Thèse doctorat : Bioinformatique : Villeurbanne, INSA : 2004. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 273-306. Publications de l'auteur p. 269-270.

Thèse doctorat : Biologie forestière : Nancy 1 : 2005. / Titre provenant de l'écran-titre.

Proefschrift Universiteit van Amsterdam. / Met bibliogr., lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands en Portugees.

Würzburg, Univ., Diss., 2009. / Zsfassung in engl. Sprache.

Universiẗat, Diss., 2003--Köln.

Techn. Universiẗat, Diss., 2005--Berlin.

Titre de l'écran-titre (visionné le 23 mai 2023) / La découverte de la co-dépendance entre les communautés de microorganismes symbiotiques et leurs hôtes eucaryotes a redéfini l'unité biologique soumise à l'action des forces évolutives, à « l'ensemble de l'hôte et son microbiote symbiotique », appelé holobionte. Les holobiontes aquatiques sont retrouvés dans une multitude d'environnements extrêmes sur Terre, allant des sources d'eau chaude, aux profondeurs océaniques, aux calottes polaires, jusqu'aux cours d'eau contaminés par les métaux lourds. De plus en plus d'études montrent que l'établissement d'associations symbiotiques avec des microbes a permis à la diversité animale de se développer dans ces environnements hostiles. Les Poissons, retrouvés dans une étonnante diversité d'environnements contrastés, constituent d'excellents modèles pour comprendre la nature des symbioses hôte-microbiote, tant en termes de composition des communautés impliquées, que d'identification des facteurs environnementaux et génétiques qui modulent leurs interactions avec l'organisme hôte. Au contraire des microbiotes humains, nos connaissances sur le microbiote des Poissons en sont à leurs tous débuts. De manière générale, le projet de thèse visait à mieux comprendre l'influence des facteurs modulant les communautés bactériennes chez les Poissons, ainsi qu'à détailler la nature de l'interaction symbiotique existant entre ces communautés et leurs hôtes. Pour y parvenir, nous avons utilisé une approche holistique qui s'intéressait aux différentes composantes modulant les interactions hôte-microbiote chez différentes espèces de poissons amazoniens. Premièrement, nous avons caractérisé la composition et les facteurs environnementaux qui altèrent le bactérioplancton amazonien, ce dernier représentant la source principale de bactéries recrutées par les poissons. Un échantillonnage de bactérioplancton au sein d'un gradient physicochimique de 15 sites naturels a montré que les communautés bactériennes environnementales varient en composition et en activité selon le type d'environnement échantillonné, les Betaprotéobactéries dégradant le carbone humique étant particulièrement abondantes en eau noire, un milieu acide et pauvre en ions. Deuxièmement, nous avons tenté d'évaluer l'effet du génotype de l'hôte sur le recrutement du microbiote chez les poissons amazoniens, afin de déterminer s'il s'agit d'un facteur significatif pouvant moduler le microbiote des Poissons. Suite à la caractérisation du génotype et du microbiote bactérien de quatre espèces de piranha génétiquement proches, nous avons montré l'existence de corrélations significatives entre le génotype de l'hôte et la structure de son microbiote cutané, ce qui n'était pas le cas pour le microbiote intestinal. Par la suite, nous avons profité des particularités d'un système d'étude unique en Amazonie, où on observe un découplage génotype X environnement, afin de quantifier les contributions respectives du génotype du poisson-hôte, des paramètres physicochimiques environnementaux et de la composition du bactérioplancton à la composition du microbiote branchial, représentant une des communautés microbiennes icthyienne la plus exposée à l'environnement. Pour se faire, nous avons mené une étude comparative sur plusieurs populations génétiques de poissons échantillonnées dans des types d'eau ayant des profils physicochimiques contrastés, et avons montré que le recrutement des souches bactériennes environnementales dépend davantage de la composition de l'assemblage bactérien planctonique, que du génotype du poisson-hôte. Finalement, nous avons étudié la nature des interactions poisson-microbiote en milieu extrême, en tentant de comprendre si des fonctions bactériennes des symbiotes branchiaux sont essentielles à la survie des poissons en eau noire, un milieu acide et pauvre en ions imposant d'importants défis physiologiques pour les poissons résidents. La caractérisation simultanée du transcriptome de l'organisme hôte et de sa communauté microbienne chez quatre espèces de Poissons, collectées le long d'un gradient physicochimique comprenant plusieurs sites d'eau noire, suggère que les bactéries branchiales jouent des rôles essentiels dans la régulation des processus d'ionorégulation de l'hôte. Par exemple, l'expression de plusieurs systèmes de transport transmembranaire d'ions n'était observée qu'en cas de surexpression de certaines Betaprotéobactéries connues pour moduler la perméabilité membranaire eucaryote. La contribution du bactérioplancton dans cette interaction a été étudiée davantage par l'implantation d'un modèle de poissons axéniques (stériles) exposés à ce même gradient physico-chimique amazonien, mais dans différents environnements stériles/non stériles en laboratoire. Les résultats de cette dernière expérience ont révélé que les bactéries autochtones/endémiques de l'eau noire d'Amazonie jouent un rôle crucial dans la survie des poissons dans ce type d'eau, puisque l'absence de celles-ci provoque une mort rapide. En conclusion, ce projet de thèse contribue à démontrer l'importance de considérer le microbiote de l'hôte, tout comme le microbiote environnemental, dans les études concernant l'évolution et l'écologie des Poissons. / The discovery of the codependency between communities of symbiotic microorganisms and their eukaryotic hosts has redefined the biological unit subject to the action of evolutionary pressures, from the hosts only, to the hosts and their symbiotic microbiota, known as "holobionts". Aquatic holobionts are found in a multitude of extreme environments on Earth, including hot springs, deep oceans, icy waters of Antarctica, and streams contaminated with heavy metals. More and more studies show that in these hostile environments, it is through the establishment of symbiotic associations with microbes that animal diversity has been able to develop. Fish, which are found in an astonishing diversity of contrasting environments, constitute excellent models for understanding the nature of host-microbiota symbiosis, the composition of the communities involved, as well as the environmental and genetic factors that modulate their interactions with their host organisms. Unlike human microbiota, our knowledge of the fish microbiota is still in its infancy. In general, this thesis project aimed to better understand the influence of factors modulating fish bacterial communities, as well as to detail the nature of the symbiotic interaction existing between these communities and their hosts. To achieve this, we used a holistic approach that focused on the many components modulating host-microbiota interactions in different Amazonian fish species. Firstly, we characterized the composition and the environmental factors that alter Amazonian bacterioplankton, the latter representing the main source of bacteria recruited by fish. A sampling of bacterioplankton within a physicochemical gradient of 15 natural sites showed that environmental bacterial communities vary in composition and activity depending on the type of environment sampled, with humic-carbon-degrading Betaproteobacteria being particularly abundant in black water, an acidic and ion-poor environment. Secondly, we attempted to assess the effect of the host genotype on microbiota recruitment in Amazonian fish, to determine if it is a significant factor that can modulate fish microbiota. Following the characterization of the genotype and bacterial microbiota of four genetically similar piranha species, we evidenced the existence of significant correlations between the host genotype and the structure of fish skin microbiota, which was not the case for the gut microbiota. Subsequently, we took advantage of a unique study system in Amazonia, where fish genotype X environment decoupling is observed, in order to quantify the respective contributions of the fish host genotype, physicochemical parameters and bacterioplankton community composition in shaping the composition of the gill microbiota, one of the most environmentally-exposed community on fish hosts. To do this, we conducted a comparative study on several genetic populations of fish sampled in water types with contrasting physicochemical profiles, and showed that the recruitment of environmental bacterial strains depends more on the composition of the planktonic bacterial assembly, than on the genotype of the host fish. Finally, we studied the nature of fish-microbiota interactions in extreme environments, trying to understand whether there are bacterial functions expressed by symbiotic gill bacteria, that are essential for fish survival in black water, an acidic and ion-poor environment imposing significant physiological challenges for resident fish. The simultaneous characterization of the host gill and microbiota transcriptome of four fish species, collected along a physicochemical gradient including multiple blackwater sites, suggests that gill bacteria play essential roles in regulating host ionoregulatory processes. For example, the host expression of several transmembrane ion transport systems was only observed concurrently with the overexpression of specific Betaproteobacteria known to modulate eukaryotic membrane permeability. The contribution of bacterioplankton in this interaction was further studied by implementing an axenic (sterile) fish model exposed to this same Amazonian physico-chemical gradient, but in different sterile/non-sterile environments in the laboratory. The results of this latest experiment revealed that autochthonous/endemic Amazonian blackwater bacteria play key roles in the survival of fish in this water type, such that when hosts are devoid of bacteria, they do not survive in such an environment. In conclusion, this thesis project contributes to highlight the importance of considering the host microbiota, as well as the environmental microbiota, in studies concerning fish evolution and ecology.

Ameisen der Gattung Camponotus beherbergen bakterielle Symbionten der Gattung Blochmannia in spezialisierten Zellen des Mitteldarms (Blochmann, 1882; Buchner, 1965; Sauer, 2000; Schröder et al., 1996). Die Genomsequenzierung dieser Symbionten zeigte, dass Blochmannia, ähnlich den Symbionten von Blattläusen, hauptsächlich Gene der Aminosäurebiosynthese beibehalten hat (Degnan et al., 2005; Gil et al., 2003). Die Relevanz dieser nahrungsaufwertenden Funktion konnte experimentell bestätigt werden (Feldhaar et al., 2007). Ein Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Aufklärung der dynamischen Interaktion der beiden Partner während des komplexen Lebenszyklus des holometabolen Wirtes. Frühere Studien deuteten darauf hin, dass die Symbiose vor allem während der Larven- und Puppenphasen von Bedeutung sein könnte (Feldhaar et al., 2007; Wolschin et al., 2004; Zientz et al., 2006). Mit fluoreszenter in situ Hybridisierung (FISH) und konfokaler Laserscanning Mikroskopie konnte in der vorliegenden Arbeit die Lokalisierung von B. floridanus während der wichtigsten Entwicklungsstadien aufgeklärt werden. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Symbionten schon im ersten Larvenstadium in spezialisierten Zellen um den Darm angeordnet sind, aber in späteren Stadien nicht, wie bisher angenommen, auf diese Bakteriozyten beschränkt sind, sondern bis zum Schlupf der jungen Arbeiterinnen massiv andere Darmzellen infizieren. Übereinstimmend mit Bestimmungen der Zellzahl in den verschiedenen Wirtsstadien ist die Anzahl der Symbionten gegen Ende der Metamorphose am höchsten. Die Symbiose degeneriert in sehr alten Arbeiterinnen, gut gefüllte Bakteriozyten werden jedoch noch monatelang beibehalten. Mit Macroarray- und qRT- PCR- basierten Transkriptomanalysen wurde die Expression der bakteriellen Gene in charakteristischen Entwicklungsstadien des Wirtes untersucht. Allgemein zeigen vor allem Gene für molekulare Chaperons und bestimmte bakterielle Grundfunktionen eine hohe Expression. Aber auch viele Gene, die möglicherweise wichtige Funktionen in der Symbiose besitzen, wie die Biosynthese essentieller Aminosäuren und das Recycling von Stickstoffverbindungen, zeigen ein hohes absolutes Transkriptlevel. Zudem besteht eine positive Korrelation zwischen dem Expressionsniveau und dem GC- Gehalt der Gene, die in dem höheren Selektionsdruck und damit einer geringeren Mutationsrate der essentiellen Gene begründet liegt (Schaber et al., 2005). Durch Proteinanalysen konnte bestätigt werden, dass die Faktoren mit der höchsten absoluten Transkription die dominanten Proteine der Symbionten darstellen. In den unterschiedlichen Entwicklungsstadien zeigen viele Gene eine deutliche Dynamik, deren Ausmaß aber, verglichen mit freilebenden Bakterien, gering ist. Aus den Expressionsprofilen aufeinanderfolgender Gene lassen sich mögliche Transkriptionseinheiten ableiten, die teilweise auch experimentell bestätigt wurden. Oftmals zeigen auch Gene, die nicht in Transkriptionseinheiten angeordnet sind, aber verwandten Stoffwechselwegen angehören, ähnliche Muster. Dies deutet auf das Vorhandensein grundlegender Genregulations-mechanismen hin, obwohl im Genom von B. floridanus nur noch sehr wenige Transkriptionsfaktoren codiert sind (Gil et al., 2003). Auf übergeordneter Ebene zeigt sich, dass bei Symbionten aus späten Puppenstadien viele symbioserelevante Gene im Vergleich zu Genen des Grundmetabolismus eine erhöhte Expression zeigen. Dies betrifft besonders die Biosynthese aromatischer und verzweigter Aminosäuren, die in diesen Stadien vom Wirt in hoher Menge benötigt werden, während die internen Reserven gleichzeitig zur Neige gehen. Dies äußert sich auch im deutlichen Abfallen der Speicherproteinmenge des Wirts gegen Ende der Puppenphase. Die festgestellte Veränderung der Symbiontenzahl übertrifft das geringe Ausmaß der Genregulation um ein Vielfaches. Die Bakterien liegen in jedem Stadium polyploid mit bis zu 100 Genomkopien vor, dieser Polyploidiegrad bleibt jedoch während der gesamten Wirtsentwicklung weitestgehend konstant. Somit scheint die Kontrolle des Wirts über die bakterielle Vermehrung der entscheidende Faktor dieser Symbiose zu sein. Die verbleibenden regulatorischen Fähigkeiten der Bakterien stellen möglicherweise eine Feinjustierung von optimierten Produktionseinheiten dar, deren Anzahl nach den Bedürfnissen des Wirtes verändert wird. Insgesamt konnten in der vorliegenden Arbeit neue Einblicke in das komplexe Zusammenleben von Blochmannia und Camponotus gewonnen werden, die zu einem besseren Verständnis der biologischen Funktion und der grundlegenden Mechanismen dieser Symbiose führen. Eine der wichtigsten Fragestellungen nach dem Sinn einer nahrungsaufwertenden Symbiose für einen Nahrungsgeneralisten konnte mit starken Hinweisen auf eine stadienabhängige Relevanz der Symbiose beantwortet werden, die den enormen evolutionären Erfolg dieser Ameisengattung erklären könnte.  / Ants of the genus Camponotus harbor bacterial endosymbionts of the genus Blochmannia in specialized cells of their midgut (Blochmann, 1882; Buchner, 1965; Sauer, 2000; Schröder et al., 1996). The complete sequencing of the symbiont’s genome revealed, that Blochmannia, comparable to the symbionts of aphids, mainly retained genes involved in the biosynthesis of essential amino acids (Degnan et al., 2005; Gil et al., 2003). The biological relevance of a nutritional upgrading by Blochmannia could be confirmed experimentally (Feldhaar et al., 2007). One focus of this thesis was the elucidation of the dynamic interactions between the two partners during the complex life cycle of the holometabolic host animal. Previous studies pointed towards a temporal relevance of this symbiosis especially during larval and pupal development (Feldhaar et al., 2007; Wolschin et al., 2004; Zientz et al., 2006). In this thesis the localization of B. floridanus could be documented throughout all life stages of the host by fluorescent in situ hybridization (FISH) and confocal laser scanning microscopy. A layer of densely filled bacteriocytes surrounding the gut could already be identified in first instar larvae. In contrast to previous assumptions, the bacteria are not restricted to these cells in later stages, as until the eclosion of the young adult workers bacteria massively infect other midgut cells. Concordant with previous findings, bacterial load is highest at the end of metamorphosis and symbiont numbers decrease in older workers, yet densely filled bacteriocytes are still visible after several months. The expression of the bacterial genes during characteristic life stages of the C. floridanus was assessed by macroarray and qRT- PCR- based experiments. In general, especially molecular chaperones, central basic metabolism and may putative symbiosis related factors like pathways leading to essential amino acids or nitrogen recycling show highest absolute expression levels. A positive correlation between expression level and GC- content of the genes can be observed, which is caused by a higher selection pressure and lower mutation rate of these essential factors (Schaber et al., 2005). Protein analyses confirmed the correlation between gene expression and translation of the most abundant factors. Many B. floridanus genes exhibit a dynamic expression during the different host stages but the extent of this gene regulation is modest as compared to free living bacteria. Expression profiles of genes located next to each other on the genome allow proposal of local transcription units, which were confirmed experimentally in several cases. Often genes that are not clustered locally but belong to related metabolic functions also exhibit similar expression patterns. This indicates the existence of basic mechanisms of gene regulation despite the low number of transcription factors annotated in the B. floridanus genome (Gil et al., 2003). In late pupal stages symbiosis related genes often show a higher expression compared to basic metabolic functions. This especially includes biosynthetic pathways for aromatic and branched amino acids, which are needed by the host at this stage in increased amounts, while internal storages are depleted. This could be demonstrated by the significant decrease in storage proteins of the host at the end of the pupal phase. The observed change in bacterial numbers per host exceeds the extent of bacterial gene regulation by far. The symbionts are polyploid in each host stage with up to 100 genome copies per cell. The degree of polyploidy is largely constant during host development. Thus the control over bacterial reproduction seems to be the decisive factor in this symbiosis. The residual regulatory capacities of the symbionts might represent a mechanism of fine tuning of a production unit that has been streamlined by evolution and whose numbers are adjusted according to the host’s needs. In conclusion, this thesis delivers new insights into the complex symbiosis of Blochmannia and Camponotus leading to a better understanding of its biological function and the underlying mechanisms. One of the central mysteries concerning the need of a symbiont for nutritional upgrading for an omnivorous host could be explained by a temporal, stage- dependent relevance of this symbiosis, possibly being the reason for the enormous evolutionary success of this ant genus.

Thesis--Leyden. / In Periodical Room.

Les endosymbioses racinaires sont des associations bénéfiques établies entre les racines des plantes et des micro-organismes du sol. Ces symbioses ont un intérêt agronomique et écologique puisque les plantes fournissent à leurs partenaires microbiens une niche écologique et des sucres issus de la photosynthèse et en retour, les micro-organismes associés aux racines vont fournir à la plante des nutriments minéraux qui sont actuellement apportés dans l’agriculture conventionnelle sous forme d’engrais. Durant ma thèse, j’ai particulièrement étudié la symbiose endomycorhizienne à arbuscules (AMS). Elle implique des champignons du groupe des Gloméromycètes et plus de 80 % des plantes terrestres. Ainsi cette symbiose est la plus répandue sur terre connue à l’heure actuelle. Plusieurs étapes importantes pour l’établissement de l’AMS ont été définies. La première de ces étapes est la reconnaissance mutuelle entre le champignon endomycorhizien et la plante hôte. Le champignon est capable de percevoir les plantes par les exsudats racinaires qu’elles sécrètent dans la rhizosphère. Dans le mélange complexe de molécules que sont les exsudats racinaires, des phytohormones appelées strigolactones activent le métabolisme des champignons endomycorhizien, la ramification des leurs hyphes et la production de molécules fongiques appelée facteurs Myc. La perception des facteurs Myc par la plante active des processus permettant la colonisation des racines par le champignon. Ce dialogue moléculaire entre champignons endomycorhiziens et plantes hôtes reste toutefois méconnu. Des molécules de type Lipo-chitooligosaccharides (LCO) ou chito-oligosaccharides (CO) ont été identifiées dans les exsudats de spores ou d’hyphes de champignons et activent la voie de signalisation symbiotique chez les plantes mais leurs rôles respectifs dans l’établissement de l’AMS restent mal compris. Du côté de la plante, des récepteurs potentiels aux LCOs et aux COs sont codés par les gènes de la famille des Lysin Motif Receptor-Like Kinase (LysM-RLK) qui sont capables de lier les constituants structuraux des LCOs et des COs. Cependant aucune preuve n’avait été apportée, au commencement de ma thèse, permettant de conclure sur le rôle des LCOs, des COs, et des LysM-RLKs dans la mise en place de l’AMS. C’est ce que je me suis attachée à démontrer durant ma thèse. Pour cela, j’ai travaillé sur une dicotylédone (la tomate : Solanum lycopersicum) et sur une monocotylédone (Brachypodium distachyon, un modèle pour le blé). Pour identifier les récepteurs aux LCOs dans ces plantes et déterminer leur rôle dans l’AMS nous avons mis en place des techniques de génétique inverse. Nous avons ensuite déterminé l’affinité de ces récepteurs pour les LCOs. Ainsi, nous avons montré que la perception des LCOs dans la tomate est importante pour la mise en place de l’AMS. Par ailleurs, je me suis intéressée à la symbiose entre des bactéries du type rhizobium et des plantes principalement de la famille des légumineuses. La mise en place de cette symbiose nécessite la synthèse de LCOs par les rhizobia et leur perception par la plante via des récepteurs de la famille des LysM-RLKs. Ces similarités que la symbiose rhizobium-légumineuses partage avec l’AMS nous ont conduits à poser la question de savoir si les récepteurs de LCOs impliqués dans l’AMS (beaucoup plus ancienne que la symbiose rhizobium-légumineuse) ont été recrutés durant l’évolution pour jouer un rôle dans la symbiose rhizobium-légumineuse. J’ai pu montrer que les récepteurs de LCOs impliqués dans l’AMS chez les espèces non-légumineuses susmentionnées sont fonctionnels l’établissement de la symbiose rhizobium-légumineuse chez une légumineuse. / Root endosymbioses are beneficial associations established between plant roots and soil microorganisms. These symbioses have an agronomic and ecological interest as plants provide their microbial partners with an ecological niche and carbohydrates from photosynthesis. In return, the root-associated microorganisms provide the plant with minerals that are currently being delivered in conventional agriculture as fertilizers. During my thesis, I particularly studied the arbuscular mycorrhizal symbiosis (AMS). It involves fungi of the Glomeromycota group and more than 80 % of land plants. This is the currently known most widespread symbiosis on earth. Important steps for the AMS establishment have been defined. The first step is the mutual recognition between the endomycorrhizal fungus and the host plant. Fungi can perceive plants through the root exudates. In the complex mixture of molecules in the root exudates, phytohormones called strigolactones activate the endomycorrhizal fungal metabolism, the branching of their hyphae and the production of fungal molecules called Myc-Factors. Myc-Factors are perceived by the plant and activate a signaling pathway allowing root colonization by the fungus. However, parts of the molecular dialogue between endomycorrhizal fungi and host plants remain unknown. Lipo-chitooligosaccharide (LCO) or chito-oligosaccharides (CO) molecules have been found in exudates of fungal spores or hyphae and were shown to activate the plant symbiotic signaling pathway, however their respective roles in the AMS establishment are unclear. Putative plant receptors for LCOs and COs are encoded by genes from the Lysin Motif Receptor-Like Kinase family (LysM-RLK) which are able of binding the structural LCO and CO components. However, at the beginning of my PhD, we had no evidence allowing to conclude about the involvement of LCOs, COs, or LysM-RLKs in the AMS establishment. During my thesis, I aimed to understand the role the LCOs and their plant receptors in AMS. For this, I used on a dicotyledon (the tomato: Solanum lycopersicum) and on a monocotyledon (Brachypodium distachyon that is a model for wheat). In order to identify the LCO receptors in these two species, I used a reverse genetic approach. Then I determined these receptors affinity for various LCO structures. I showed that in tomato, LCO perception is important for AMS establishment. In addition, I have studied the symbiosis between rhizobium-type bacteria and plants of the legume family. Interestingly, the establishment of this symbiosis requires LCO synthesis by rhizobia and LCO perception by the plant via receptors of the LysM-RLK family. The fact that rhizobium-legume symbiosis shares similarities with the AMS led us to ask whether the LCO receptors involved in AMS (a much more ancient symbiosis than the rhizobium-legume symbiosis) have been recruited during evolution for a role in the rhizobium-legume symbiosis. I demonstrated that the LysM-RLKs involved in AMS in the above mentioned non-legume species are functional for the rhizobium-legumes establishment in a legume species.