L'objectif de cette thèse est l'étude par la technologie des puces à ADN, du transcriptome de la bactérie Buchnera aphidicola, qui vit en symbiose avec le puceron du pois Acyrthosiphon pisum. Le génome extrêmement réduit de Buchnera a perdu l'essentiel de ses gènes de régulation, mais conserve les voies de biosynthèse permettant la production des acides aminés essentiels pour son hôte. La première partie de cette thèse concerne le développement du logiciel ROSO, qui permet de déterminer les sondes oligonucléotidiques destinées aux puces. Une interface a été conçue pour son utilisation en ligne (http://pbil.univ-lyon1.fr/roso). Dans une seconde partie, la conception et l'utilisation d'une puce dédiée à Buchnera ont permis d'étudier le transcriptome de la bactérie, lorsque son hôte subit un stress nutritionnel et osmotique. Cette analyse montre que Buchnera est capable de réguler son expression génique et de réorienter son métabolisme, pour répondre à la demande changeante de son hôte.

Les nématodes entomopathogènes Steinernema sont associés symbiotiquement à des bactéries du genre Xenorhabdus. Leur cycle de vie comprend deux phases : une phase libre, dans le sol, où les nématodes portent leurs symbiotes dans le tube digestif, et une phase parasite, dans l'insecte, où les deux partenaires se multiplient côte à côte. Le bilan fin de l'interaction, globalement bénéfique pour les deux partenaires, a été peu étudié pour le moment. Dans un premier temps, nous avons abordé ces symbioses d'un point de vue coûts-bénéfices pour le nématode afin d'identifier les pressions de sélection agissant sur son investissement dans la symbiose. Nous montrons que l'association est à la fois bénéfique (reproduction en phase parasitaire) et coûteuse (mortalité en phase libre) pour le nématode, en proportion de sa charge symbiotique. Ces corrélations engendrent un compromis survie-reproduction pour le nématode, médié par ses symbiotes. Selon les conditions environnementales, elles pourraient éventuellement déstabiliser l'association, et, notamment, altérer sa spécificité. Dans un second temps, nous avons donc exploré la spécificité de ces associations dans la nature et au laboratoire. Lors d'un échantillonage de terrain, nous avons retrouvé la spécificité de ces associations largement décrite par ailleurs. Au laboratoire, la réassociation expérimentale entre nématodes et bactéries non natives montre que le spectre des bactéries retenues est plus étroit que le spectre des bactéries bénéfiques. De plus, des différences de modalités d'association apparaissent entre espèces de nématodes, qui suggèrent que la correspondance nématode - bactérie ne serait pas aussi stricte que prévu.

Les progrès fulgurants de ces dix dernières années réalisés dans les domaines de la microinformatique et de la microfluidique associés au génie génétique (PCR et séquençage) ont permis un changement d'échelle dans la quantité des données acquises au cours d'une même expérience. La transcriptomique est directement issue de ces avancées technologiques. Ce mémoire présenté pour l'obtention d'une Habilitation à Diriger des Recherdes porte sur l'analyse du transcriptome de la bactérie intracellulaire obligatoire des pucerons, Buchnera aphidicola. Dans la première partie, les principales méthodes d'analyses statistiques différentielles et d'intégration des données transcriptomiques sont présentées sous la forme d'une analyse bibliographique. La deuxième partie est consacrée au développement d'outils bioinformatiques : ROSO, un logiciel d'optimisation des sondes oligonucléotidiques, la puce Buchnera et SITRANS, un système d'information pour la gestion et la publication des données d'expression. Enfin, la dernière partie est consacrée à la caractérisation du transcriptome de Buchnera en condition de stress trophique de son hôte, le puceron du pois Acyrthosiphon pisum. La régulation transcriptionnelle chez les bactéries symbiotiques intracellulaires à génome réduit est encore actuellement très mal connue. Cette question sera abordée chez Buchnera tout d'abord au niveau évolutif par l'étude de la relation entre l'expression des gènes et leur organisation dans le génome, puis au niveau fonctionnel, par la caractérisation de la réponse de la bactérie à une diminution de la quantité d'acides aminés essentiels dans le substrat nutritif du puceron, combinée à un stress osmotique.

Overlooked for a long time, wood falls on the deep oceanic floor are now recognized as extreme, reducing ecosystems based on chemosynthesis, in the same way that hydrothermal vent, cold seeps and whale falls with which they share important physicochemical and faunistic similarities. In these ecosystems, bacterial chemosynthesis using reduced compounds (H2S, CH4) and/or digestion of refractory organic compounds (cellulose and lignin in wood, organic matrix of bone) by heterotrophic bacteria play an essential trophic role, and appear to promote establishment of mutualistic symbioses between bacteria and metazoans for the exploitation of environmental resources. Beyond the description of the taxonomic composition of fauna associated with these sites, current studies aim to understand the functioning and evolutionary links of these ecosystems. Digestive and/or chemoautotrophic associations with microorganisms that could be the key to survive in these habitats have been described in a number of molluscs and annelids but only few crustaceans. The latter distinguish from the other groups by the fact they do not realize intracellular symbioses (endosymbioses) but mainly carry ectosymbioses on their integument (epidermis and cuticle) even in the digestive tract that is partly lined by epidermis (in stomodeum and proctodeum). Moreover, up to now, nothing was known about crustaceans from deep-sea wood falls, their feeding habits and associations with microorganisms. The present work focused on the crustaceans and especially 15 species of decapods from wood falls in the South Pacific Ocean. The specimens were recovered during several French cruises (Salomon2, BOA1, SantoBOA, SalomonBOA3) organized near the Vanuatu, Solomon Island and New Caledonia by the Muséum National dHistoire Naturelle of Paris. The investigation of the feeding biology and microbial associations of the decapod species combined three complementary approaches : 1) a morphological approach using light and electron microscopy to describe the external and gut structures as well as the gut content and microflora, 2) a trophic approach based on stable isotopes analyses (C and N) together with the nature of the gut content and 3) a molecular approach based on 16S rRNA gene analyses and FISH labeling to identify and locate the bacteria in the gut content (ingested bacteria) and on the gut lining (resident bacteria or symbionts). Taxonomic identification and morphological observations of the species provided a first non-exhaustive inventory of the best represented decapod species in wood accumulations in the deep South Pacific and point out three interesting informations. 1) Most decapods from the sunken woods belong to Reptantia. 2) Some species (e.g. Munidopsis spp.) belong to deep sea taxa and exhibit typical characteristics while others (e.g. Xylopagurus) much more resemble shallow-water species, indicating that the colonization of wood falls by decapods may have occurred from both deep and coastal habitats. 3) Association degree with sunken wood could be important for some species that appear endemic (e.g. Pylochelidae, Xylopagurus) or which probably have their complete life cycle on wood falls (most of the gravid females having big eggs with a direct larval development). From a trophic point of view, morphological observations of the digestive system, examinations of gut contents and stable isotope analyses carried out on 15 species, allow us to classify the decapod crustacean from deep-sea sunken woods into two major groups, detritivores and predators/scavengers, and four trophic guilds (trophic levels) depending on two primary food sources, the wood and the particulate organic matrix (marine snow). The four guilds were identified as bacteriovorous detritivores (M. nitida, M. pilosa, M. bispinoculata, Munidopsis sp.1), xylophagous detritivores (M. andamanica, R. amboinensis), omnivores (X. caledonicus) and predators/scavengers (pylochelid species, Munida spp, Axiidae sp.1, M. cylindrophthalma). A fifth guild could be represented by limivorous detritivores (C. acutirostella, Alpheidae sp.1). This breaks with the widespread idea that decapod crustaceans from wood falls are all scavengers or predators. In addition, these results have evidenced of some special dietary strategies and highlight the importance of xylophagous decapods in the ecosystem, by their mechanical degradation of the substrate and their production of feces which should enrich the sediment and have a significant impact on the composition of wood and sediment microbiota (bacteria and fungi). Microscopic observations also allowed us to identify potentially symbiotic associations with resident (and transient) microorganisms (bacteria and/or trichomycetes) in the hindgut of five detritivorous species. Owing that, three of these species have a wood-based diet (M. andamanica, M. nitida, R. amboinensis) and considering the location of these microflora, it is strongly suggested that the resident microorganisms are directly related to the xylophagous diet of the host and most particularly involved in the digestion of wood. More detailed in two xylophagous species, M. andamanica and R. amboinensis, not only these microflora can be distinguished on the basis of their morphology, location and probable genetic differences but also by their roles and involvement in the digestion of the woody substrate. The digestive bacteria of M. andamanica could act as trophic intermediates while those of R. amboinensis probably only help in its digestion. From the stable isotopes ratio, it is likely that R. amboinensis directly assimilates the wood digestion products while M. andamanica feeds on wood with a trophic intermediate. Cloning and sequencing 16S rRNA gene from the gut bacteria of M. andamanica revealed its resident hindgut microflora is largely dominated by two phylotypes (OTUs) of possibly symbiotic bacteria that belong to Firmicutes and Alphaproteobacteria. Surprisingly, these OTUs are very close to gut bacteria isolated from a coastal thalassinid shrimp N. californiensis and from the Chinese crab E. sinensis. The results raise the question of the development and evolution of digestive symbioses in decapods and crustaceans in relation to the diet and/or adaptation to a special habitat, owing that among galatheid crabs the symbiotic relationships appear closer in certain species (M. andamanica) than in others (M. nitida, M. bispinoculata) and that similar differences appear between taxonomic groups. On the other hand, the genetic proximity of bacteria from distant crustacean species raise the question of an eventual co-evolution of linked hosts and symbionts contrasting with the permanent re-acquisition of symbionts from the medium.

Les Scléractiniaires symbiotiques (coraux) qui se développent dans des eaux oligo-trophes survivent grâce à une utilisation optimale des nutriments tels que le phosphore et l'azote. Alors que l'utilisation de l'azote par les coraux a été bien étudiée, ce n'est pas le cas du phosphore. L'enjeu principal de cette thèse a été d'évaluer l'utilisation du phos-phore inorganique et organique dissous (PID, POD) par les coraux dans diverses condi-tions environnementales, ainsi que leurs besoins métaboliques en phosphore. Les résul-tats obtenus ont montré que l'absorption de PID, mesurée par déplétion dans le milieu, et de POD, mesurée via l'activité de l'alcaline phosphatase, dépendent de l'éclairement, de la présence de Dinoflagellés symbiotiques dans les tissus coralliens, de la présence d'azote inorganique, et du statut nutritionnel de l'hôte (réplétion en phosphore organique particulaire, POP, ingéré sous forme de plancton). Lors d'un stress de température, seul ou combiné à une acidification du milieu, l'absorption de PID a été affectée. Sous l'effet d'un enrichissement du milieu en PID, la photosynthèse et la calcification corallienne ont été augmentées, suggérant qu'en conditions oligotrophes, la symbiose est limitée par le phosphore. Enfin, des analyses en résonance magnétique nucléaire ont montré que le phosphore se trouve principalement sous forme de phosphate dans la symbiose, mais aussi de phosphonates chez l'hôte, et de polyphosphates et esters de phosphate chez les symbiotes. Un premier bilan de l'importance relative du PID, POD et POP a été établi à l'issue de ce travail, et un examen critique des outils permettant d'évaluer la limitation par le phosphore a été réalisé.

Depuis leur radiation après le Carbonifère, il y a 325 millions d'années, les insectes ont colonisé la majorité des milieux terrestres. Ce grand pouvoir colonisateur est en partie dû à leur association avec des bactéries symbiotiques intracellulaires, nommés endosymbiotes. Ces derniers complémentent le régime alimentaire de l'insecte et lui permettent de survivre sur des milieux nutritionnellement pauvres ou déséquilibrés. Les endosymbiotes sont transmis maternellement, ce qui assure la pérennité de l'association au cours des générations. Ils sont maintenus dans des cellules spécialisées, les bactériocytes, qui forment à leur tour un organe, le bactériome. L'étude des spécificités moléculaires et cellulaires des bactériocytes est un enjeu majeur dans la compréhension des mécanismes de régulation des endosymbiotes. Toutefois, la caractérisation de ces spécificités reste peu élucidée. Afin d'approcher les spécificités moléculaire, cellulaire et immunitaire du bactériome, ainsi que la réponse immunitaire systémique du charançon dirigée contre un pathogène, nous avons construit et séquencé 7 banques d'ADNc provenant du charançon des céréales : Sitophilus oryzae (Coléoptère, Curculionide). L'analyse in silico des banques, appuyée par une étude transcriptomique, a montré que le bactériome présente une forte expression de gènes impliqués dans la survie et le développement cellulaire, et dans le trafic vésiculaire. Le bactériome présente aussi une réponse immunitaire spécifique et modulée, puisqu'à l'exception d'un peptide antimicrobien, la coléoptéricine-A, les effecteurs de l'immunité ne sont pas (ou peu) exprimés. Par ailleurs, nous avons montré que la réponse immunitaire des larves de charançon aux infections bactériennes serait modulée en présence des endosymbiotes. Le deuxième volet de cette thèse s'est focalisé sur le stade adulte du charançon, chez qui les bactéries symbiotiques sont hébergées dans des bactériomes situés à l'apex des caeca mésentériques qui tapissent l'intestin moyen de l'insecte. Cette association est éphémère chez l'adulte qui perd ses endosymbiotes 15 jours après la mue imaginale. Nous avons recherché les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de cette élimination, ainsi que les causes écophysiologiques et évolutives sous-jacentes. Par des approches histologiques et transcriptomiques, nous avons démontré que l'élimination des symbiotes est la conséquence de l'activation simultanée de l'apoptose et de l'autophagie. Par ailleurs, nous avons montré que l'élimination du symbiote survient après la formation ultime de la cuticule par l'insecte adulte, et que cette élimination symbiotique était corrélée à une diminution des besoins nutritionnels de l'insecte, notamment en acides aminés aromatiques.

Cette thèse est une étude systémique de la régulation de la transcription des gènes de la bactérie Buchnera aphidicola vivant en symbiose intracellulaire obligatoire avec le puceron du pois, Acyrthosiphon pisum. Plusieurs études expérimentales antérieures sur ce modèle de symbiose attestent d'une part que la bactérie fournit à son hôte le complément nutritionnel qu'il ne trouve pas dans son alimentation, et d'autre part, que la bactérie adapte cette fourniture aux variations de la demande de son hôte, les mécanismes impliqués dans cette régulation demeurant relativement obscurs. Nous avons structuré notre analyse de la régulation de la transcription chez Buchnera en quatre parties. La première dresse l'inventaire de la machinerie transcriptionnelle de Buchnera. La deuxième partie analyse l'architecture génomique de Buchnera, i.e. l'organisation et l'évolution de sa carte opéronique. Pour cette étude, nous avons été amenés à développer une méthode bayésienne de prédiction d'opérons adaptée à Buchnera, ce qui nous a permis de proposer une nouvelle carte opéronique de la bactérie. La troisième partie porte sur les propriétés structurelles séquence-dépendantes du chromosome de Buchnera. Les résultats obtenus à l'Issue de cette approche ascendante, nous ont amené à construire un premier modèle de réseau de la régulation transcriptionnelle chez Buchnera. Enfin, la quatrième partie est un travail de modélisation suivant une approche descendante. Il s'agit du développement d'une méthode d'inférence de réseau de régulation à partir de données d'expression que nous avons appelée IGOIM. Cette méthode a été validée sur des jeux de données simulées et de la littérature.

Les plantes actinorhiziennes appartiennent à 8 familles d'angiosperme et forment une symbiose fixatrice d'azote avec l'actinomycète du sol Frankia qui aboutit à la formation de nodules au niveau du système racinaire de la plante. Le nodule actinorhizien est considéré comme une racine latérale modifiée car i) il provient de divisions des cellules du péricycle situées en face du pôle de xylème, ii) il possède un méristème apical et un système vasculaire central et iii) chez certaines espèces comme Casuarina glauca une racine nodulaire est produite à l'apex de chaque lobe nodulaire. L'auxine, et notamment le transport d'influx, est impliquée dans la mise en place de la racine latérale. Nous avons donc identifié des gènes de transporteurs d'influx d'auxine chez la plante actinorhizienne C. glauca et étudié le rôle du transport d'influx au cours de la mise en place du nodule actinorhizien.<br />Deux gènes de la famille AUX-LAX codant des transporteurs d'influx d'auxine ont été identifiés C. glauca. Les profils d'expression des gènes CgAUX1 et CgLAX3 sont très conservés entre C. glauca et Arabidopsis thaliana. De plus, des analyses fonctionnelles par complémentation de mutants d'A. thaliana ont mis en évidence une équivalence entre CgAUX1 et AtAUX1. Nos études suggèrent également qu'il existe une divergence fonctionnelle au sein de la famille AUX-LAX.<br />Nous avons analysé le rôle de ces gènes au cours de la mise en place de la symbiose. Notre étude montre que le gène CgAUX1 est exprimé dans les cellules infectées tout au long de l'infection. De plus, le rôle du transport d'influx d'auxine dans le mécanisme d'infection a été confirmé par l'utilisation d'un inhibiteur du transport d'influx. Par ailleurs, le gène CgAUX1 est exprimé dans le primordium de racine latérale mais pas dans le primordium nodulaire. Cela suggère que ces deux organes présentent des différences dans leur programme de développement.<br />Afin d'identifier les mécanismes agissant en aval du transport d'influx d'auxine, nous avons étudié le rôle d'AtLAX3 chez Arabidopsis. Nous avons montré qu'un certain nombre de gènes de remodelage de la paroi sont induits par l'auxine de façon dépendante d'AtLAX3 au cours de l'émergence de la racine latérale. Nous avons cherché à identifier des gènes de remodelage de la paroi qui pourraient être impliqués dans l'infection par la bactérie Frankia de façon dépendante de CgAUX1. Cg12 qui code une protéase de type subtilisine spécifiquement exprimée dans les cellules infectées pourrait être une cible de la signalisation auxinique dépendante de CgAUX1.<br />Nos résultats suggèrent que le transport d'influx d'auxine est impliqué dans la mise en place du nodule actinorhizien chez C. glauca.

Les plantes actinorhiziennes sont des non légumineuses appartenant à 8 familles d'angiospermes qui peuvent établir une symbiose fixatrice d'azote avec l'actinomycète du sol Frankia. Cette interaction aboutit à la formation de nodules au niveau du système racinaire de la plante. Parmi les gènes qui interviennent au cours des étapes précoces de la symbiose figure Cg12, un gène isolé chez l'arbre actinorhizien Casuarina glauca qui code une protéase à sérine de la famille des subtilisines (=subtilase). L'objectif de ce travail est la poursuite de la caractérisation de ce gène à travers 4 approches :<br />(1) Une étude détaillée du profil d'expression de Cg12 a été réalisée grâce à l'utilisation de Casuarinacées transgéniques contenant des fusions transcriptionelles entre le promoteur de Cg12 et des gènes rapporteurs. Cette analyse a permis de montrer que l'expression de Cg12 est spécifiquement liée à l'infection des cellules par Frankia et qu'elle débute dès les premières étapes de la symbiose, quand Frankia pénètre dans des poils absorbants déformés. <br />(2) La protéine CG12 a été mise en évidence dans des extraits protéiques de C. glauca en utilisant des anticorps anti-CG12. Ces anticorps ont également été utilisés dans des expériences d'immunolocalisation, ce qui nous a permis de montrer que CG12 se retrouve dans le compartiment extracellulaire, au niveau des parois et du matériel polysaccharidique qui entoure Frankia. <br />(3) Nous avons introduit les fusions transcriptionelles Cg12-gène rapporteur dans la plante modèle Arabidopsis thaliana afin d'analyser les voies de transduction impliquées dans l'expression de Cg12. Cependant aucune expression des gènes rapporteurs n'a pu être détectée au cours du développement et en réponse à des traitements hormonaux. Nous avons également utilisé Arabidopsis afin de mieux comprendre le rôle d'Ara12, un gène de subtilase proche de Cg12, dont nous avons analysé le profil d'expression chez Arabidopsis.<br />(4) Nous avons étudié l'implication de subtilases dans la symbiose fixatrice d'azote entre la légumineuse Medicago truncatula et Sinorhizobium meliloti. Pour cela nous avons analysé le profil d'expression des gènes rapporteurs placés sous le contrôle du promoteur de Cg12 dans des plantes transgéniques de M. truncatula. La conservation du profil d'expression de Cg12 chez M. truncatula suggère l'existence d'une voie de transduction indépendante de celle qui est activée par les facteurs Nod. Cette voie de transduction est activée dans les deux systèmes symbiotiques en réponse à l'infection par les bactéries. Nous avons ensuite analysé le profil d'expression de plusieurs gènes de subtilases trouvés dans les banques de séquences de M. truncatula. Trois de ces gènes spécifiquement exprimés dans les nodules pourraient être des orthologues de Cg12 chez M. truncatula.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Biosciences végétales : Toulouse 3 : 2008. / Titre provenant de l'é215-232.