Einleitung: Die Tendinopathie der Oberflächlichen Beugesehne (OBS) ist eine häufig auftretende orthopädische Erkrankung beim Pferd, die meist zu einer langfristigen oder sogar endgültigen Leistungsdepression führt. Bisher besteht kein therapeutischer Goldstandard, jedoch wird die Therapie mit multipotenten mesenchymalen Stromazellen (MSC) als aussichtsreich erachtet. Der Verbleib und der Wirkmechanismus dieser Zellen nach lokaler Applikation sind nicht hinreichend bekannt. Eine kombinierte Markierung der MSC mit superparamagnetischen Eisenoxidpartikeln (SPIO) und dem Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin B ermöglicht die Analyse der Biodistribution mit Hilfe von Magnetresonanztomographie (MRT), histologischen und fluoreszenzbasierten Untersuchungen. Ziele: Wesentliches Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der lokalen Distribution intraläsional applizierter MSC sowie die Untersuchung einer potentiellen systemischen Verteilung und gezielten Einwanderung in anderes geschädigtes Gewebe. Weiterhin sollte die Anwendung des Magic Angle- Effektes in der MRT bezüglich Durchführbarkeit an stehenden Pferden und Effektivität des Zelltrackings evaluiert werden. Tiere, Material und Methoden: Bei 6 Pferden wurden im mittleren Teil der metakarpalen/-tarsalen OBS aller 4 Gliedmaßen Sehnenläsionen auf mechanisch-enzymatischem Wege induziert. Die für die Applikation aus Fettgewebe der Glutealregion gewonnenen, autologen MSC wurden mit Molday ION Rhodamine B (BioPAL, Inc., Worcester, USA) markiert. 3 Wochen nach Defektinduktion erfolgte die intraläsional Applikation der markierten MSC in die OBS einer Vorder- und einer Hintergliedmaße und Serum in die kontralateralen Kontrolldefekte. Im Zeitraum der Zellapplikation wurden mehrere venöse Blutproben durchflusszytometrisch auf Rhodamin B-positive Zellen hin untersucht. Insgesamt erfolgten 10 MRT-Untersuchungen der Vordergliedmaßen bis zur 24. Woche nach Zellapplikation in denen Standard- und Magic Angle-Aufnahmen angefertigt wurden. Bis zur 3. Woche nach Zellapplikation erfolgten 4 Standard-MRT-Untersuchungen der Hintergliedmaßen. T1- und T2*- gewichtete Sequenzen dienten bei beiden Aufnahmetechniken der Beurteilung SPIO-bedingter hypointenser Artefakte. 3 Wochen nach der Zellapplikation wurden Biopsien aus den OBS der Hintergliedmaßen entnommen. Zum gleichen Zeitpunkt erfolgte die Entnahme von subkutanem Fett- und Muskelgewebe aus dem Bereich der Fettentnahmestelle und aus der unbeschädigten kontralateralen Glutealregion. 24 Wochen nach Zellapplikation wurden die Tiere euthanasiert und die OBS der Vordergliedmaßen entnommen. Alle Gewebeproben wurden histologisch (Preußisch Blau Färbung) und fluoreszenzbasiert (Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie) untersucht. Ergebnisse: SPIO-bedingte hypointense Artefakte waren über 24 Wochen in MRT-Aufnahmen der MSC-behandelten OBS vorhanden. Die Signalintensität war konstant niedrig, jedoch verringerte sich das Volumen der hypointensen Artefakte mit der Zeit. Diese ließ ein Abnehmen der Zahl markierter MSC vermuten, was in histologischen Analysen bestätigt wurde. Der Magic Angle-Effekt konnte in allen OBS der Vordergliedmaßen und zu allen Zeitpunkten erzeugt werden. Die Abgrenzbarkeit der hypointensen Artefakte gegenüber dem in Standard-MRT-Aufnahmen hypointensen gesunden Sehnengewebe erhöhte sich, jedoch gab es keine Unterschiede in der Volumenmessung der SPIO- bedingten hypointensen Artefakte zwischen Standard- und Magic Angle-Aufnahmen. Histologisch konnten intrazelluläre Preußisch Blau-positive Zellen in den MSC-behandelten und kontralateralen Sehnenläsionen sowie in anderem geschädigten Gewebe detektiert werden. Diese Beobachtungen bestätigten sich durch den Nachweis Rhodamin B-positiver Zellen. Durchflusszytometrische Untersuchungen von Blutproben zeigten, dass Rhodamin B-positive Zellen vor allem innerhalb der ersten 12 Stunden nach der Zellapplikation im venösen Blut vorhanden waren. Die intraläsional applizierten MSC verblieben hauptsächlich in der behandelten Sehnenläsionen, welches durch das konstant niedrige Signal der Artefakte in der MRT und durch die Detektion markierter Zellen in entsprechenden histologischen Proben belegt wurde. Schlussfolgerung: Eine langfristige Verfolgung SPIO-markierter MSC ist in vivo im MRT durch beide Aufnahmetechniken möglich. Die Abgrenzbarkeit SPIO-bedingter hypointenser Artefakte kann durch den Magic Angle-Effekt erhöht werden. Allerdings ist die Sensitivität der Zellverfolgung in der MRT begrenzt und somit kann eine geringe Zellmigration nicht detektiert werden. Trotz der Hinweise auf eine systemische Verteilung und Migration der markierten Zellen in anderes geschädigtes Gewebe, verbleibt ein Großteil der markierten MSC nach der intraläsionalen Injektion in der behandelten OBS.

Mesenchymale Stammzellen (MSC) werden bereits in klinischen Studien zur Behandlung verschiedener Krankheiten eingesetzt. Über deren Wirkmechanismus und Verbleib nach Applikation ist jedoch noch wenig bekannt. Die in vivo-Nachverfolgung markierter MSC mittels Magnetresonanztomographie stellt eine mögliche Methode zur Erlangung weiterer Erkenntnisse dar. Zu diesem Zweck können die MSC mittels superparamagnetischen Eisenoxid (SPIO)-Partikeln markiert werden. In dieser Arbeit wurden 3 verschiedene SPIO-Produkte zur Markierung oviner und equiner MSC verwendet: Endorem™, Resovist® und Molday ION Rhodamine B™. Die Produkte wurden hinsichtlich ihrer Einflüsse auf die biologischen Eigenschaften der MSC, ihrer Markierungseffizienz und –selektivität verglichen. Desweiteren wurde die produktspezifische magnetresonanztomographische Nachverfolgbarkeit der SPIO-markierten MSC untersucht. Weiterführendes Ziel war die Selektion des am besten geeigneten SPIO-Produktes für die Verwendung in einem in vivo-Großtierversuch zur magnetresonanztomographischen Nachverfolgung SPIO-markierter MSC nach Applikation in arthrotische Gelenke. Die MSC wurden dazu aus dem Knochenmark von je 5 gesunden Schafen und Pferden isoliert, bis zur Passage 4 (P4) expandiert und schließlich mit den verschiedenen SPIO-Produkten markiert. Unmarkierte MSC der gleichen Tiere dienten zur Kontrolle. Proliferationsvermögen sowie tripotentes Differenzierungspotential wurden in vitro untersucht. Zur Evaluierung von Markierungsselektivität und -effizienz der SPIO-Produkte wurden die MSC ab der P4 bis zur P7 wöchentlich passagiert. Ein semiquantitatives histologisches Auswertungssystem basierend auf der Preußisch Blau-Färbung sowie T2*w-GRE-Sequenzen an einem 0,5T-MRT-System wurden zur Evaluierung genutzt. Markierungsselektivität bezeichnete die intra- oder extrazelluläre Lokalisation der SPIO-Partikel. Markierungseffizienz beschrieb die Menge intrazellulär vorhandener SPIO-Partikel. Es wurde gezeigt, dass sich ovine und equine MSC mit allen 3 untersuchten SPIO-Produkten erfolgreich markieren ließen. Die Ergebnisse der in vitro-Untersuchungen ergaben keine Unterschiede zwischen SPIO-markierten und unmarkierten MSC hinsichtlich des Proliferationsvermögens, der adipogenen oder osteogenen Differenzierungsfähigkeit. Jedoch wurde eine deutliche Verminderung des chondrogenen Differenzierungspotentials SPIO-markierter MSC beobachtet, welche von der Menge intrazellulär vorhandener SPIO-Partikel und somit von der Markierungseffizienz abhängig war. Zum Zeitpunkt der initialen Markierung konnte nur Molday ION Rhodamine B™ eine selektive und effiziente Zellmarkierung gewährleisten. Mit Endorem™ konnte eine selektive, jedoch keine ausreichend effiziente Zellmarkierung erreicht werden. Resovist® dagegen bewirkte zwar eine effiziente, aber sehr unselektive initiale Zellmarkierung: Mittels Preußisch Blau-Färbung wurde gezeigt, dass große Mengen von SPIO-Partikeln nur extrazellulär anhefteten. Die 3 verschiedenen SPIO-Produkte führten weiterhin zu unterschiedlich starken hypointensen MRT-Signalen der markierten MSC, welche im Verlauf der 3-wöchigen Versuchsdauer bei allen 3 Produkten stetig abnahmen. Unmarkierte MSC waren isointens, also mittels MRT nicht darstellbar und daher nicht nachverfolgbar. Stets verursachten Resovist®-markierte MSC das stärkste hypointense MRT-Signal, gefolgt von Molday ION Rhodamine B™ und Endorem™. Resovist®-markierte MSC konnten mittels MRT bei beiden Spezies über den längsten Zeitraum nachverfolgt werden (ovine MSC bis 16 Tage, equine MSC bis 23 Tage nach Markierung). Aufgrund der exzellenten initialen Markierungseigenschaften (hohe Markierungsselektivität und –effizienz sowie gute Nachverfolgbarkeit) eignet sich Molday ION Rhodamine B™ besonders gut für die SPIO-Markierung von MSC zur Nachverfolgung mittels MRT. Molday ION Rhodamine B™ verspricht somit eine erfolgreiche Anwendung in einem in vivo-Versuch zur magnetresonsztomographischen Nachverfolgung von MSC nach Applikation in arthrotische Gelenke. / Mesenchymal stem cells (MSC) are already used in clinical studies for treatment of different diseases. However, their mechanism of action and fate after application are still not fully understood. In vivo tracking of labeled MSC via magnetic resonance imaging (MRI) is a possible method to achive further knowledge. For this purpose MSC can be labelled with superparamagnetic iron oxide (SPIO) particles. For this study 3 different SPIO products were employed for labelling of ovine and equine MSC: Endorem™, Resovist®,, and Molday ION Rhodamine B™. The products were compared in terms of their influence on biologic behaviour of the MSC, their labelling efficiency, and selectivity. Furthermore, product specific magnetic resonance traceability of SPIO labelled MSC was evaluated. Final aim was the selection of the most suitable SPIO product to be used in an in vivo large animal study employing MRI tracking of SPIO labelled MSC after application into osteoarthritic joints. MSC therefore, were isolated from bone marrow of each 5 healthy sheep and horses, expanded up to passage 4 (p4), and labelled by the different SPIO products. Unlabelled MSC from the same animals served as control. Proliferation potential and tripotent differentiation capacities were assessed in vitro. For evaluation of labelling selectivity and efficiency of the SPIO products MSC were passaged weekly from p4 up to p7. Semiquantitative histological scoring based on Prussian blue staining and images using T2*w GRE sequences in a 0.5T MRI system were used. Labelling selectivity describes the intra- or extracellular localisation of the SPIO particles. Labelling efficiency describes the amount of intracellular SPIO particles. It was shown that ovine and equine MSC could be successfully labelled by all 3 evaluated SPIO products. The results of the in vitro experiments did not show differences between labelled and unlabelled MSC in terms of proliferation potential, adipogenic or osteogenic differentiation capacities. However, an inhibited chondrogenic differentiation capacity of SPIO labelled MSC was observed, which was dependend on the amount of intracellular SPIO particles and therefore, also on labelling efficiency. At the time of initial labelling, only Molday ION Rhodamine B™ showed selective and efficient cell labelling. With Endorem™ selective, but not efficient cell labelling was achieved. Resovist®, in contrast, caused efficient but very unselective initial cell labelling: By Prussian blue staining it was shown that large amounts of SPIO particles were attached extracellularly. These 3 different SPIO products led to variable hypointense MRI signals of the labelled MSC which decreased in all 3 products during the 3 week study period. Unlabelled MSC were isointense, thus not visible, and therefore, not traceable using MRI. At every point of time, Resovist® labelled MSC resulted in the most hypointense MR signals, followed by Molday ION Rhodamine B™ and Endorem™. Resovist® labelled MSC were traced over the longest time span (ovine MSC until 16 days, equine MSC until 23 days post labelling). Due to excellent initial labelling properties (high labelling efficiency and selectivity, good traceability) Molday ION Rhodamine B™ suits best for SPIO labelling of MSC to be tracked by MRI. Molday ION Rhodamine B™ therefore, promises a successful use in an in vivo study using MRI for MSC tracking after application into osteoarthritic joints.

Mesenchymale Stammzellen (MSC) werden bereits in klinischen Studien zur Behandlung verschiedener Krankheiten eingesetzt. Über deren Wirkmechanismus und Verbleib nach Applikation ist jedoch noch wenig bekannt. Die in vivo-Nachverfolgung markierter MSC mittels Magnetresonanztomographie stellt eine mögliche Methode zur Erlangung weiterer Erkenntnisse dar. Zu diesem Zweck können die MSC mittels superparamagnetischen Eisenoxid (SPIO)-Partikeln markiert werden. In dieser Arbeit wurden 3 verschiedene SPIO-Produkte zur Markierung oviner und equiner MSC verwendet: Endorem™, Resovist® und Molday ION Rhodamine B™. Die Produkte wurden hinsichtlich ihrer Einflüsse auf die biologischen Eigenschaften der MSC, ihrer Markierungseffizienz und –selektivität verglichen. Desweiteren wurde die produktspezifische magnetresonanztomographische Nachverfolgbarkeit der SPIO-markierten MSC untersucht. Weiterführendes Ziel war die Selektion des am besten geeigneten SPIO-Produktes für die Verwendung in einem in vivo-Großtierversuch zur magnetresonanztomographischen Nachverfolgung SPIO-markierter MSC nach Applikation in arthrotische Gelenke. Die MSC wurden dazu aus dem Knochenmark von je 5 gesunden Schafen und Pferden isoliert, bis zur Passage 4 (P4) expandiert und schließlich mit den verschiedenen SPIO-Produkten markiert. Unmarkierte MSC der gleichen Tiere dienten zur Kontrolle. Proliferationsvermögen sowie tripotentes Differenzierungspotential wurden in vitro untersucht. Zur Evaluierung von Markierungsselektivität und -effizienz der SPIO-Produkte wurden die MSC ab der P4 bis zur P7 wöchentlich passagiert. Ein semiquantitatives histologisches Auswertungssystem basierend auf der Preußisch Blau-Färbung sowie T2*w-GRE-Sequenzen an einem 0,5T-MRT-System wurden zur Evaluierung genutzt. Markierungsselektivität bezeichnete die intra- oder extrazelluläre Lokalisation der SPIO-Partikel. Markierungseffizienz beschrieb die Menge intrazellulär vorhandener SPIO-Partikel. Es wurde gezeigt, dass sich ovine und equine MSC mit allen 3 untersuchten SPIO-Produkten erfolgreich markieren ließen. Die Ergebnisse der in vitro-Untersuchungen ergaben keine Unterschiede zwischen SPIO-markierten und unmarkierten MSC hinsichtlich des Proliferationsvermögens, der adipogenen oder osteogenen Differenzierungsfähigkeit. Jedoch wurde eine deutliche Verminderung des chondrogenen Differenzierungspotentials SPIO-markierter MSC beobachtet, welche von der Menge intrazellulär vorhandener SPIO-Partikel und somit von der Markierungseffizienz abhängig war. Zum Zeitpunkt der initialen Markierung konnte nur Molday ION Rhodamine B™ eine selektive und effiziente Zellmarkierung gewährleisten. Mit Endorem™ konnte eine selektive, jedoch keine ausreichend effiziente Zellmarkierung erreicht werden. Resovist® dagegen bewirkte zwar eine effiziente, aber sehr unselektive initiale Zellmarkierung: Mittels Preußisch Blau-Färbung wurde gezeigt, dass große Mengen von SPIO-Partikeln nur extrazellulär anhefteten. Die 3 verschiedenen SPIO-Produkte führten weiterhin zu unterschiedlich starken hypointensen MRT-Signalen der markierten MSC, welche im Verlauf der 3-wöchigen Versuchsdauer bei allen 3 Produkten stetig abnahmen. Unmarkierte MSC waren isointens, also mittels MRT nicht darstellbar und daher nicht nachverfolgbar. Stets verursachten Resovist®-markierte MSC das stärkste hypointense MRT-Signal, gefolgt von Molday ION Rhodamine B™ und Endorem™. Resovist®-markierte MSC konnten mittels MRT bei beiden Spezies über den längsten Zeitraum nachverfolgt werden (ovine MSC bis 16 Tage, equine MSC bis 23 Tage nach Markierung). Aufgrund der exzellenten initialen Markierungseigenschaften (hohe Markierungsselektivität und –effizienz sowie gute Nachverfolgbarkeit) eignet sich Molday ION Rhodamine B™ besonders gut für die SPIO-Markierung von MSC zur Nachverfolgung mittels MRT. Molday ION Rhodamine B™ verspricht somit eine erfolgreiche Anwendung in einem in vivo-Versuch zur magnetresonsztomographischen Nachverfolgung von MSC nach Applikation in arthrotische Gelenke. / Mesenchymal stem cells (MSC) are already used in clinical studies for treatment of different diseases. However, their mechanism of action and fate after application are still not fully understood. In vivo tracking of labeled MSC via magnetic resonance imaging (MRI) is a possible method to achive further knowledge. For this purpose MSC can be labelled with superparamagnetic iron oxide (SPIO) particles. For this study 3 different SPIO products were employed for labelling of ovine and equine MSC: Endorem™, Resovist®,, and Molday ION Rhodamine B™. The products were compared in terms of their influence on biologic behaviour of the MSC, their labelling efficiency, and selectivity. Furthermore, product specific magnetic resonance traceability of SPIO labelled MSC was evaluated. Final aim was the selection of the most suitable SPIO product to be used in an in vivo large animal study employing MRI tracking of SPIO labelled MSC after application into osteoarthritic joints. MSC therefore, were isolated from bone marrow of each 5 healthy sheep and horses, expanded up to passage 4 (p4), and labelled by the different SPIO products. Unlabelled MSC from the same animals served as control. Proliferation potential and tripotent differentiation capacities were assessed in vitro. For evaluation of labelling selectivity and efficiency of the SPIO products MSC were passaged weekly from p4 up to p7. Semiquantitative histological scoring based on Prussian blue staining and images using T2*w GRE sequences in a 0.5T MRI system were used. Labelling selectivity describes the intra- or extracellular localisation of the SPIO particles. Labelling efficiency describes the amount of intracellular SPIO particles. It was shown that ovine and equine MSC could be successfully labelled by all 3 evaluated SPIO products. The results of the in vitro experiments did not show differences between labelled and unlabelled MSC in terms of proliferation potential, adipogenic or osteogenic differentiation capacities. However, an inhibited chondrogenic differentiation capacity of SPIO labelled MSC was observed, which was dependend on the amount of intracellular SPIO particles and therefore, also on labelling efficiency. At the time of initial labelling, only Molday ION Rhodamine B™ showed selective and efficient cell labelling. With Endorem™ selective, but not efficient cell labelling was achieved. Resovist®, in contrast, caused efficient but very unselective initial cell labelling: By Prussian blue staining it was shown that large amounts of SPIO particles were attached extracellularly. These 3 different SPIO products led to variable hypointense MRI signals of the labelled MSC which decreased in all 3 products during the 3 week study period. Unlabelled MSC were isointense, thus not visible, and therefore, not traceable using MRI. At every point of time, Resovist® labelled MSC resulted in the most hypointense MR signals, followed by Molday ION Rhodamine B™ and Endorem™. Resovist® labelled MSC were traced over the longest time span (ovine MSC until 16 days, equine MSC until 23 days post labelling). Due to excellent initial labelling properties (high labelling efficiency and selectivity, good traceability) Molday ION Rhodamine B™ suits best for SPIO labelling of MSC to be tracked by MRI. Molday ION Rhodamine B™ therefore, promises a successful use in an in vivo study using MRI for MSC tracking after application into osteoarthritic joints.