Zielsetzung der vorgestellten Arbeit war die Etablierung und Validierung einer Zellkultur isolierter equiner endometrialer Epithel- und Stromazellen für morphologische und funk-tionelle Untersuchungen an den einzelnen Zelltypen und ihrer Interaktionen. Ein solches In-vitro-System könnte insbesondere für Studien zur der Pathogenese der Endometrose zum Einsatz kommen. Zu diesem Zweck wurden Endometriumbioptate und Uteri von gynäkologisch unauffälli-gen Stuten entnommen. Die Isolierung der Zellen erfolgte nach mechanischer Zerklei-nerung des Gewebes mittels enzymatischer Verdauung durch Kollagenase. Für die Se-paration und Aufreinigung der Epithel- und Stromazellen kam, nach unbefriedigenden Ergebnissen bezüglich Zellausbeute und –reinheit bei Verwendung der Verfahren allein, eine Kombination aus Filtration, diskontinuierlicher Dichtegradientenzentrifugation und Differenzialadhärenz zum Einsatz. So konnten Kreuzkontaminationen der beiden Zell-fraktionen von ≤ 2 % erreicht werden. Die Kultivierung der so gewonnenen Zellen er-folgte bei 37 °C, in Raumluft mit 5 % CO2 in wasserdampfgesättigter Atmosphäre in RPMI 1640 als Medium mit 10 % fötalem Kälberserum. Der Proliferationsvergleich auf unterschiedlichen Oberflächenbeschichtungen (Kunst-stoff, Kollagen, Matrigel®) zeigte einen Wachstumsvorteil der Epithelzellen auf dem ECM-Substrat Matrigel®. Im Gegensatz zu den stromalen Zellen, deren Wachstum auf dieser gegenüber den anderen Beschichtungen verlangsamt war. Die Stromazellen konnten über 1 Jahr bis zur Passage 19 in Kultur gehalten werden bevor deutliche De-generationserscheinungen auftraten. Bei den epithelialen Zellen war die Subkultivierung nach Trypsinierung nicht erfolgreich. Eine morphologische und funktionelle Charakterisierung der kultivierten Zellen fand mit-tels Lichtmikroskopie mit verschiedenen Färbungen, Immunhistologie sowie Transmissions- und Rasterelektronenmikroskopie statt. Für diesen Zweck erfolgte die Kultivierung der Zellen auf chamber slides und in Matrigel®-beschichteten Membraneinsätzen als Mono- und Kokultur. Die Epithelzellen stellten sich auf unbeschichteten Kunststoffoberflächen als flache, po-lygonale Zellen dar. Bei Bereitstellung von Matrigel® bildeten sie Organoide aus polari-sierten Zellverbänden mit Mikrovilli und Protrusionen an der Oberfläche aus. Als Zellver-bindungen traten Interdigitationen, tight junctions und Desmosomen auf. Im Zytoplas-ma waren neben rauem endoplasmatischen Retikulum, Golgi-Apparat und Mitochond-rien auch Sekretvakuolen zu finden. Immunhistologisch reagierten die Epithelien auch in vitro Zytokeratin-positiv. Dieses Charakteristikum diente als Unterscheidungsmerkmal von den Stromazellen, da nach einer Woche Kulturzeit auch der Vimentinnachweis bei den epithelialen Zellen positiv ausfiel. Progesteron- und Östrogenrezeptoren waren mit-tels Immunhistologie bei beiden kultivierten Zelltypen nicht nachweisbar. Die spindeligen bis sternförmigen Stromazellen wiesen keine Oberflächenmodifikationen auf. Intrazytoplasmatisch waren Mitochondrien, raues endoplasmatische Retikulum und ein Golgi-Apparat nachweisbar. Die stromalen Zellen waren immunhistologisch durch einen Vimentinnachweis gekennzeichnet. Zusätzlich konnte nach wenigen Tagen in der Kultur -Aktin und teils auch Desmin nachgewiesen werden. Diese Differenzierung zu Myofibroblasten trat unter hypoxischen Kulturbedingungen (1 % O2) verstärkt auf. Die morphologische und immunhistologische Charakterisierung zeigte, dass die Diffe-renzierung sowohl der epithelialen als auch der stromalen Zellen unter den eingesetzten Kulturbedingungen der von Endometrose betroffenen Zellen oder den Zellen in inakti-ven Endometrien während des Winteranöstrus in situ ähnelt. Die etablierte Zellkultur equiner endometrialer Epithel- und Stromazellen aus Biopsiema-terial bildet die Grundlage für morphologische und funktionelle Untersuchungen an den einzelnen Zelltypen und ihrer Interaktionen zur Erforschung der Pathogenese der En-dometrose. Aus praktischer und ethischer (tierschutzrechtlicher) Sicht bietet sie eine hervorragende Möglichkeit experimenteller Untersuchungen an endometrialen Zellen der Stute.

The contribution of the bone marrow microenvironment in myelodysplastic syndrome is controversial. We therefore analyzed the functional properties of primary mesenchymal stromal cells from patients with myelodysplastic syndrome in the presence or absence of lenalidomide. Compared to healthy controls, clonality and growth were reduced across all disease stages. Furthermore, differentiation defects and particular expression of adhesion and cell surface molecules (e.g. CD166, CD29, CD146) were detected. Interestingly, the levels of stromal derived factor 1-alpha in patients’ cells culture supernatants were almost 2-fold lower (P<0.01) than those in controls and this was paralleled by a reduced induction of migration of CD34+ hematopoietic cells. Co-cultures of mesenchymal stromal cells from patients with CD34+ cells from healthy donors resulted in reduced numbers of cobblestone area-forming cells and fewer colony-forming units. Exposure of stromal cells from patients and controls to lenalidomide led to a further reduction of stromal derived factor 1-alpha secretion and cobblestone area formation, respectively. Moreover, lenalidomide pretreatment of mesenchymal stromal cells from patients with low but not high-risk myelodysplastic syndrome was able to rescue impaired erythroid and myeloid colony formation of early hematopoietic progenitors. In conclusion, our analyses support the notion that the stromal microenvironment is involved in the pathophysiology of myelodysplastic syndrome thus representing a potential target for therapeutic interventions.

The contribution of the bone marrow microenvironment in myelodysplastic syndrome is controversial. We therefore analyzed the functional properties of primary mesenchymal stromal cells from patients with myelodysplastic syndrome in the presence or absence of lenalidomide. Compared to healthy controls, clonality and growth were reduced across all disease stages. Furthermore, differentiation defects and particular expression of adhesion and cell surface molecules (e.g. CD166, CD29, CD146) were detected. Interestingly, the levels of stromal derived factor 1-alpha in patients’ cells culture supernatants were almost 2-fold lower (P<0.01) than those in controls and this was paralleled by a reduced induction of migration of CD34+ hematopoietic cells. Co-cultures of mesenchymal stromal cells from patients with CD34+ cells from healthy donors resulted in reduced numbers of cobblestone area-forming cells and fewer colony-forming units. Exposure of stromal cells from patients and controls to lenalidomide led to a further reduction of stromal derived factor 1-alpha secretion and cobblestone area formation, respectively. Moreover, lenalidomide pretreatment of mesenchymal stromal cells from patients with low but not high-risk myelodysplastic syndrome was able to rescue impaired erythroid and myeloid colony formation of early hematopoietic progenitors. In conclusion, our analyses support the notion that the stromal microenvironment is involved in the pathophysiology of myelodysplastic syndrome thus representing a potential target for therapeutic interventions.

Einleitung: Die Tendinopathie der Oberflächlichen Beugesehne (OBS) ist eine häufig auftretende orthopädische Erkrankung beim Pferd, die meist zu einer langfristigen oder sogar endgültigen Leistungsdepression führt. Bisher besteht kein therapeutischer Goldstandard, jedoch wird die Therapie mit multipotenten mesenchymalen Stromazellen (MSC) als aussichtsreich erachtet. Der Verbleib und der Wirkmechanismus dieser Zellen nach lokaler Applikation sind nicht hinreichend bekannt. Eine kombinierte Markierung der MSC mit superparamagnetischen Eisenoxidpartikeln (SPIO) und dem Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin B ermöglicht die Analyse der Biodistribution mit Hilfe von Magnetresonanztomographie (MRT), histologischen und fluoreszenzbasierten Untersuchungen. Ziele: Wesentliches Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der lokalen Distribution intraläsional applizierter MSC sowie die Untersuchung einer potentiellen systemischen Verteilung und gezielten Einwanderung in anderes geschädigtes Gewebe. Weiterhin sollte die Anwendung des Magic Angle- Effektes in der MRT bezüglich Durchführbarkeit an stehenden Pferden und Effektivität des Zelltrackings evaluiert werden. Tiere, Material und Methoden: Bei 6 Pferden wurden im mittleren Teil der metakarpalen/-tarsalen OBS aller 4 Gliedmaßen Sehnenläsionen auf mechanisch-enzymatischem Wege induziert. Die für die Applikation aus Fettgewebe der Glutealregion gewonnenen, autologen MSC wurden mit Molday ION Rhodamine B (BioPAL, Inc., Worcester, USA) markiert. 3 Wochen nach Defektinduktion erfolgte die intraläsional Applikation der markierten MSC in die OBS einer Vorder- und einer Hintergliedmaße und Serum in die kontralateralen Kontrolldefekte. Im Zeitraum der Zellapplikation wurden mehrere venöse Blutproben durchflusszytometrisch auf Rhodamin B-positive Zellen hin untersucht. Insgesamt erfolgten 10 MRT-Untersuchungen der Vordergliedmaßen bis zur 24. Woche nach Zellapplikation in denen Standard- und Magic Angle-Aufnahmen angefertigt wurden. Bis zur 3. Woche nach Zellapplikation erfolgten 4 Standard-MRT-Untersuchungen der Hintergliedmaßen. T1- und T2*- gewichtete Sequenzen dienten bei beiden Aufnahmetechniken der Beurteilung SPIO-bedingter hypointenser Artefakte. 3 Wochen nach der Zellapplikation wurden Biopsien aus den OBS der Hintergliedmaßen entnommen. Zum gleichen Zeitpunkt erfolgte die Entnahme von subkutanem Fett- und Muskelgewebe aus dem Bereich der Fettentnahmestelle und aus der unbeschädigten kontralateralen Glutealregion. 24 Wochen nach Zellapplikation wurden die Tiere euthanasiert und die OBS der Vordergliedmaßen entnommen. Alle Gewebeproben wurden histologisch (Preußisch Blau Färbung) und fluoreszenzbasiert (Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie) untersucht. Ergebnisse: SPIO-bedingte hypointense Artefakte waren über 24 Wochen in MRT-Aufnahmen der MSC-behandelten OBS vorhanden. Die Signalintensität war konstant niedrig, jedoch verringerte sich das Volumen der hypointensen Artefakte mit der Zeit. Diese ließ ein Abnehmen der Zahl markierter MSC vermuten, was in histologischen Analysen bestätigt wurde. Der Magic Angle-Effekt konnte in allen OBS der Vordergliedmaßen und zu allen Zeitpunkten erzeugt werden. Die Abgrenzbarkeit der hypointensen Artefakte gegenüber dem in Standard-MRT-Aufnahmen hypointensen gesunden Sehnengewebe erhöhte sich, jedoch gab es keine Unterschiede in der Volumenmessung der SPIO- bedingten hypointensen Artefakte zwischen Standard- und Magic Angle-Aufnahmen. Histologisch konnten intrazelluläre Preußisch Blau-positive Zellen in den MSC-behandelten und kontralateralen Sehnenläsionen sowie in anderem geschädigten Gewebe detektiert werden. Diese Beobachtungen bestätigten sich durch den Nachweis Rhodamin B-positiver Zellen. Durchflusszytometrische Untersuchungen von Blutproben zeigten, dass Rhodamin B-positive Zellen vor allem innerhalb der ersten 12 Stunden nach der Zellapplikation im venösen Blut vorhanden waren. Die intraläsional applizierten MSC verblieben hauptsächlich in der behandelten Sehnenläsionen, welches durch das konstant niedrige Signal der Artefakte in der MRT und durch die Detektion markierter Zellen in entsprechenden histologischen Proben belegt wurde. Schlussfolgerung: Eine langfristige Verfolgung SPIO-markierter MSC ist in vivo im MRT durch beide Aufnahmetechniken möglich. Die Abgrenzbarkeit SPIO-bedingter hypointenser Artefakte kann durch den Magic Angle-Effekt erhöht werden. Allerdings ist die Sensitivität der Zellverfolgung in der MRT begrenzt und somit kann eine geringe Zellmigration nicht detektiert werden. Trotz der Hinweise auf eine systemische Verteilung und Migration der markierten Zellen in anderes geschädigtes Gewebe, verbleibt ein Großteil der markierten MSC nach der intraläsionalen Injektion in der behandelten OBS.

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Der Ersatz von geschädigtem Gewebe durch körpereigene Reparaturprozesse wird auf zellulärer Ebene durch Stammzellen unterstützt. Diese Regenerationsfähigkeit ist allerdings in einigen Geweben nur eingeschränkt vorhanden. So kommt es bei der Sehnenheilung des Pferdes unter konventioneller Therapie zur narbigen Reparation mit hohen Rezidivraten. Die Anwendung von multipotenten mesenchymalen Stromazellen (MSC) stellt eine innovative Therapiemethode dar, da die tenogene Differenzierung zum Zellersatz mit anschließender Matrixmodulation führen könnte. Es ist jedoch unklar, ob eine entzündliche Umgebung in diesem Zusammenhang Einfluss auf funktionelle Eigenschaften der MSC hat. In dieser Arbeit wurden erstmalig funktionelle Eigenschaften, mit dem Fokus des tenogenen Differenzierungspotentials, von aus Fettgewebe isolierten equinen MSC, unter dem Einfluss proinflammatorischer Zytokine und einer direkten Leukozyten-Ko-Kultur, untersucht. Es wurde ein komplexes In-vitro-Modell entwickelt, um die in vivo vorherrschenden Bedingungen bestmöglich zu berücksichtigen. Es konnte erstmals nachgewiesen werden, dass funktionelle und tenogene Eigenschaften von MSC in einem komplexen In-vitro-Modell unter dem Einfluss von proinflammatorischen Zytokinen oder Leukozyten beeinträchtigt werden. Dies hebt die Notwendigkeit zur Untersuchung der komplexen Zusammenhänge während einer akuten Entzündungsreaktion hervor. Es bleibt zu klären, ob trotz der starken Beeinflussung der tenogenen Eigenschaften der vorherrschende Mechanismus der Stammzell-unterstützten Sehnenheilung die tenogene Differenzierung der MSC sein kann.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Multipotente mesenchymale Stromazellen 2.1.1 Eigenschaften 2.1.2 Quellen und Charakterisierung 2.1.3 Therapeutisches Potential 2.2 Pathologie der equinen oberflächlichen Beugesehne 2.2.1 Tiermodell Pferd 2.2.2 Erkrankungen der equinen oberflächlichen Beugesehne 2.2.3 Die Bedeutung der Entzündungsreaktion 2.2.4 Die Bedeutung proinflammatorischer Zytokine und Leukozyten 2.3 Therapeutische Möglichkeiten zur Behandlung von Sehnenpathologien 2.4 Sehnen-Tissue Engineering 2.5 Induktion der tenogenen Differenzierung von MSC 2.6 Bioreaktorsysteme im Sehnen-Tissue Engineering 3 Zielstellung und Hypothesen 4 Tiere, Material und Methoden 4.1 Mesenchymale Stromazellen 4.1.1 Tiere 4.1.2 Material 4.1.3 Methoden 4.1.3.1 Auftauen von AT-MSC 4.1.3.2 Kultivierung von AT-MSC 4.1.3.3 Passagieren von AT-MSC 4.2 Equine oberflächliche Beugesehnen 4.2.1 Material 4.2.2 Methoden 4.2.2.1 Gewinnung von equinen OBS 4.2.2.2 Dezellularisierung von equinen OBS 4.2.2.3 Zuschnitt zu Sehnenscaffolds 4.3 Leukozyten 4.3.1 Spendertier 4.3.2 Material 4.3.3 Methoden 4.3.3.1 Blutentnahme 4.3.3.2 Leukozytenisolierung durch Dichtegradientenzentrifugation 4.3.3.3 Leukozytenstimulation 4.4 Versuchsaufbau 4.5 Aussaat von Scaffold- und Monolayerkulturen 4.5.1 Material 4.5.2 Methoden 4.5.2.1 Monolayerkulturen 4.5.2.2 Scaffoldkulturen 4.6 Bioreaktor 4.7 Stimulation und Stimulationsmuster 4.8 Zugabe von Zytokinen 4.9 Auswertung 4.10 Phasenkontrastmikroskopie und Zellzahlbestimmung 4.10.1 Material 4.10.2 Methoden 4.10.2.1 Automatisierte Auswerung von Aufnahmen der Phasenkontrastmikroskopie 4.10.2.2 Zellzahlbestimmung 4.11 Lebend/Tot-Färbung 4.11.1 Material 4.11.2 Methoden 4.11.2.1 Lebend/Tot-Färbung der Monolayerkulturen 4.11.2.2 Lebend/Tot-Färbung der Scaffoldkulturen 4.11.2.3 Auswertung 4.12 Histologie 4.12.1 Material 4.12.2 Methoden 4.12.2.1 Fixierung und Paraffineinbettung 4.12.2.2 Mikrotomschnitte 4.12.2.3 Hämatoxylin-Eosin-Färbung 4.12.2.4 Auswertung 4.13 Real-Time PCR 4.13.1 Material 4.13.2 Methoden 4.13.2.1 RNA-Isolierung aus Scaffoldkulturen 4.13.2.2 Zellaufschluss der Monolayerkulturen 4.13.2.3 cDNA-Synthese durch Reverse Transkription 4.13.2.4 Real-Time PCR 4.14 Tripotente Differenzierung 4.14.1 Material 4.14.2 Methoden 4.14.2.1 Zellaussaat, Kultivierung und Fixierung 4.14.2.2 Färbung der adipogenen Differenzierung 4.14.2.3 Färbung der osteogenen Differenzierung 4.14.2.4 Färbung der chondrogenen Differenzierung 4.14.2.5 Automatische Auswertung 4.15 Statistische Auswertung 5 Ergebnisse 5.1 Morphologie, Proliferation und Konfluenz der MSC 5.2 Lebend/Tot-Färbung 5.3 Hämatoxylin-Eosin-Färbung 5.4 Genexpression der muskuloskelettalen Marker 5.4.1 Monolayerkultur 5.4.2 Unstimulierte Scaffoldkultur 5.4.3 Stimulierte Scaffoldkultur 5.4.4 Vergleichende Analyse der Versuchsreihen 5.5 Tripotente Differenzierung 5.5.1 Adipogene Differenzierung 5.5.2 Chondrogene Differenzierung 5.5.3 Osteogene Differenzierung 6 Diskussion 6.1 Diskussion der verwendeten Methoden 6.2 Diskussion der Ergebnisse 6.3 Schlussfolgerung 7 Zusammenfassung 8 Summary 9 Literaturverzeichnis 10 Anhang 10.1 Herstellung von Reagenzien 10.2 RNA-Isolierung mittels RNeasy Mini Kit® 10.3 Färbeprotokolle 10.4 Herstellung von Silikonschalen 10.5 Extreme Ausreißerwerte der Genexpressionsanalysen 10.5.1 Monolayerkultur 10.5.2 Unstimulierte Scaffoldkultur 10.5.3 Stimulierte Scaffoldkultur Danksagung

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Zielsetzung der vorgestellten Arbeit war die Etablierung und Validierung einer Zellkultur isolierter equiner endometrialer Epithel- und Stromazellen für morphologische und funk-tionelle Untersuchungen an den einzelnen Zelltypen und ihrer Interaktionen. Ein solches In-vitro-System könnte insbesondere für Studien zur der Pathogenese der Endometrose zum Einsatz kommen. Zu diesem Zweck wurden Endometriumbioptate und Uteri von gynäkologisch unauffälli-gen Stuten entnommen. Die Isolierung der Zellen erfolgte nach mechanischer Zerklei-nerung des Gewebes mittels enzymatischer Verdauung durch Kollagenase. Für die Se-paration und Aufreinigung der Epithel- und Stromazellen kam, nach unbefriedigenden Ergebnissen bezüglich Zellausbeute und –reinheit bei Verwendung der Verfahren allein, eine Kombination aus Filtration, diskontinuierlicher Dichtegradientenzentrifugation und Differenzialadhärenz zum Einsatz. So konnten Kreuzkontaminationen der beiden Zell-fraktionen von ≤ 2 % erreicht werden. Die Kultivierung der so gewonnenen Zellen er-folgte bei 37 °C, in Raumluft mit 5 % CO2 in wasserdampfgesättigter Atmosphäre in RPMI 1640 als Medium mit 10 % fötalem Kälberserum. Der Proliferationsvergleich auf unterschiedlichen Oberflächenbeschichtungen (Kunst-stoff, Kollagen, Matrigel®) zeigte einen Wachstumsvorteil der Epithelzellen auf dem ECM-Substrat Matrigel®. Im Gegensatz zu den stromalen Zellen, deren Wachstum auf dieser gegenüber den anderen Beschichtungen verlangsamt war. Die Stromazellen konnten über 1 Jahr bis zur Passage 19 in Kultur gehalten werden bevor deutliche De-generationserscheinungen auftraten. Bei den epithelialen Zellen war die Subkultivierung nach Trypsinierung nicht erfolgreich. Eine morphologische und funktionelle Charakterisierung der kultivierten Zellen fand mit-tels Lichtmikroskopie mit verschiedenen Färbungen, Immunhistologie sowie Transmissions- und Rasterelektronenmikroskopie statt. Für diesen Zweck erfolgte die Kultivierung der Zellen auf chamber slides und in Matrigel®-beschichteten Membraneinsätzen als Mono- und Kokultur. Die Epithelzellen stellten sich auf unbeschichteten Kunststoffoberflächen als flache, po-lygonale Zellen dar. Bei Bereitstellung von Matrigel® bildeten sie Organoide aus polari-sierten Zellverbänden mit Mikrovilli und Protrusionen an der Oberfläche aus. Als Zellver-bindungen traten Interdigitationen, tight junctions und Desmosomen auf. Im Zytoplas-ma waren neben rauem endoplasmatischen Retikulum, Golgi-Apparat und Mitochond-rien auch Sekretvakuolen zu finden. Immunhistologisch reagierten die Epithelien auch in vitro Zytokeratin-positiv. Dieses Charakteristikum diente als Unterscheidungsmerkmal von den Stromazellen, da nach einer Woche Kulturzeit auch der Vimentinnachweis bei den epithelialen Zellen positiv ausfiel. Progesteron- und Östrogenrezeptoren waren mit-tels Immunhistologie bei beiden kultivierten Zelltypen nicht nachweisbar. Die spindeligen bis sternförmigen Stromazellen wiesen keine Oberflächenmodifikationen auf. Intrazytoplasmatisch waren Mitochondrien, raues endoplasmatische Retikulum und ein Golgi-Apparat nachweisbar. Die stromalen Zellen waren immunhistologisch durch einen Vimentinnachweis gekennzeichnet. Zusätzlich konnte nach wenigen Tagen in der Kultur -Aktin und teils auch Desmin nachgewiesen werden. Diese Differenzierung zu Myofibroblasten trat unter hypoxischen Kulturbedingungen (1 % O2) verstärkt auf. Die morphologische und immunhistologische Charakterisierung zeigte, dass die Diffe-renzierung sowohl der epithelialen als auch der stromalen Zellen unter den eingesetzten Kulturbedingungen der von Endometrose betroffenen Zellen oder den Zellen in inakti-ven Endometrien während des Winteranöstrus in situ ähnelt. Die etablierte Zellkultur equiner endometrialer Epithel- und Stromazellen aus Biopsiema-terial bildet die Grundlage für morphologische und funktionelle Untersuchungen an den einzelnen Zelltypen und ihrer Interaktionen zur Erforschung der Pathogenese der En-dometrose. Aus praktischer und ethischer (tierschutzrechtlicher) Sicht bietet sie eine hervorragende Möglichkeit experimenteller Untersuchungen an endometrialen Zellen der Stute.

Ziel dieser Studie war die Etablierung einer Kokultur aus equinen endometrialen Epithel- und Stromazellen. Nach der erfolgreichen Umsetzung des Kokulturmodells sollte im weiteren Versuchsablauf durch die Zugabe von 17β-Östradiol (E2) und/oder Progesteron (P4) zum Nährmedium der Einfluss der Hormone auf die Zellen untersucht werden. Neben einer lichtmikroskopischen Auswertung der zytomorphologischen Charakteristika beider Zellarten sollte die Expression der Steroidhormonrezeptoren Östrogenrezeptor α und Progesteronre-zeptor sowie der uterinen Proteine Uteroglobin und CalbindinD9k immunzytologisch überprüft werden. Für die Etablierung der Kokultur wurden Endometriumproben von lebenden (n = 5) sowie frischtoten (n = 4) Stuten gewonnen. Eine jeweils parallel entnommene Gewebeprobe von jedem Tier wurde in Formalin fixiert und diente als Referenzmaterial (in situ). Auf die Zelliso-lierung (mechanisch und enzymatisch) folgte die Separation von Epithel- und Stromazellen (EZ/SZ) mittels Filtration, Dichtegradientenzentrifugation und Differenzialadhärenz. An-schließend wurden die EZ auf die Außenseite von Millicell®-Membraneinsätzen aufgebracht. Nach zwei Tagen erfolgte das Einsäen der bis zu diesem Zeitpunkt separat kultivierten SZ auf die Innenseite der Membranen. Als Nährmedium diente ein Gemisch aus DMEM und Ham’s F-12, wobei diesem 2,5 % fötales Kälberserum sowie verschiedene Additive zugesetzt wurden. Ab Kulturtag 4 wurden dem Medium definierte Konzentrationen und Kombinationen von E2 und P4 zugesetzt. Die Kultivierung erfolgte bei einem CO2-Partialdruck von 5 % in 37 °C warmer wasserdampfgesättigter Raumluft. Mit der polarisationsmikroskopisch er-fassbaren Ausbildung durchgehender Zellrasen („scheinbare Konfluenz“) wurden die Kokul-turen in Formalin fixiert und für die Lichtmikroskopie aufgearbeitet. Das Ausgangsgewebe zeigte mehrheitlich eine sekretorische Funktionsmorphologie (n = 6). Einzelne Endometrien befanden sich in einem Übergangsstadium von der Sekretions- zur Proliferationsphase (n = 1), bzw. vice versa (n = 1) oder wiesen eine irregulär proliferative Differenzierung (n = 1) auf. Im Rahmen der Kokultivierung bildeten die EZ innerhalb der Schnittebene vier und die SZ drei verschiedene morphologische Zelltypen aus. Dabei traten rundovale bis polygonale EZ (Typ 1) selten bis gelegentlich, spindelförmige EZ (Typ 2) gelegentlich bis häufig und iso-prismatische (Typ 3) sowie mehrschichtig wachsende EZ (Typ M) jeweils selten auf. Die SZ zeigten innerhalb der Schnittebene selten eine rundovale bis polygonale Zellform (Typ 1), sehr häufig eine spindelförmige Morphologie (Typ 2) und selten ein mehrschichtiges Wachstum (Typ M). Ein Zusammenhang zwischen der endometrialen Funktionsmorphologie zum Zeitpunkt der Zellisolierung oder dem Hormonzusatz und der Häufigkeitsverteilung der Zell-typen sowie der Wachstumsgeschwindigkeit der kultivierten Zellen war nicht offensichtlich. Zytokeratin 19 wurde stets von EZ exprimiert, während es auf Seiten der SZ nur sporadisch in maximal 5 % der Zellen im Bereich mehrschichtig wachsender Zellrasen auftrat. Die Stero-idhormonrezeptoren konnten lediglich in einzelnen Kokulturen aus sekretorisch differenzier-tem Ausgangsgewebe detektiert werden. Uteroglobin wurde in vitro mit einer variablen Häufigkeit in den EZ-Typen exprimiert. Während ein übergreifender Zusammenhang zur hormonellen Supplementierung nicht abgeleitet werden konnte, wurde jedoch ersichtlich, dass im Bereich einschichtig wachsender EZ in Ansätzen aus sekretorisch differenzierten Endometrien unter niedrigen Hormondosen (Zusatz von entweder nur E2 oder nur P4) im Median häufiger Uteroglobin exprimiert wurde. Mit zunehmender Hormonkonzentration im Medium nahm der Anteil immunopositiver Zellen (Typen 1, 2 und 3) deutlich ab. Innerhalb der Stromazellpopulation wurde Uteroglobin selten und ausschließlich in Zellen aus sekretorisch differenziertem Ausgangsmaterial nachgewiesen. CalbindinD9k wurde in vitro vornehmlich intrazytoplasmatisch und sehr vereinzelt intranukleär exprimiert. Insgesamt konnte das Protein in vitro stets in wenigen Typ-1-EZ, sehr selten in Typ-2-EZ und in einer geringen bis mäßigen Anzahl von Typ-3- und Typ-M-EZ beobachtet werden. Innerhalb der Stromazellpo-pulation trat CalbindinD9k ausschließlich in einer geringen (Endometrien aus dem Östrus) bis mäßigen (Endometrien aus dem Interöstrus) Anzahl der Typ-2- und wenigen Typ-M-SZ auf. Insgesamt wurden keine deutlichen Einflüsse der endometrialen Funktionsmorphologie zum Zeitpunkt der Zellisolierung und/oder der hormonellen Supplementierung in vitro auf die im-munzytologischen Charakteristika der kokultivierten Zellen ersichtlich. Abschließend betrachtet, konnte ein Kokultursystem equiner endometrialer Epithel- und Stromazellen erfolgreich etabliert und charakterisiert werden. Es bietet dabei, trotz der z. T. fehlenden Kongruenz zu den Gegebenheiten in situ, Ansätze für potenzielle Folgearbeiten, insbesondere hinsichtlich der Erfassung interzellulärer Wechselwirkungen sowie bezüglich der Vermittlung und Wirkung hormoneller Einflüsse auf zellulärer Ebene. / The aim of the present study was the establishment of a coculture system of equine endome-trial epithelial and stromal cells. Subsequent to the successful development of the coculture model the culture medium should be supplemented with 17β-estradiol (E2) and/or progester-one (P4) in order to study the influence of the hormones on the cellular level. In addition to the examination of cytomorphological characteristics of both cell types via light microscopy, the expression of the steroid hormone receptors (estrogen receptor α and progesterone receptor) as well as of the uterine proteins Uteroglobin and CalbindinD9k was investigated. For the establishment of the coculture system endometrial samples were obtained from living (n = 5) as well as freshly deceased mares (n = 4). A simultaneously taken tissue specimen of each animal was fixed in formalin and served as in situ reference material. After an initial mechanical and enzymatical isolation the epithelial and stromal cells (EC/SC) were separat-ed via filtration, density gradient centrifugation and differential adhesion. Subsequently, the EC were applied to the outer surface of Millicell® inserts. The SC were cultivated separately for 2 days before they were seeded onto the inner surface of the same insert. The culture medium used was comprised of a DMEM and Ham‘s F-12 basis as well as 2.5 % foetal calf serum and different additives. Starting on day 4 of cultivation the standardised medium was supplemented with different concentrations and combinations of E2 and P4. Throughout the study the cultures were kept in a humidified atmosphere of 37°C and a 5 % partial pressure of carbon dioxide. Once the cocultures formed continuous cell layers, as determined via a polarisation microscope (“apparent confluency”), the membranes were fixed in formalin and routinely processed for light microscopical evaluation. The initial tissue samples predominantly showed a secretory functional morphology (n = 6), while single specimens were obtained during the transition from the secretory to the prolifera-tive phase (n = 1) or vice versa (n = 1). One endometrial sample exhibited an irregular proli-ferative differentiation. In the course of cocultivation the EC formed 4 and the SC 3 different cellular morphologies within the section plane. EC with a round-oval to polygonal cell form (type 1) were rarely to occasionally encountered, while spindle-shaped EC (type 2) were occasionally to frequently seen and EC with a cuboidal morphology (type 3) as well as such cells growing in stratified layers (type M) were only infrequently detected. The SC only rarely showed a round-oval to polygonal cell form (type 1) or areas of a stratified cell growth (type M), whereas spindle-shaped SC (type 2) were observed very often. A correlation of the endometrial functional morphology at the time of cell isolation or the hormonal supplementation and the frequency distribution of the cell types as well as the growth rate of the cultivated cells was not evident. The EC always expressed Cytokeratin 19, while on the side of the SC only up to 5 % of the cells in areas of stratified cell growth exhibited this filament. Solely in individual cocultures from secretory differentiated endometrial tissue the steroid hormone receptors could be de-tected. Uteroglobin was expressed in vitro in EC with a variable frequency. An overall corre-lation of the hormonal supplementation and the Uteroglobin expression could not be derived. However, under low hormone doses (only E2 or only P4 supplement) Uteroglobin was detect-ed in EC in areas of single-layered cell growth more often (median value). With an increase in hormone concentration the amount of immunopositive cells (types 1, 2 and 3) diminished noticeably. In SC the protein could only rarely be seen and exclusively in cells from endome-tria with a secretory functional morphology. In vitro CalbindinD9k was predominantly detected intracytoplasmatically, while single cells showed an additional intranuclear expression. Alto-gether, CalbindinD9k could always be observed in a few type-1-EC, rarely in type-2-EC and with a variable frequency in small to moderate numbers of type-3- and type-M-EC. In SC the protein was exclusively expressed in a small (endometrial samples form the oestrous phase) to moderate (endometrial tissue from the interoestrous phase) number of type-2-SC and a few type-M-SC. Generally, no distinct influence of the endometrial functional morphology at the time of tissue sampling and/or of the hormonal supplementation in vitro on the immuno-cytochemical characteristics of the cocultured cells could be observed. In summary, a coculture system of primary equine endometrial epithelial and stromal cells was successfully established and characterised. Despite of the partly absent congruence to the in situ conditions/prerequisites, the present study offers a basic approach and scaffold for further investigations, particularly regarding the ascertainment of intercellular dependencies or the mediation and effectiveness of hormonal influences on the cellular level.

Mesenchymale Stromazellen (MSCs) werden beim Pferd bereits mit vielversprechenden Ergebnissen zur Behandlung von muskuloskelettalen Erkrankungen, insbesondere von Sehnenerkrankungen, eingesetzt. In bisherigen klinischen Studien lag das Hauptaugenmerk auf der Behandlung von Erkrankungen der Oberflächlichen Beugesehne bei Rennpferden, die jedoch in Deutschland nur einen verhältnismäßig kleinen Anteil des Patientenaufkommens darstellen. Die zu erwartenden Ergebnisse nach MSC-Behandlung von Fesselträgererkrankungen sind dagegen noch nicht bekannt. Darüber hinaus sind die grundlegenden Kenntnisse zur Biologie equiner MSCs noch unzureichend, was Verständnis und Optimierung des bestehenden Therapiekonzeptes erschwert. Häufig wird die Verwendung alternativer Gewebequellen für MSCs diskutiert, wobei jedoch nur wenige vergleichende Daten zu den jeweiligen zellulären Eigenschaften vorliegen. Ziel dieser Arbeit war es daher, zum einen mehr Kenntnisse über die zu erwartenden klinischen Ergebnisse nach MSC-Behandlung von Sehnenerkrankungen zu erlangen, einschließlich Erkrankungen des Fesselträgers, zum anderen den Wissensstand hinsichtlich der in-vitro-Charakterisierung equiner MSCs zu erweitern, wobei ein Vergleich klinisch relevanter Charakteristika zwischen MSCs aus verschiedenen Gewebequellen angestrebt wurde. In die klinische Studie wurden 98 Pferde, die aufgrund von Sehnen- und Banderkrankungen mit MSCs behandelt worden waren, einbezogen. Von 58 dieser Tiere konnten Langzeitergebnisse nach einem Beobachtungszeitraum von mindestens einem Jahr erhoben werden. Diese wurden hinsichtlich des Behandlungserfolges sowie möglicher Einflussfaktoren ausgewertet, wobei die Behandlung als erfolgreich bewertet wurde, wenn die Patienten nach dem Beobachtungszeitraum voll trainiert oder im Sport eingesetzt werden konnten und dabei kein Rezidiv aufgetreten war. Die Behandlung mit MSCs wurde bei 84,5 % der Pferde als erfolgreich eingestuft, wobei Erkrankungen der Oberflächlichen Beugesehne mit 84,2 % und Erkrankungen des Fesselträgers mit 83,3 % gleichermaßen gute Ergebnisse zeigten. Tendenziell beeinflussten Nutzungsdisziplin, Erkrankungsstadium und Patientenalter das klinische Ergebnis ebenso wie bei konventioneller Behandlung. Insgesamt war nach MSC-Behandlung das Auftreten von Rezidiven deutlich seltener zu beobachten als in der Literatur für die konventionelle Behandlung beschrieben wird. Für die in-vitro-Studie zur vergleichenden Charakterisierung equiner MSCs aus verschiedenen Quellen wurden Knochenmark, Fett- und Sehnengewebe sowie Nabelschnurblut und -gewebe gewonnen. Aus diesen Proben wurden jeweils die plastikadhärenten MSCs isoliert und hinsichtlich Zellausbeute, Proliferations- und Migrationseigenschaften, tripotentem Differenzierungspotential sowie der Expression der Sehnenmarker Kollagen 1A2 und Skleraxis vergleichend untersucht. Die Ausbeute an MSCs war bei allen soliden Geweben (Fett-, Sehnen-, und Nabelschnurgewebe) hochsignifikant höher (p < 0,001). Ebenso proliferierten MSCs aus Fett- und Sehnengewebe signifi-kant schneller als MSCs aus Knochenmark oder Nabelschnurblut (p < 0,01). Von letzteren wurden darüber hinaus etwa drei viertel aller Zellkulturen vor der achten Passage seneszent. Das höchste Migrationspotential zeigten wiederum MSCs aus Sehnen- und Fettgewebe, wobei hier MSCs aus Nabelschnurgewebe das ungünstigste Ergebnis erzielten (p < 0,01). Die adipogene Differenzierung gelang bei MSCs aus allen Quellen vergleichbar gut. Bei der osteogenen Differenzierung erreichten MSCs aus Knochenmark das beste Ergebnis, während MSCs aus Nabelschnurblut und –gewebe nur schwach osteogen differenzierten (Tag 21: p < 0,01; Tag 35: p < 0,05). Im Gegensatz dazu erreichten MSCs aus Nabelschnurblut bei der chondrogenen Differenzierung die meisten Scorepunkte, MSCs aus Knochenmark dagegen die wenigsten (p < 0,05). Kollagen 1A2 wurde von MSCs aus Fettgewebe am höchsten exprimiert, Skleraxis von MSCs aus Nabelschnurblut. MSCs aus Sehnengewebe exprimierten beide Sehnenmarker auf fast ebenso hohem Level. MSCs aus Knochenmark dagegen zeigten hier jeweils die niedrigste Expression (p < 0,05 für Kollagen 1A2). Basierend auf den Ergebnissen der klinischen Studie ist die MSC-Therapie nach wie vor als vielversprechende Behandlungsoption für Sehnenerkrankungen anzusehen und ist auch für die Behandlung von Fesselträgererkrankungen geeignet. Zukünftige, kontrollierte klinische Studien müssen jedoch die Wirksamkeit der MSC-Therapie noch weitergehend bestätigen. Die in-vitro-Studie zeigte signifikante Unterschiede zwischen equinen MSCs aus verschiedenen Quellen auf, die bei der Auswahl einer Gewebequelle für die MSC-Isolierung für klinische Anwendungen berücksichtigt werden sollten. MSCs aus Fettgewebe erscheinen aufgrund ihrer sehr guten Proliferations- und zuverlässigen Differenzierungseigenschaften als eine gute Alternative zu MSCs aus Knochenmark für autologe Therapien. MSCs aus Sehnengewebe sind den hier vorliegenden Ergebnissen zufolge besonders gut für die Behandlung von Sehnenerkrankungen geeignet; vor einer routinemäßigen Anwendung dieser MSCs sollten jedoch ihre Eigenschaften weiterführend untersucht werden. / In horses, mesenchymal stromal cells (MSCs) are used for the treatment of musculoskeletal diseases, especially tendon injuries, with promising results. Previous clinical studies mainly focused on the treatment of superficial digital flexor tendon injuries in racehorses, which, however, represent only a relatively small percentage of the overall equine case load in Germany. Average outcome to be expected following MSC treatment of suspensory ligament injuries was not yet determined. Moreover, basic knowledge on equine MSC biology is still deficient, hampering the understanding and thus the optimisation of the existing treatment regime. The use of alternative MSC sources is frequently discussed, yet to date, only few data comparing the cellular properties of equine MSCs from different sources have been published. The aim of this study was, on the one hand, to gain more knowledge concerning the expected outcome after MSC treatment of tendon injuries, including injuries to the suspensory ligament. On the other hand, it was aimed at expanding the knowledge on equine MSC characterisation in vitro, thereby focusing on the comparison of clinically relevant properties of MSCs derived from different sources. In the clinical study, 98 horses were included, all of which had received MSC treatment for tendon or ligament injuries. In 58 of these horses, long term results after a follow-up period of at least one year could be collected. These data were analysed with respect to treatment outcome and potential influencing factors. Treatment was considered successful when horses were back to full training or competition after the follow-up period, without having suffered a re-injury. The overall success rate was 84.5 %. Success rates in horses suffering from superficial digital flexor tendon injuries and in horses suffering from suspensory ligament injuries were comparably good (84.2 % and 83.3 %, respectively). Similar to conventional therapies, the sports discipline in which the horses performed, age and disease stage tended to influence the outcome. Overall, re-injury rates after MSC treatment were considerably lower than those described in the literature following conventional treatment. For the comparative characterisation of MSCs from different sources in vitro, samples of bone marrow, adipose and tendon tissue, as well as umbilical cord blood and –tissue were collected. Plastic-adherent MSCs were isolated out of these samples and comparatively characterised focusing on cell yields, proliferation and migration properties, trilineage differentiation potential and the expression of the tendon markers collagen 1A2 and scleraxis. MSC yields were significantly higher in all solid tissues (adipose, tendon and umbilical cord tissue) (p < 0.001). Further, MSCs from adipose and tendon tissue proliferated significantly faster than MSCs from bone marrow or umbilical cord blood (p < 0.01). Moreover, approximately three quarters of the samples derived from the latter sources underwent senescence before reaching passage eight. The highest migration potential was found in MSCs derived from tendon and adipose tissue again, while MSCs from umbilical cord tissue showed the least (p < 0.01). The adipogenic differentiation potential was comparably good in MSCs from all different sources. The osteogenic differentiation was most distinct in MSCs from bone marrow, while MSCs from umbilical cord blood and tissue showed only weak evidence of differentiation (day 21: p < 0.01; day 35: p < 0.05). In contrast, following chondrogenic differentiation, MSCs from umbilical cord blood scored highest and MSCs from bone marrow scored lowest (p < 0.05). Collagen 1A2 was most highly expressed in MSCs from adipose tissue, highest scleraxis expression levels were found in MSCs from umbilical cord blood. MSCs from tendon tissue, however, expressed both markers at almost evenly high levels. Contrastingly, lowest expression levels of both markers were found in MSCs derived from bone marrow (p < 0.05 for collagen 1A2). Based on the results of the clinical study, MSC therapy can still be considered a very promising treatment option for tendon diseases and is also a suitable treatment for suspensory ligament injuries. In the future, controlled clinical studies will have to further confirm the efficacy of this treatment regime. The in-vitro-study showed significant differences between equine MSCs derived from different sources, which should be considered when choosing a MSC source for clinical applications. For autologous therapies, MSCs derived from adipose tissue appear to be a good alternative to MSCs derived from bone marrow, due to their remarkable proliferation and reliable differentiation capacities. Furthermore, according to this study, MSCs derived from tendon tissue are especially suitable for treating tendon injuries. Prior to routine clinical applicability of these MSCs, however, their properties should be further investigated.