composé de deux guanines (gènes artificiels et ARNs ribosomaux) ont vu leur taux de transcription positivement corrélés au taux de croissance à l'inverse des gènes possédant un TSS composé de deux adénines. Cette différence est encore plus prononcée pour la souche (p)ppGpp0 cultivée en milieu riche lors de l'ajout de guanosine (ce qui conduit à un niveau élevé de GTP).En conclusion, nous avons démontré que le (p)ppGpp contrôle le niveau d'erreurs traductionnelles lors de la croissance en régime permanent en abaissant les niveaux de GTP et lors d’un changement nutritionnel en inhibant spécifiquement l'initiation de la traduction, assurant une allocation parcimonieuse des ressources au sein de la bactérie. / Even though diverse mechanisms cooperate to prevent protein synthesis errors in bacteria, missense and translational frameshift errors (TFEs) can occur . In particular, TFEs were detected at low levels in the exponential growth phase and at higher levels in the stationary phase in both Escherichia coli and Bacillus subtilis. This observation led researchers to revisit the role of the “stringent response” in the occurrence of TFEs since it is the key mechanism involved in the bacterial adaptation to nutritional downshifts. It relies on the interaction between the RelA/SpoT proteins and the translating ribosomes, which leads to the detection of uncharged tRNAs and to the production of an alarmone called (p)ppGpp. In a relA mutant strains unable to synthesize (p)ppGpp, translational errors are highly increased.In this context, the main goal of our work was to revisit the role of the stringent response in the translational error control and to clarify the role of the two key, antagonistic metabolites GTP and (p)ppGpp. Indeed, while GTP enhances translation initiation (targeting the initiation factor IF2) and elongation (targeting the elongation factor EF-Tu) , (p)ppGpp inhibits GTP biosynthesis (reducing the enzyme activity of Gmk, HprT and GuaB) and translation initiation (competing with GTP on IF2).For this purpose, we used the Gram positive model bacterium B. subtilis, designed three distinct reporter systems to detect TFEs and built a strain unable to synthesize (p)ppGpp (called “(p)ppGpp0”). We observed that during growth in poor media TFEs were increased in the absence of (p)ppGpp in the exponential phase (i.e. steady-state growth) and that by contrast to the wild type, the (p)ppGpp0 strain exhibited a TFE burst during the transition in rich medium to the stationary phase. By controlling intracellular levels of GTP in the (p)ppGpp0 strain, we showed that GTP abundance is the trigger factor of TFEs occurrence. Nevertheless, upon a "weak" induction of GTP biosynthesis leading to sub-optimal growth rates, the TFEs rate still peaked during the transition to the stationary phase, which demonstrated that the mode of action of (p)ppGpp to prevent TFEs occurrence did not only rely on its inhibition of GTP biosynthesis. We then focused on the (p)ppGpp inhibitory effect on IF2 and mimicked its action by injecting drugs known to inhibit translation initiation. Hence, we demonstrated that by reducing translation initiation (injecting drugs) upon aminoacyl-tRNAs depletion (p)ppgGp0 wild-strain type cells is are able to optimally control the rate of TFEs in the transition to the stationary phase. The same conclusion is obtained even in presence of a high GTP level.In a second part, we studied how transcription and translation are affected by variations in GTP and (p)ppGpp abundances. We observed that genes possessing a transcription start site (TSS) made of two guanines were more importantly transcribed at higher growth rates than genes possessing a TSS made of two adenines. This difference was even more pronounced for (p)ppGpp0 strains grown in rich medium upon guanosine addition (leading to a high level of GTP). Moreover, the ribosomal RNAs (rrns; for which the TSS is a guanine) synthesis level seemed to be positively correlated to GTP levels during exponential growth in poor and rich media as observed by the modulation of GTP biosynthesis.In conclusion, we demonstrated that (p)ppGpp controls the occurrence of translational errors during steady-state growth by decreasing GTP levels and during a nutritional downshift by specifically inhibiting translation initiation ensuring a parsimonious , which also globally affects resource allocation.

Les infections en biofilm, notamment de dispositifs médicaux, mettent fréquemment en échec les traitements antibiotiques, imposant le retrait du matériel. Pseudomonas aeruginosa s’est imposé comme le pathogène-type des infections en biofilm. Pour explorer les déterminants de l’échec du traitement antibiotique en biofilm, un modèle de biofilm in vitro à P. aeruginosa exposé à des doses supra-inhibitrices d’antibiotiques a été développé. En culture planctonique, une bithérapie deciprofloxacine et d’amikacine permettait de prévenir la sélection de mutants résistants pour des souches de P. aeruginosa de sensibilité diminuée à la ciprofloxacine ou à l’amikacine par surexpression d’efflux. En biofilm, l’association de la ciprofloxacine et de l’amikacine, administrées simultanément ou séquentiellement, n’était pas supérieure aux monothérapies, permettant une réduction bactérienne, mais pas d’éradication complète du biofilm. Quelles que soient les souches (sauvages ou exprimant un efflux) et l’antibiotique, l’échec microbiologique en biofilm était lié à la sélection de cellules persistantes, tolérantes aux antibiotiques. La ciprofloxacine induisait des modifications importantes de la structure du biofilm avec une réduction considérable des exopolysaccharides, composants majeurs de la matrice. L’étude transcriptomique de gènes potentiellement impliqués dans la persistance suggérait que l’activation précoce de la réponse stringente pourrait être une des voies principales de la tolérance en biofilm sous ciprofloxacine. Enfin, la présence de « small colony variants » au sein du biofilm, dotés d’une capacité accrue de formation de biofilm, témoignait de la diversité des populations en biofilm. Ces travaux participent ainsi à une meilleure compréhension des mécanismes d’échappement aux antibiotiques de P. aeruginosa en biofilm. / Biofilm device-related infections can lead to antibiotic failure requiring frequent removal of medical device. Pseudomonas aeruginosa has emerged as the typical pathogen for biofilm infections. To explore the determinants of antibiotic failure in biofilm, an in vitro P. aeruginosa biofilm model exposed to suprainhibitory antibiotic concentrations was developed. In planktonic culture, the ciprofloxacin and amikacin combination prevented the selection of resistant mutants in ciprofloxacin and amikacinlow-level resistant P. aeruginosa strains overexpressing efflux. In biofilm, the ciprofloxacin and amikacin combination, used simultaneously or sequentially, didn’t show superior effects compared to monotherapies. Despite an initial bacterial reduction, biofilm eradication was not obtained. Regardless of wild-type or efflux strains and antibiotic regimen used, antibiotic failure was related to the selection of antibiotic-tolerant cells named “persisters”. Ciprofloxacin induced significant alterations in the biofilm structure, notably a considerable reduction in the exopolysaccharides of the matrix. The transcriptomic analysis of genes, potentially involved in persistence, suggested that early activation of the stringent response might be one of the main pathways for ciprofloxacin tolerance in biofilm. Finally, the emergence of "small colony variants" within the biofilm, characterized by enhanced ability to form biofilm, attested to biofilm heterogeneity. This work therefore contributes to a better understanding of how P. aeruginosa biofilms escape antibiotic.

La production de protéines hétérologues permet de développer une nouvelle génération de vaccins. La bactérie Escherichia coli est l’un des organismes hôtes les plus utilisés pour la production de protéines hétérologues, appelées également protéines recombinantes. Le déclenchement de la production de protéine altère la croissance bactérienne en réponse à la réallocation des ressources métaboliques vers la synthèse de la protéine ; ce qui peut conduire à l’arrêt complet de la croissance. Le maintien de la croissance bactérienne durant la production de la protéine recombinante est pourtant essentiel pour améliorer significativement la quantité et la fonctionnalité des protéines produites. Dans une démarche rationnelle visant à développer un système biologique robuste et performant pour la production d’une grande diversité de protéines recombinantes chez E. coli, les contraintes métaboliques liées à leur production ont été quantifiées. A partir de ces résultats, le système d’expression T7 a été intégré à la régulation métabolique et traductionnelle de la bactérie E. coli BL21 (DE3) afin d’adapter la vitesse de production avec les capacités métaboliques de la souche. Ce nouveau système biologique de production a ainsi permis d’augmenter considérablement les quantités de protéines produites et offre la possibilité de développer de nouveaux procédés performants de production semi-continus et continus en milieu chimiquement défini. / The production of heterologous proteins offers the ability to develop a new generation of vaccines. The most used organism for the production of heterologous proteins, also called recombinant proteins, is the bacterium Escherichia coli. However, the induction of the production often alleviates the bacterial growth by the new allocation of metabolic resources toward the production of the recombinant protein. Even, this may also lead to growth arrest. The production of high quantities of functional recombinant proteins requires a good balance between of bacterial growth and production of the recombinant protein.In order to rationally develop a robust and an efficient biological system for the production of a large variety of recombinant proteins in E. coli, the metabolic constraints associated to their production have been quantified. From this observation, the T7 expression system has been integrated into the metabolic and translational regulation of the E. coli BL21 (DE3) in order to adjust as perfect as possible the protein production rate to the metabolic capacities of the strain. This new biological production system has made it possible to significantly increase the quantities of proteins produced and opens up the possibility of developing performant semi-continuous and continuous production processes in a chemically defined medium.