Le traitement concomitant de radiothérapie et de chimiothérapie a amélioré le taux de survie des patients atteints du cancer. Le cisplatine est un des agents chimiothérapeutiques les plus utilisés, mais les mécanismes d'interaction avec la radiation demeurent toujours inconnus. Puisqu'une grande partie de la cellule est constituée d'eau, l'effet indirect de la radiation est alors important. Parmi les radicaux issus de la radiolyse de l'eau, l'électron hydraté est estimé incapable de générer des cassures de brin à l'ADN. Cependant, la modification structurelle et chimique de l'ADN par le cisplatine peut favoriser la cassure de brins. L'étude présentée dans cette thèse a pour but de comprendre le mécanisme d'interaction entre les électrons hydratés et l'adduit de cisplatine-oligonucléotide. Pour cela, différents types d'oligonucléotides contenant une ou deux guanines, soit le site d'attachement du cisplatine, sont utilisés. Cette interaction induit un détachement de l'adduit de cisplatine de l'ADN plutôt que des cassures de brin. Des dommages aux bases de l'ADN ont été observés et quantifiés par chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC). Les résultats montrent une augmentation des dommages aux bases de l'ADN en présence de cisplatine, soit aux guanines ainsi qu'aux sites qui ne sont pas les sites d'attachement de cisplatine. La constante de vitesse de la réaction des électrons hydratés avec le complexe d'oligonucléotide-cisplatine a été mesurée par la technique de radiolyse pulsée. Les résultats montrent une augmentation de cette constante en présence de cisplatine par rapport au cas d'un oligonucléotide en absence de cisplatine.

Les oligonucléotides sont de courtes séquences d’acide nucléique qui ont la capacité d’inhiber ou de moduler l’expression d’un gène cible par différents mécanismes. Cependant, leur potentiel thérapeutique est limité par leur faible internalisation. Pour pallier ce problème de vectorisation, il a été envisagé de conjuguer les oligonucléotides à des molécules biocompatibles. Ce travail de thèse porte sur des bioconjugués composés d’un nucléolipide à l’extrémité 5’ ou 3’ des oligonucléotides. Tout d’abord, les propriétés physico-chimique et d’hybridation de ces nouveaux composés ont été évaluées. Des études biologiques ont ensuite été réalisées in vitro et in vivo. Les résultats obtenus ont permis de mettre en évidence le mécanisme d’internalisation cellulaire mais aussi de prouver l’efficacité de transfection et d’inhibition de ces conjugués. En outre, le caractère amphiphile de ce type de composé rend possible leur auto-assemblage pour la formulation de substances actives. Dans ce cadre, différentes formulations ont été investiguées. Ainsi, dans ce travail de thèse une nouvelle technologie d’oligonucléotides conjugués a été développée. La séquence de ces molécules peut être modulée et maitrisée de manière à l’adapter à la cible thérapeutique visée. Actuellement, ce système est appliqué sur treize projets différents à l’échelle nationale. L’effet thérapeutique est ainsi évalué dans différentes pathologies telles que des cancers hormono-dépendants, des leucémies, des maladies neurologiques chroniques ou encore la résistance aux antibiotiques. / Oligonucleotides are short nucleic acid molecules able to modulate or inhibit gene expression. However the main drawback of oligonucleotides lies in their poor cellular internalization, which limit their therapeutic applications. Herein, to overcome this limitation, oligonucleotides were conjugated to biocompatible molecules as a nucleolipid to either the 5'- or the 3'-end. First, physico-chemical properties and binding behaviour of this newly compound were investigated. Then in vitro and in vivo biological assays were performed to characterize but also understand the cellular internalization pathways and their biological activities. Finally, the amphiphilic nature of the oligonucleotide-nucleolipid confers spontaneously self-assembling properties for drugs loading and vectorization purposes. This Ph.D. thesis focuses on new oligonucleotide bioconjugates for various biological applications. Sequences of nucleotides can also be modulated to specifically bind to the therapeutic target. This tuneable technology is actually used in 13 different projects, including hormone-dependent cancers, leukemia, chronic neurological disorders and antibiotic resistance, for example.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les interactions entre les sucres et les lectines sont généralement l'étape clé dans de nombreux phénomènes biologiques et pathologiques. Malgré leu r importance cruciale, ces interactions sont paradoxalement caractérisées par des constantes d'affinité faibles et nécessite une multiprésentation des motifs saccharidiques pour être significatives. Cette augmentation est appelée "effet cluster". En outre, les techniques d'analyse actuellement utilisées en laboratoire nécessitent des quantités importantes de produits, ce qui est difficilement compatible avec les méthodes de synthèse actuelle. Pour pallier ces difficultés, une approche originale basée sur l'utilisation conjointe de glycooligonucléotide et de puces à ADN a été proposée. Les glycoconjugués basés sur des squelettes phosphodiesters et couplés à des séquences d'ADN ont été synthétisés en utilisant la chimie des oligonucléotides, couplée à la "click chemistry". La séquence d'ADN quant à elle a permis l'ancrage sur une puce à ADN et donc la mesure de leur affinité vis-à-vis de différentes lectines. Ce manuscrit rapporte le développement des nouvelles méthodologies de synthèse des glycooligonucléotides ainsi que la préparation de nombreux glycoconjugués originaux, dont l'affinité pour différentes lectines a été mesurée via l'utilisation de la puce à ADN. L'influence de plusieurs paramètres a été étudiée: le nombre de résidus, l'arrangement spatial, la lipophilie etc. Il s'avère que l'arrangement spatial semble être l'un des points les plus importants dans la mise au point d'un glycoconjugué. / The interactions between carbohydrates and lectins are generally the "key step" in many biological and pathological phenomena. Despite their importance, these interactions are paradoxically characterized by low affinity constants and requires multipresence of saccharide to be significant. This increase is called "cluster effect". In addition, the analysis techniques currently used in the laboratory requires large quantities of products, which is hardly compatible with the current methods of synthesis. To circumvent these difficulties, a original approach based on the combined use of glycooligonucleotides and DNA microarrays has been proposed. Glycoconjugates based on phosphodiester skeletons linked to DNA sequences have been synthesized using the chemistry of oligonucleotides, coupled with the "click chemistry". The DNA sequence has allowed the anchoring on a DNA chip and therefore the measurement of their affinity versus different lectins.This manuscript reports the development of new synthetic methodologies for the glycooligonucleotides synthesis and the preparation of many original glycoconjugates, whose affinity for various lectins was measured through the use of DNA microarray. The influence of several parameters was studied: the number of residues, the spatial arrangement, etc. lipophilicity. The spatial arrangement appears to be one of the most important parameters in the development of a glycoconjugate.

Le Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-[alpha]) est une cytokine pro-inflammatoire qui occupe un rôle central dans la physiopathologie de nombreuses pathologies inflammatoires et particulièrement l'arthrite. La neutralisation de cette cytokine par l'utilisation d'anticorps anti-TNF-[alpha] a montré son efficacité dans la polyarthrite rhumatoïde et est aujourd'hui le traitement de référence pour la prise en charge de cette pathologie. Cependant, un tiers des patients traités par anticorps anti-TNF restent réfractaires ou ne répondent pas à ce traitement. Dans ce contexte, il apparait nécessaire de développer des approches nouvelles ou complémentaires pour renforcer l'arsenal thérapeutique actuellement disponible. L'utilisation d'oligonucléotides triple hélice (TFO) permet de moduler l'expression génique de manière spécifique par interaction avec la double hélice d'ADN. Dans cette étude, nous avons évalué les potentialités anti-inflammatoires d'un TFO anti-TNF-[alpha] in vitro sur les synoviocytes et chondrocytes articulaires et in vivo dans deux modèles d'arthrite expérimentale. Ce TFO interagit avec le promoteur du gène du TNF-[alpha], et son activité inhibitrice a été comparée à celle d'une approche par ARN interférence in vitro. Dans les modèles d'arthrite aigue et chronique, l'injection intra-articulaire préventive de TFO anti-TNF-[alpha] permet une amélioration significative des symptômes arthritiques. Particulièrement, le traitement par le TFO diminue sensiblement l'inflammation synoviale et les lésions ostéocartilagineuses articulaires. Ces résultats sont les premiers à montrer la possibilité d'utiliser un TFO in vivo et offrent d'intéressantes perspectives thérapeutiques / Tumor necrosis factor alpha (TNF-[alpha]), a pro-inflammatory cytokine, plays a key role in the pathogenesis of many inflammatory diseases, including arthritis. Neutralization of this cytokine by anti-TNF-[alpha] antibodies has shown its efficacy in rheumatoid arthritis and is now widely used. Nevertheless, some patients currently treated with anti-TNF-[alpha] remain refractory or become non-responder to these treatments. In this context, there is a need for new or complementary therapeutic strategies. Triplex forming oligonucleotides (TFO) can inhibit gene expression with high sequence-specificity by interacting with the DNA double-strand. In this study, we investigated if an anti-TNF-[alpha] TFO had a therapeutic activity on inflammatory processes in vitro and in vivo, as judged from effects on two rat arthritis models. This TFO interacted with the TNF-[alpha] gene promoter, and its inhibitory activity was verified and compared to that of siRNA in vitro. A local intra-articular preventive injection of TFO in both acute and chronic arthritis models significantly reduced the development of the disease. Furthermore, the TFO efficiently blocked synovitis and cartilage and bone destruction in the joints. The results presented here provide the first evidence that gene targeting by anti-TNF-[alpha] TFO modulates arthritis in vivo, thus providing proof of concept that it could be used as therapeutic tool for TNF-[alpha]-dependent chronic inflammatory disorders

L'objectif de cette thèse est l'étude par la technologie des puces à ADN, du transcriptome de la bactérie Buchnera aphidicola, qui vit en symbiose avec le puceron du pois Acyrthosiphon pisum. Le génome extrêmement réduit de Buchnera a perdu l'essentiel de ses gènes de régulation, mais conserve les voies de biosynthèse permettant la production des acides aminés essentiels pour son hôte. La première partie de cette thèse concerne le développement du logiciel ROSO, qui permet de déterminer les sondes oligonucléotidiques destinées aux puces. Une interface a été conçue pour son utilisation en ligne (http://pbil.univ-lyon1.fr/roso). Dans une seconde partie, la conception et l'utilisation d'une puce dédiée à Buchnera ont permis d'étudier le transcriptome de la bactérie, lorsque son hôte subit un stress nutritionnel et osmotique. Cette analyse montre que Buchnera est capable de réguler son expression génique et de réorienter son métabolisme, pour répondre à la demande changeante de son hôte.

La thèse a porté sur l'étude de peptides et d'oligonucléotides par fragmentation dans la source électrospray d'un Quattro II (Micromass). L'instrument a d'abord été évalué en mode positif avec des peptides thioester modèles puis en mode négatif avec des oligodésoxynucléotides bromés dont la fragmentation de la base modifiée permet sa localisation dans la séquence. La fragmentation de peptides acétal et diol (aldéhyde hydraté) conduit à un même ion final cyclique. L'hydratation de peptides aldéhyde a été étudiée en solution par RMN et en phase gazeuse par fragmentation dans la source. Les informations issues de ce travail ont permis une meilleure compréhension du mécanisme de la réaction d'oximation.

Les complexes de ruthénium(II) font l'objet d'un intérêt croissant en tant que photosondes du matériel génétique ou nouvelles drogues en photothérapie anti-cancéreuse. Les complexes contenant des ligands TAP (1,4,5,8-tétraazaphénanthrène) sont capables sous l'action d'une irradiation lumineuse, de génèrer spécifiquement un photoadduit avec la guanine. Cette photoréactivité constitue une stratégie prometteuse pour contrôler l'expression d'un gène. Toutefois, le manque de sélectivité de ce type de photoréaction bloque leur potentiel thérapeutique. <br />Afin de surmonter cet obstacle, nous avons attaché le complexe de ruthénium à l'extrémité d'un oligonucléotide. Cette approche repose sur l'utilisation des propriétés intrinsèques de reconnaissance spécifiques des oligonucléotides vis-à-vis d'une cible acide nucléique. Pour préparer les conjugués, nous avons utilisé la formation d'un lien éther d'oxime en mettant au point une méthode douce et efficace de conjugaison, optimisée dans des conditions conformes aux exigences physiologiques. Nous avons préparé différents conjugués à partir des complexes [Ru(TAP)3]2+ et [Ru(TAP)2Phen]2+, ancrés indifféremment à l'extrémité 3' ou 5' des oligonucléotides, afin d'en étudier le potentiel photochimique. En illuminant ces nouveaux conjugués dans le visible, nous avons mis en évidence la formation spécifique d'un photopontage entre une guanine de l'acide nucléique ciblé et le complexe de ruthénium. Nous avons également étendu notre procédé en ancrant le complexe [Ru(TAP)2Phen]2+ à des peptides vecteurs.

Nous avons développé un microlaboratoire pour étudier la diffusion et son couplage<br />avec la réaction chimique. Il est constitué d'une chambre d'analyse dans laquelle on peut<br />appliquer des champs électriques en deux dimensions pour obtenir des profils de concentration<br />stationnaires ou non-stationnaires. La simplicité spatiale du flux électrophorétique<br />utilisé permet d'appliquer systématiquement une analyse dans l'espace de Fourier. Ce traitement<br />fournit le coefficient de diffusion d'un analyte pur ainsi que la constante thermodynamique<br />et les constantes cinétiques d'un mélange réactif. Dans le but de développer des<br />techniques de séparation resposant sur la cinétique, nous avons étudié la réaction d'hybridation<br />entre deux brins d'ADN et constitué une banque d'oligonucléotides avec des<br />constantes cinétiques variées. Ces études nous ont mené à developper, en collaboration<br />avec le Museum National d'Histoire Naturelle, une sonde oligonucléotidique fluorescente à<br />motif quadruplex permettant une discrimination cinétique lorsqu'elle s'hybride avec une<br />séquence parfaitement complémentaire ou mésappariée.

L’ARN est sans aucun doute la molécule biologique la plus versatile qui soit. Tout comme l’ADN, il peut contenir et transmettre de l’information génétique. Tout comme les protéines, il peut accomplir une multitude de fonctions biologiques. De plus, son rôle le plus connu demeure celui d’intermédiaire entre l’ADN et les protéines. L’ARN est donc au cœur d’un bon nombre de processus biologiques. Ceci lui confère un immense potentiel thérapeutique qui jusqu’à présent demeure largement inexploité. Pour accomplir ses fonctions, l’ARN doit adopter une structure tridimensionnelle précise qui est dépendante à la fois de sa séquence et de son environnement. Ainsi, en modifiant la structure d’un ARN, il est possible d’en moduler sa fonction. C’est l’objectif global des travaux présentés dans cette thèse. Pour y parvenir, de courts oligonucléotides antisens (OA) ont été utilisés. Cette stratégie revêt plusieurs avantages. Comme les OA s’apparient à leur cible en formant des paires de bases Watson-Crick, ils offrent une grande spécificité et leur design est facile. De plus, en se fiant aux données structurales et aux logiciels de prédictions de structures des ARN, on peut aisément identifier les régions à cibler avec les OA. Enfin, cette technique est versatile puisqu’on peut cibler différents motifs d’ARN. La première cible a été le ribozyme du virus de l’hépatite D. Cet ARN, qui catalyse une réaction d’auto-coupure, a été modifié afin que son activité devienne dépendante à la liaison d’OA. Plusieurs modules ont ainsi été créés et combinés afin d’obtenir des ribozymes qui répondaient à la présence d’un ou plusieurs OA. En insérant ces interrupteurs moléculaires dans les régions non traduites d’un ARNm, nous avons ainsi modulé l’expression de ce gène avec les OA. Cet outil a des applications intéressantes pour la régulation de gènes en biologie synthétique. Un autre motif ciblé a été le G-quadruplex (G4). Cette structure non canonique exerce de nombreuses fonctions biologiques et représente donc une cible thérapeutique intéressante. Lorsque présent dans la région 5’ non traduite d’un ARNm, le G4 mène généralement à une diminution de la traduction. En utilisant des OA qui empêchent la formation du G4, nous avons été en mesure d’augmenter la traduction du gène ciblé. De plus, il a été possible de développer des OA qui favorisent la formation d’un G4 dans le but de diminuer l’expression de la cible. Finalement, dans le dernier chapitre de cette thèse, il est démontré que les G4 présents dans les microARN primaires influencent leur maturation en microARN matures. Des OA ciblant ces G4 ont été utilisés afin de favoriser la maturation de microARN suppresseurs de tumeurs, ce qui présente un potentiel thérapeutique intéressant. En bref, les travaux présentés dans cette thèse démontrent clairement que les OA sont un outil de choix pour cibler et modifier la structure de motifs d’ARN spécifiques. / Abstract : RNA is a versatile biological molecule. Like DNA, it can contain and transmit genetic information. Like proteins, it can accomplish multiple biological functions. Also, its most known role remains that of intermediary between DNA and proteins. RNA is thus a key player in many biological processes. This gives it an immense therapeutic potential which remains largely untapped. To fulfill its functions, RNA must adopt a precise threedimensional structure that is dependent on both its sequence and its environment. Thus, by modifying the structure of an RNA, it is possible to modulate its function. This is the overall objective of the work presented in this thesis. To achieve this, small antisense oligonucleotides (ASO) have been used. This strategy has several advantages. As ASO bind their target with Watson-Crick base pairs, they offer great specificity and their design is easy. Moreover, reliance on structural data and RNA structure prediction softwares makes it easy to identify the regions to be targeted with ASO. Finally, this technique is versatile since it is possible to target different RNA motifs. The first target was the HDV self-cleaving motif. This RNA, which catalyzes a self-cleaving reaction, has been modified so that its activity became dependent on the binding of ASO. Several modules were thus created and combined in order to obtain ribozymes which responded to the presence of one or more ASO. By inserting these molecular switches into an mRNA’s UTR, the expression of this gene was modulated with the ASO. This has interesting applications for the regulation of genes in synthetic biology. Another target motif was the G-quadruplex (G4). This non-canonical structure exerts many biological functions and therefore represents an interesting therapeutic target. When present in the mRNA’s 5’UTR, G4 generally lead to a decrease in translation. Using ASO that prevent G4 formation, we were able to increase the translation of the target gene. In addition, it has been possible to develop ASO which promote the formation of a G4 in order to decrease the expression of the target. Finally, in the last chapter of this thesis, it is demonstrated that the G4 present in the primary microRNAs influence their maturation in mature microRNAs. ASO targeting these G4 have been used in order to promote the maturation of tumor suppressor microRNAs, which has an interesting therapeutic potential. The work presented in this thesis clearly demonstrates that ASO are ideal for targeting and altering the structure of specific RNA motifs.