Dans un avenir proche, les dispositifs de détection médicaux miniaturisés en temps réels (lab-on-chip) seront au centre de la révolution des méthodes de diagnostics médicaux et d’identification des processus biologiques et cela, autant au niveau clinique qu’au niveau de la recherche. Pour y arriver, il est important de développer des chimies de surface stables et spécifiques, ce qui demande une compréhension des interactions intermoléculaires à l’interface liquide/solide. Pour bien comprendre ces interactions, il est important de développer des instruments adaptés à la mesure près de l’interface liquide/solide des différentes caractéristiques à identifier. Ce projet de recherche présente la conception, la fabrication et les expériences tests d’un capteur multimodal pour l’identification de processus biologiques à l’interface basés sur des technologies de résonance des plasmons de surface (SPR) et de microcalorimérie. Ces deux technologies mises ensemble vont permettre d’effectuer des mesures de la cinétique des interactions ainsi que des caractéristiques thermodynamiques. En premier lieu, les caractéristiques d’une interaction intermoléculaire à l’interface d’une réaction d’hybridation d’ADN furent définies afin d’en déduire un cahier des charges pour les transducteurs. Suite à cela, la conception des transducteurs microcalorimétrique et SPR furent réalisés en tenant compte des contraintes de chacun des transducteurs. Suite à la conception théorique des différentes parties du capteur, un procédé de fabrication compatible avec les méthodes de fabrication standard de la microélectronique fut défini et testé. Afin de s’assurer de la fonctionnalité des dispositifs ainsi fabriqués, des tests de fonctionnalisation de surface furent appliqués sur les échantillons afin de tester la compatibilité du procédé de fonctionnalisation avec les méthodes de fabrication et avec une chimie de surface type. Pour terminer, un système de mélange actif fut testé et caractérisé avec le dispositif de microcalorimétrie afin de s’assurer qu’il était possible de mélanger les fluides avec les produits biologiques pour s’assurer de la qualité de la réaction de surface. Le système développé pourra être utilisé pour effectuer la mesure d’hybridation d’ADN à l’interface. Le système intègre deux modalités permettant la caractérisation en temps réel des interactions intermoléculaires à l’interface liquide/solide. Ce type de système permet la mesure de la cinétique de différents modèles biologiques tels que les puces à sucre encore certains récepteurs cellulaires ou la mesure de conformation moléculaire à l’interface. Des mesures d’oxydation du glucose catalysée par la glucose oxydase sont montrées. / To begin with, the characteristics of a DNA hybridization intermolecular interaction at the interface were defined in order to deduce the specifications for our transducers. Following this, the SPR and microcalorimetric transducer will be design by taking into account the constraints of each one. Following the theoretical design of the sensor, a manufacturing process compatible with standard methods of microelectronics manufacturing was tested and identified. To ensure the functionality of the devices, a test of surface functionalization on the sensor was applied to test the compatibility of the manufacturing process with the surface functionalization methods. Finally, a system of active mixing was tested and characterized with a microcalorimetric device to ensure it was possible to mix fluids with organic products to be sure of the quality of the surface reaction. The system developed can be used to mesure DNA hybridization at the interface. This system incorporates two modalities for real-time characterization of intermolecular interactions near the solid/liquid interface. This type of system allows the kinetic measurement of different biological models such as cellular receptors or it is possible to have some molecular measure conformation near the interface. Oxidation of glucose with the enzyme glucose oxidase was shown to present the possibility to measure a biological interaction.

A digoxina é um dos medicamentos indicados para o tratamento de falência cardíaca. Possui janela terapêutica estreita, sendo responsável por casos de intoxicação. O único antídoto disponível para a desintoxicação é o anticorpo policlonal DigiFab®, no formato Fab. O seu uso é eficaz, porém de custo elevado. Clones bacterianos produtores de fragmento Fab monoclonal anti-digoxina foram obtidos previamente pelo nosso grupo, pela técnica de phage display. Neste trabalho as variantes Fab dos 4 clones foram expressas em E.coli para estabelecer o método para a purificação. Com a obtenção dos fragmentos Fab purificados, foi caracterizada a sua afinidade ao antígeno e especificidade, em ensaios de inibição por digoxina, digitoxina, digoxigenina e ouabaina. Os parâmetros cinéticos da ligação dos fragmentos Fab dos 4 clones e do DigiFab® foram avaliados por SPR. Nas condições experimentais, não foram verificadas diferenças significativas entre os produtos dos 4 clones e o comercial, demonstrando o potencial dos fragmentos Fab monoclonais obtidos como antídoto à digoxina. / Digoxin is a medication indicated for heart failure treatment. Its therapeutic window is narrow, being responsible for intoxication cases. The only antidote available for the detoxification is a polyclonal antibody - DigiFab® in Fab format. Its use is effective, but costly. Bacterial clones producing anti-digoxin monoclonal Fab fragments were previously obtained by our group using phage display technology. In this work the Fab variants of the 4 clones were expressed in E.coli to establish the purification method. The purified fragments were characterized regarding the affinity to the antigen and the specificity through inhibition assays with digoxin, digitoxin, digoxigenin and ouabain. The binding kinetic parameters of Fab fragments of the 4 clones and the commercial product to Dig-BSA conjugate were assessed by SPR. Under the experimental conditions no significant differences were observed among the 4 clones and the commercial product, demonstrating the potential of monoclonal Fab fragments as an antidote to digoxin.

Recent experimentation with excitation of surface plasmons on a gold film in the Kretschmann configuration have shown what appears to be a superconductive effect. Researchers claimed to see the existence of electron pairing during scattering as well as magnetic field repulsion while twisting the polarization of the laser. In an attempt to explain this, they pointed to a combination of electron-electron scattering in external fields as well as dynamic screening via intense laser radiation. This paper expands upon the latter, taking a look at the properties of a dynamic polarization function, its effects on bulk and surface plasmon dispersion relations, and its various consequences.

Dans cette thèse, nous nous intéressons à la problématique de l’intégration de capteurs plasmoniques performants et bas coût sur des dispositifs de type smartphone, en vue d’applications de diagnostic biomédical. A cette fin, nous proposons deux biocapteurs « smart ». Premièrement, un système de détection colorimétrique à base de nanoparticules d’or est mis en œuvre pour détecter de l’ADN. Le système intègre une détection synchrone logicielle mise en œuvre au sein du smartphone, où les signaux physiques transitent par la voie audio. Le processus de diagnostic prend moins de 15 minutes pour une limite de détection de 0.77 nM, approximativement 6 fois meilleure que la sensibilité usuelle d’un spectromètre UV-Vis conventionnel, à temps de mesure identique. Dans une seconde partie, un capteur à résonance plasmon de surface en configuration de Kretschmann, se distinguant par une sensibilité à la phase optique, est développé. Le design monolithique et compact repose sur un interféromètre à dédoublement latéral et une modulation de phase. Le contrôle et la lecture du prototype s’effectue également par smartphone. La modulation de phase est de type sinusoïdale et une sensibilité importante est obtenue, autour de 2,3 10-6 RIU avec une dynamique de 7 10-3 RIU, chiffres obtenus pour une puce optique standard et un temps d’intégration de 100 ms. Ce second dispositif est ensuite testé pour la détection de protéines (Troponine I cardiaque), en fonctionnalisant la surface par ADN Tro4 / In this thesis, we investigate the possibility and potential for integration of portable optical biosensor for diagnostic purposes. To this end, we propose two “smart” biosensor systems. In the first part of this thesis, a DNA biosensor combining single-wavelength colorimetry and digital Lock-in Amplifier within a smartphone is proposed. Utilizing full advantage of audio channel and digital signal processing capacity of a smartphone, we have built a handheld DNA AuNp colorimetry biosensor. Based on the results, the diagnostic process takes only 15 minutes of reaction time while offering a limit of detection around 0.77 nM which is 6 times better than a desktop UV-Vis spectrometer.In second part of the thesis, a Shearing interferometer based Surface Plasmon Resonance (SiSPR) biosensor is proposed. SiSPR allows for phase sensitive detection on conventional Kretschmann configuration. Its monolithic design reduces optical parts, costs and allows portable application. The essence of SiSPR is a reflective layer in addition to plasmonic layer. To extract phase information from SiSPR, a sinusoidal phase modulation is achieved by modulation of the laser injection current. For a 100 ms measurement and a standard optical chip, the sensitivity of the SiSPR is around 2.3x10-6 RIU with a dynamic range of 7.0x10-3 RIU, which is better than amplitude SPR devices. Finally, Tro4 DNA surface modification on the SiSPR chip is demonstrated for future cardiac Troponin I diagnostic

Porézní anodická alumina (PAA) je oxidová vrstva vytvořená anodickou oxidací hliníku, která má široké průmyslné využití. Její popularita zaznamenala exponenciální nárůst zejména v oblasti nanotechnologií, k čemu přispělo objevení jejího samouspořádání do struktury o nanorozměrech připomínající včelí plástev. Její jednoduchá příprava a laditelné vlastnosti z ní tvoří levný způsob výroby nanostruktur. Ve stejném duchu se tato disertační práce zabývá metodami přípravy funkčních nanostruktur za využití PAA. První část je zaměřena na výrobu pole nanosloupců z oxidu titaničitého (TiO2) a jejich možné použití jako fotoanody pro štěpení vody. TiO2 nanostloupce jsou tvořeny anodizací hliníkové vrstvy na titanovém substrátu, také nazývanou PAA-asistovaná anodizace. Táto studie demonstruje elektrochemické vlastnosti a fotoelektrochemickou aktivitu nano sloupců vytvořených z dusíkem obohacených substrátů, které byly následně různě termálně modifikovány. Hlavním poznatkem studie je, že špatné vlastnosti jsou způsobeny dutou morfologií nanosloupců. Tento poznatek vedl k rozsáhle studii zabývající se dopadem anodizačných podmínek na morfologii ale i stabilitu vytvořených nanosloupců, jejímž výsledkem byla nová strategie anodizace. Druhá část prezentuje výrobní proces přípravy uspořádané vrstvy zlatých nanočástic na transparentním substrátu pro jejich použití jako optického senzoru využívající efekt rezonance lokalizovaných povrchových plasmonů. Základem této multidisciplinární metody je využití kombinace samouspořádání PAA k výrobě šablony a následného procesu řízeného smáčení v pevné fázi tenké vrstvy zlata. Táto práce detailně popisuje technologické aspekty přípravy; od samotné výroby šablon z hliníku, přes vytváření zlatých nanočástic, až po jejich přenos na transparentní substrát. Na závěr této práce jsou kompozity z nanočástic charakterizovány, přičemž je porovnána jejich citlivost na změnu indexu lomu okolí a jejich stálost. Ze závěrů vyplývá, že tato poměrně velkoplošná a levná metoda je konkurence schopná i v oblasti senzorické citlivosti.

The diploma thesis is aimed to excitation and detection of surface plasmon polaritons by visible light. First of all, we will briefly remind some basic principles like waves, electromagnetic wave, light on the interface and optical properties of metals. By using these principles we show presence of surface plasmon polaritons states. After the explanation of their properties there will be clearly visible reasons for aplications of the special excitationand detection methods. We will describe especially the prism coupling, periodic grating coupling and SNOM. Two last sections deal with computer simulations and experiments related to these methods. This means we can exemplify some knowledge presented in previous chapters. Results of simulations are compared with the experiment where we study the excitations of surface plasmon polaritons by periodic grating on aluminium surface.

The photocatalytic wastewater treatment facility presented in this thesis is a promising economic green technology that can degrade wastewater’s organic and ammonia pollutants, which produce environmentally sensitive products like CO2, H2O, Nitrates, etc. that can be captured and used in many biological and engineering ways. Previous advances used for this research was determining the importance of cleaning the photocatalytic nanocrystals, Fe-TiO2, as one of the revolutionary improvements that expose and maximizes the active surface of the photocatalytic nanocrystals to the pollutants enabling the strong oxidants produced by the absorption of a photon, excitation of an electron and positive hole to produce oxidants on the surface of the nanocrystals. The oxidants indiscriminately produce CO2 and H2O from living and non-living organic matter to obtain near ~100% clean water. This research focused on taking the next steps in the development of a wastewater cleaning facility tested in our laboratory. An important step involved coating Fe-TiO2 crystals onto flexible, strong, fiber-glass cloth using a sol-gel processing method. Success was found in this research by applying the coated fiberglass cloth into a photoreactor aimed to clean a large amount of water rather than the laboratory scale. / Graduate

In der medizinischen Diagnostik, Bioverfahrenstechnik und Umwelttechnik besteht ein steigender Bedarf an kompakten Analysegeräten für die schnelle Vor-Ort-Detektion spezifischer biochemischer Substanzen. Im Rahmen der Arbeit wurde daher ein neuartiger faseroptischer Sensor entwickelt, der in der Lage ist kleinste Brechzahländerungen, z.B. durch molekulare Bindungsprozesse, zu detektieren. Die hohe Empfindlichkeit an der vergoldeten Spitze der Sensorfaser beruht auf der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) einer einzelnen Mantelmode, die durch ein langperiodisches Fasergitter (LPG) ermöglicht wird. Die Übertragungsfunktion des Sensors wurde unter Verwendung eines Schichtwellenleitermodells schnell und präzise modelliert. Es konnte gezeigt werden, dass in einem wässrigen Umgebungsmedium die höchste Empfindlichkeit im Spektralbereich um 660 nm unter Annahme einer rund 35~nm dicken und 2~mm langen Goldbeschichtung erreicht wird. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass mit einer intermediale Schicht aus Cadmiumsulfid die SPR der Mantelmode in einen höheren Spektralbereich verschoben und damit die Empfindlichkeit deutlich verbessert werden kann. Um eine geringe Polarisationsabhängigkeit des Sensors sicherzustellen, wurde ein nasschemisches Abscheidungsverfahren für die allseitige Goldbeschichtung der Sensorfaser entwickelt. Die spezifischen optischen Eigenschaften dieser Abscheidungen wurden mit Hilfe von LPGs untersucht, die durch eine spezielle UV-Belichtung hergestellt wurden. Die Experimente ergaben, dass die komplexe Permittivität nasschemischer Abscheidungen mit Schichtdicken oberhalb von 50~nm mit aufgedampften Goldschichten vergleichbar ist. Die Verluste der adressierten Mantelmoden wurden mit einer äquivalenten Sensoranordnung aus zwei identischen LPG untersucht. Dabei konnte ein Skalierfaktor abgeleitet werden, der die effiziente Berechnung der Mantelmodendämpfung erlaubt. Es wurde nachgewiesen, dass die Brechzahlauflösung etablierter volumenoptischer SPR-Sensoren mit einer einfachen Transmissionsmessung an einer geeigneten Wellenlänge erreicht werden kann. Die äußerst kompakte Sensorfläche des faseroptischen Sensors ermöglicht darüber hinaus die Untersuchung deutlich kleinerer Probenvolumina ohne ein zusätzliches mikrofluidisches System zu benötigen. Es wurde gezeigt, dass sekundäre Brechzahländerungen aufgrund von Temperaturschwankungen oder unspezifische Ablagerungen durch eine differentielle Auswertung zweier identischer Sensoren kompensiert werden können. Die verbleibende Querempfindlichkeit wird durch die Polarisationsabhängigkeit der Sensoren bestimmt. Die geringste Querempfindlichkeit konnte daher mit einer homogenen nasschemischen abgeschiedenen Sensorfläche nachgewiesen werden. / Compact analysis devices which facilitate the rapid detection of specific biochemical substances are in increasing demand in the fields of point-of-care medical diagnostics, bioprocess engineering and environmental engineering. The aim of this work was therefore to design a novel fiber-optic sensor able to detect small refractive index changes such as those caused by molecular binding processes. The high level of sensitivity at the gold-plated tip of the sensor fiber stems from the surface plasmon resonance (SPR) of a single cladding mode, which is the result of a long-period fiber grating (LPG). The transfer function of the sensor was calculated quickly and accurately using a slab waveguide model. It was observed that the highest level of sensitivity in an aqueous ambient medium is achieved at a wavelength of 660 nm assuming a gold coating of 35 nm in thickness and 2 mm in length. Furthermore, it was demonstrated that an intermedial cadmium sulfide layer shifts the SPR of the cladding mode towards higher wavelengths, thus leading to significantly enhanced sensitivity. An electroless plating process for the omnidirectional deposition of gold on the sensor fiber was developed in order to minimize the sensor\'s dependency on polarization. The specific optical properties of the gold layer deposited were investigated with the aid of LPGs fabricated using a special UV exposure method. The experiments showed the complex permittivity of electroless platings with a thickness of over 50 nm to be comparable with that of evaporated gold layers. The losses of the addressed cladding modes were investigated using an equivalent sensor setup consisting of two identical LPGs. This facilitated the determination of a scaling factor enabling the effcient calculation of cladding mode attenuation. It was demonstrated that it is possible to obtain the refractive index resolution of established volume optical SPR sensors with the aid of simple transmission measurements at a specific wavelength. Moreover, the extremely compact sensing area of the fiber-optic sensor enables the investigation of smaller sample volumes without the need for an additional microfluidic system. Secondary refractive index changes caused by temperature fluctuations or unspecific binding events can be compensated for by means of the differential interrogation of two identical fiber-optic sensors. The residual cross sensitivity is determined by the polarisation dependency of the sensor. The lowest cross sensitivity was therefore demonstrated in combination with a homogeneous electroless plated sensor surface.

OF THE DOCTORAL THESIS Title: Functional biomolecular coatings for affinity biosensors for medical diagnostics Author: Erika Hemmerová Department: Institute of Photonics and Electronics of the Czech Academy of Sciences Chaberská 1014/57, 182 51 Prague, Czech Republic Supervisor: Prof. Ing. Jiří Homola, CSc., DSc. Institute of Photonics and Electronics of the Czech Academy of Sciences Chaberská 1014/57, 182 51 Prague, Czech Republic Abstract: Detection and identification of diseases in their early stages represents one of the major goals of the contemporary medical diagnostics. This need drives a research of biomolecular processes behind the particular diseases and development of analytical devices for routine and long-term monitoring of the individuals' health. Surface plasmon resonance biosensors (SPR) have potential to contribute to addressing both of these challenges. This work aims at advancing multiple aspects of SPR biosensor method. It involves study and optimization of selected functional biomolecular coatings in order to improve the performance characteristics of SPR biosensors. It demonstrates utilization of these coatings in novel detection platforms for sensitive monitoring of multiple analytes, and in research of selected biomolecular interactions related to Alzheimer's disease. The...

Ligandgesteuerte Ionenkanäle sind Membranproteine, die an der Weiterleitung von Reizen und an der Kommunikation zwischen Zellen beteiligt sind. Große Bedeutung besitzt die Messung der Aktivierung der Ionenkanäle beispielsweise in der Medizin (z.B. Ionenkanalerkrankungen), der Pharmazie (z.B. Medikamenten-Screening) und in der Bionanotechnologie (z.B. molekulare Schalter). In all diesen Gebieten besteht die Forderung nach hohen Probendurchsätzen bei sehr hohem Informationsgehalt. Etablierte elektrochemische Detektionsmethoden erfüllen diese Forderung nicht. Um dieses Defizit zu überwinden, wurde ein Ionenkanalsensor-Array mit optischer, paralleler Detektion entwickelt. Eine mikrostrukturierte Polymethyl(meth)acrylat (PMMA)-Schicht dient als Grundgerüst des Arrays. Über die Mikroporen, die nur wenige Mikrometer Durchmesser aufweisen, wird eine Lipidmembran gespannt, in die Ionenkanäle eingebaut werden. Wird der Ionenkanal aktiviert, strömen Ionen in die Mikroporen und führen zu einer messbaren Veränderung des Brechungsindexes. Mittels Oberflächenplasmonen-Resonanz Imaging lässt sich die Aktivierung der Ionenkanäle markierungsfrei und direkt bestimmen. Stabile, die Mikrostruktur überspannende Lipidmembranen wurden durch eine neu entwickelte Stempeltechnik und durch eine Oberflächenmodifikation der PMMA-Mikrostruktur erzielt. Für die Charakterisierung und den Funktionsnachweis des Sensoraufbaus wurden das infrarot-spektroskopische Imaging und die Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt. Schließlich konnte gezeigt werden, dass eine Verbesserung der Empfindlichkeit durch das lokale Aufkonzentrieren der durch den Ionenkanal geströmten Metallionen am Porengrund mit oberflächengebundener 2-(Benzylsulfid)-18-Krone-6 möglich ist.