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In der humanen Magenschleimhaut regulieren eine Vielzahl von Interaktionen zwischen verschiedenen Zellpopulationen die Verdauung und die Überwachung von Infektionen. Epithelzellen in der Schleimhaut differenzieren in spezialisierte Zelltypen, die schützenden Mukus, Magensäure, Verdauungsenzyme oder Hormone produzieren. Eine Infektion mit Helicobacter pylori kann die Gewebehomöostase fehlregulieren, was die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass an der Infektionsstelle ein Magengeschwür, ein Adenokarzinom oder letztendlich Magenkrebs auftritt. In dieser Arbeit wird die Entwicklung eines neuartigen in vitro Kulturmodells für humane primäre Magenepithelzellen, die sogenannte Mukosoidkultur, gezeigt. Die Mukosoidkulturen sind repräsentativ für Epithelbarrieren und rekapitulieren die meisten Funktionen der menschlichen Magenschleimhaut in vivo, einschließlich der Schleimproduktion, und ermöglichen eine langfristige und stabile Kultivierung von Epithelzellen sowie Infektionsstudien mit H.pylori. Mukosoidkulturen aus Corpus wurden verwendet, um die Nischenfaktoren zu untersuchen, die die Differenzierung von Oberflächenepithelzellen, Hauptzellen und Parietalzellen fördern. EGF erwies sich zusammen mit BMP/Noggin als ein wichtiger Regulator bei der Differenzierung. Stromazellen sind Teil der Lamina propria der Magenschleimhaut. Über die Wechselwirkung mit dem Epithel unter homöostatischen Bedingungen und bei bakteriellen Infektionen mit H.pylori ist nur sehr wenig bekannt. Die Co-Kultur von humanen primären Stromazellen des Magens mit Epithelzellen unter Verwendung des Mukosoidkultur-Modells zeigte die aktive Signalübertragung zwischen beiden Zelltypen auf. Darüber hinaus wurden Mukosoidkulturen erfolgreich mit H.pylori infiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass Stromazellen aktiv mit Cytokin- und Chemokinexpression auf eine epitheliale Infektion reagieren. Gleichzeitig erhöhten Stromazellen die NFκB-gesteuerte Entzündungsreaktion in Epithelzellen. / In the human gastric mucosa, multiple interactions between different cell populations regulate digestion and surveillance of infections. Epithelial cells in the mucosa differentiate into specialized cell types to produce protective mucins, gastric acid, digestive enzymes or hormones. Infection with Helicobacter pylori dysregulates the tissue homeostasis increasing the chance to develop a gastric ulcer, adenocarcinoma or ultimately gastric cancer at the site of infection. In this thesis, the development of a novel in vitro culture model for human primary gastric epithelial cells, called the mucosoid culture, is shown. The mucosoid cultures are representative of epithelial barriers and recapitulate most of the functions of the human gastric mucosa in vivo, including mucus production, and allow long-term and stable cultivation of epithelial cells as well as infection studies with H.pylori. Corpus derived mucosoids were used to investigate the niche factors that promote the differentiation of foveolar cells, chief cells, and parietal cells. EGF was found to be a major regulator in differentiation together with BMP/Noggin. Stromal cells are part of the lamina propria of the gastric mucosa. Very little is known about the interaction with the epithelium under homeostatic conditions and during bacterial infections with Helicobacter pylori. The co-culture of human primary gastric stromal cells with epithelial cells using the mucosoid culture model demonstrated the active signaling between both cell types. Furthermore, mucosoid cultures were successfully infected with H. pylori. The results revealed that stromal cells actively respond to epithelial infection with cytokine and chemokine expression. Concurrently stromal cells increased the NFκB-driven inflammatory response in epithelial cells.

Acute myeloid leukemia (AML) presents the deadliest form of blood cancer which leads to abrupt, premature deaths. Current therapeutic treatment options in AML are unspecific, resulting in high relapse rates and poor clinical responses in patients. Therapy-resistant, stem cell-like AML cells are believed to be protected by proximal stromal cells in their microenvironment, the leukemic stem cell niche. In part A of this work, an innovative first-of-its-kind arrayed endoribonuclease-prepared siRNA (esiRNA) screen was established for the targeted identification of stromal-derived, AML-supportive genes. Immortalized bone-marrow derived mesenchymal stromal cells (SCP-1) were subjected to individual esiRNA-mediated target gene knockdowns (KD) and subsequently cocultured with AML cell lines MV4-11, OCI-AML3, MOLM-13 and HL-60. AML proliferation and therapy resistance to cytostatic agents Cytarabine or Daunorubicin and tyrosine kinase inhibitor Midostaurin were assessed in direct cocultures. In SCP-1, several secreted, membrane-associated and intracellular molecules were identified which, upon esiRNA-mediated KD, resulted in proliferation inhibition and enhanced treatment response of cocultured AML cells. Carbonic anhydrase 9 (CA9), a stabilizer of intracellular pH, was identified as a supportive factor in proliferation and resistance of leukemic cells to Daunorubicin treatment whilst CA9-KD exerted only a comparably low toxicity in SCP-1 cells. Excitingly, published data by Chen and colleagues (Blood, 2017, Vol. 130, Suppl. 1, 2521) indicated an upregulation of CA9 in hypoxic ex vivo cultures of leukemic cells, measured an anti-leukemic effect of pharmacological CA9 inhibition and identified a synergistic effect on leukemic cells via combinatorial treatment of CA9-inhibition and Cytarabine under hypoxic culture conditions. Taken together, an arrayed esiRNA screen identified CA9 and other stromal-derived factors which potentially open up new avenues for selective therapeutic treatments targeting the leukemic microenvironment in AML. Currently, preclinical leukemia research relies on artificial suspension cultures of AML cells and highly sophisticated, patient-derived xenograft (PDX) mouse models that are marked by suboptimal translation of findings of PDX experiments into the clinic. Recent developments in complex three-dimensional (3D) hydrogel star-shaped poly(ethylene glycol) (starPEG)-heparin cocultures of leukemic and stromal cells of human origin showed promising results in proliferation and drug response studies. Therefore, in part B of this work, a high throughput screening (HTS)-compatible 3D hydrogel culture setup of human stromal cells was established in 384-well plates. Implementation of design of experiments (DoE) enabled an efficient, cost-effective optimization of hydrogel monocultures of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Optimized culture conditions favored angiogenic sprouting of hydrogel-embedded HUVECs which responded to angiogenic inhibitors Axitinib, AZD4547 and Bevacizumab in a dose-dependent manner. A coculture with bone marrow derived MSCs altered the angiogenic network formation of endothelial CD31+ vessel-like structures. The hydrogel coculture was further stabilized by extensive hydrogel degradation and ECM deposition of MSCs. Stromal MSC networks were illustrated as highly interconnected and elongated F-Actin filament structures (CD31- F-Actin+) that were closely associating with CD31+ F-Actin+ endothelial vessel-like structures. Excitingly, the established 3D hydrogel HTS platform of primary human stromal cells enables future addition of patient-derived leukemic cells for targeted leukemic vulnerability screens in an ex vivo cell culture model of the perivascular stem cell niche. / Akute myeloische Leukämie (AML) gilt als die tödlichste Form der Blutkrebserkrankungen, welche untherapiert zum abrupten, vorzeitigen Tod führt. Etablierte therapeutische Verfahren der AML sind unspezifisch, welche durch heterogene Behandlungseffekte gekennzeichnet sind und zu hohen Rückfallquoten führen. Man vermutet, dass therapie-resistente, stammzellähnliche leukämische Zellen von proximal residierenden Stromazellen in ihrem Mikromilieu, in der sogenannten leukämischen Stammzellnische, vor therapeutischen Behandlungen geschützt werden. In Teil A dieser Arbeit wurde ein innovativer, neuartiger Screen basierend auf Endoribonuklease-generierten kleinen, interferierenden Ribonukleinsäuren (esiRNAs) für eine gezielte Identifikation von AML-supportiven, stromalen Faktoren etabliert. Immortalisierte, mesenchymale Stromazellen aus dem Knochenmark (SCP-1) wurden in einem Array mit spezifischen esiRNAs transfiziert, um esiRNA-basierende inhibierende Effekte (Knockdown) auf die Genexpression von Zielgenen in SCP-1 zu studieren und indirekte Auswirkungen auf Proliferationsrate und Therapieresistenz von kokultivierten leukämischen Zelllinien, MV4-11, OCI-AML3, MOLM-13 und HL-60, bei Behandlung mit Cytarabin, Daunorubicin und Midostaurin, zu studieren. Mehrere sezernierte, membranständige und intrazelluläre Faktoren wurden in SCP-1 identifiziert, deren esiRNA-vermittelter Knockdown zu einer Proliferationsminderung sowie verstärkten Toxizitätseffekten von applizierten Therapeutika in Leukämiezellen führten. Beispielhaft wurde Carboanhydrase (CA9), ein Enzym welches den intrazellularen pH einer Zelle stabilisert, als Target identifiziert. Ein Knockdown von CA9 in SCP-1 resultierte in einer Proliferationsminderung von kokultivierten Leukämiezellen, welche des Weiteren in einer Behandlung mit Daunorubicin verstärkt abgetötet wurden. Publizierte Daten von Chen et al. (Blood, 2017, Vol. 130, Suppl. 1, 2521) zeigten, dass CA9 in hypoxischen ex vivo Kulturen in leukämischen Zellen hochreguliert war und, dass dessen pharmakologische Inhibition einen anti-leukämischen Effekt aufwies. Zudem wurde ein synergistischer Therapieffekt, bei einer Kombinationstherapie mit einem CA9-Inhibitor und Cytarabin, auf AML Zellen in hypoxischer Zellkultur festgestellt. Zusammenfassend wurden in einem esiRNA-Screen CA9 und weitere stromal-exprimierte Faktoren identifiziert, die das Potential besitzen neuartige Therapiestrategien zu ermöglichen, welche auf die leukämische Stammzellnische als Zielstruktur ausgerichtet sind. In der präklinischen Forschung von hämatologischen Erkrankungen werden vorrangig artifizielle zweidimensionale Suspensionskulturen von Leukämiezellen verwendet oder ausgefeilte, patienten-derivierende Xenograft (PDX) Mausmodelle eingesetzt. Bedauerlicherweise weisen Erkenntnisse aus Mausmodellen eine geringe Translationseffizienz in die klinische Forschung auf. Neuste Entwicklungen mit komplexen, dreidimensionalen Hydrogelkulturen, bestehend aus sternförmigem Polyethylenglykol (starPEG) und Heparin, von stromalen und leukämischen Zellen humanen Ursprungs zeigten vielversprechende Ergebnisse in präklinischen Proliferations- und Vulnerabilitätsstudien. Daher wurde in Teil B dieser Arbeit ein hochdurchsatzfähiges dreidimensionales Kultursystem von humanen Stromazellen in Hydrogelen entwickelt. Per statistischer Versuchsplanung wurde eine effiziente, kostengünstige Optimierung von etablierten Hydrogelkulturen für die Hochdurchsatz-kompatible Kultur von humanen venösen Endothelzellen aus Nabelschnuren (HUVECs) durchgeführt. Optimierte Kulturbedingungen führten zur Angiogenese von Hydrogel-eingebetteten HUVECs, welche des Weiteren auf die Angiogenese-Inhibitoren Axitinib, AZD4547 und Bevacizumab in einer konzentrationsabhängigen Weise mit verminderter Bildung von gefäßähnlichen Strukturen reagierten. Eine Kokultur von HUVECs mit primären, mesenchymalen Stromazellen aus dem Knochenmark (MSCs) beeinflusste die Bildung von CD31+ gefäßähnlichen Strukturen. Die Hydrogel-Kokultur wurde des Weiteren durch verstärkte Degradation des Hydrogels und Deposition von Komponenten der extrazellulären Matrix via MSCs verändert und dadurch zusätzlich stabilisiert. Geformte Netzwerkstrukturen von MSCs und HUVECs wurden mittels F-Actin Färbung identifiziert, wodurch ersichtlich wurde, dass Strukturen von MSCs (CD31- F-Actin+) in enger räumlicher Distanz zu HUVEC Strukturen (CD31+ F-Actin+) gebildet wurden. Spannenderweise ermöglicht die, in dieser Arbeit etablierte, Hochdurchsatz-kompatible Kokultur von humanen Stromazellen die Möglichkeit auch leukämische Zellen in die Hydrogelmatrix einzubetten. Eine humane AML-Stroma Kokultur in Hydrogelen wird gezielte Vulnerabilitätsscreens von AML Zellen in einem komplexen ex vivo Zellkulturmodel der perivaskulären Stammzellnische ermöglichen.

Functional impairment of the bone marrow (BM) niche has been suggested as a major reason for prolonged cytopenia and secondary graft failure after allogeneic hematopoietic cell transplantation (alloHCT). Because mesenchymal stromal cells (MSCs) serve as multipotent progenitors for several niche components in the BM, they might play a key role in this process. We used collagenase digested trephine biopsies to directly quantify MSCs in 73 patients before (n = 18) and/or after alloHCT (n = 65). For the first time, we demonstrate that acute graft-versus-host disease (aGvHD, n = 39) is associated with a significant decrease in MSC numbers. MSC reduction can be observed even before the clinical onset of aGvHD (n = 10). Assessing MSCs instantly after biopsy collection revealed phenotypic and functional differences depending on the occurrence of aGvHD. These differences vanished during ex vivo expansion. The MSC endotypes observed revealed an enhanced population of donor-derived classical dendritic cells type 1 and alloreactive T cells as the causing agent for compartmental inflammation and MSC damage before clinical onset of aGvHD was ascertained. In conclusion, MSCs endotypes may constitute a predisposing conductor of alloreactivity after alloHCT preceding the clinical diagnosis of aGvHD.

Endothelzell-basierte Therapien vermitteln regenerative Effekte hinsichtlich der Revaskularisierung von ischämischen Geweben. Doch ist die Verfügbarkeit von autologen Endothelzellen aufgrund einer krankheitsbedingt reduzierten Frequenz im peripheren Blut oder einer verminderten Integrität der endogenen Endothelzell-Populationen eingeschränkt. Hingegen ist es möglich, allogene endotheliale Vorläuferzellen aus der Nabelschnur in zelltherapeutisch relevanten Mengen zu isolieren. In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst die Eigenschaften allogener humaner Nabelschnur (NS)-abgeleiteter sog. Endothelial Colony-Forming Cells (ECFCs) mit denen von venösen NS-abgeleiteten Endothelzellen verglichen. Aufgrund der nachgewiesenen Immunogenität von allogenen ECFCs wurde eine weiterführende Strategie zur Reduktion dieser immunogenen Eigenschaften durch die Koapplikation mit Mesenchymalen Vorläuferzellen (MSCs) verfolgt. Humane ECFCs wurden mit MSCs desselben Spenders kombiniert und in funktionellen in vitro- und in vivo-Assays untersucht. Dadurch konnte nachgewiesen werden, dass IFNγ-stimulierte ECFC/MSC-Kokulturen eine reduzierte Expression von HLA-Molekülen zeigen. Entsprechend induzierten spezifische CD8+ T-Zellen eine reduzierte Lyse der kokultivierten ECFCs und MSCs. Die Kokultur von ECFCs und MSCs mit allogenen Immunzellen führte zu einer nahezu vollständigen Inhibition der T-Zell-Proliferation. Um die reduzierte Immunogenität von ECFC und MSC in vivo zu verifizieren, wurden die Zellen in immundefiziente Mäuse injiziert, welche nachfolgend mit humanen PBMCs rekonstituiert wurden. So konnte nachgewiesen werden, dass die Koapplikation von ECFCs und MSCs nicht nur die Entstehung von stabilen Gefäßnetzwerken begünstigt, sondern zudem in den Transplantaten zu einer verringerten Immunzell-Infiltration führte. Die Koapplikation von ECFCs mit MSCs könnte daher eine klinische Nutzung dieser allogenen Quelle für die therapeutische Unterstützung der Vaskularisierung ermöglichen. / Endothelial cell-based therapies promote tissue regeneration and vascularization after ischemic damage. The availability of autologous endothelial progenitor cells is restricted in diseased patients, however therapeutically relevant numbers of allogeneic Endothelial Progenitor Cells can be isolated from an umbilical cord (UC). In the present study, the immunogenic properties of these Endothelial Colony Forming Cells (ECFCs) were first compared to human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Both cytokine-treated endothelial cells induced CD4+ and CD8+ T cell proliferation after coculture with allogeneic immune cells. So far, the potential interactions between ECFCs and Mesenchymal Stem/Progenitor Cells (MSCs) concerning their immunological features is poorly understood, but we hypothesize that MSCs might improve the immune compatibility and vessel building characteristics of ECFCs. Therefore, human UC-derived ECFC and MSC cocultures from the same donor were analyzed using various functional in vitro and in vivo assays. Stimulation of these cocultures with IFNγ caused strongly reduced expression levels of HLA-molecules compared to ECFC monocultures. The decreased molecular density on the cocultured ECFCs resulted in reduced cytotoxic CD8+ T cell-mediated lysis. Further, during IFNγ stimulation, the combination of ECFCs with MSCs prevented initiation of allogeneic T cell proliferation. To verify this concept in vivo, ECFCs and MSCs were co-transplanted in a humanized allograft mouse model in immunodeficient mice in order to effectively induce stable microvessels. These experiments demonstrate that when MSCs are co-applied with ECFCs, they not only support the formation of stable blood vessels, but also lead to fewer HLA-DR+ human vascular structures and fewer infiltrating human leukocytes. The data presented indicate that crosstalk between UC-derived ECFCs and MSCs might lower the risk of allogeneic ECFC rejection.