La majorité des Légumineuses sont capables d’établir une symbiose avec des bactéries du sol nommées Rhizobia. Lors de cette interaction symbiotique, un nouvel organe est formé, la nodosité. Dans cet organe, les bactéries fixent l’azote atmosphérique au profit de la plante hôte. Pendant la symbiose Rhizobia-Légumineuse, deux grands changements transcriptômiques ont été observés par différentes technologies, comme le RNASeq (Maunoury et al., 2010) ou les expériences de microarrays (Benedito et al., 2008). Ces grands changements interviennent aux différentes étapes de développements des nodosités et sont médiés par différents régulateurs de l’expression génique comme certains FTs clés et des petits ARN. Ces petits ARN régulateurs sont produits après le clivage de précurseurs de long ARN double brin ou d’ARN en épingle à cheveux par des enzymes particulières de la famille des ribonucléases de type III (RNase III), nommées DICER-LIKE (DCL). De plus, des gènes codant des RNases III additionnelles sont présents dans le génome de plantes et leurs rôles restent encore à être déterminés.Dans cette étude, nous avons caractérisés la famille des RNases III chez Medicago truncatula mais aussi chez d’autres espèces de légumineuse. Nous avons également recherchés l’implication de MtRTL1b, une RNase III, lors du développement des nodosités.Cette RNase III est un orthologue spécifique des nodosités d’AtRTL1, un répresseur de silencing chez Arabidopsis thaliana. Tout d'abord, nous avons montré que l’expression de ce gène est activée juste avant la différenciation et est principalement restreinte à l’interzone, là où les bactéroïdes deviennent totalement différenciés dans les cellules hôtes, et dans la zone de fixation de la nodosité. La répression de l’expression de MtRTL1b, par ARN interférence dans des racines transgéniques, affecte le développement de la nodosité, la fixation de l’azote et la viabilité des bactéroïdes. Un phénotype opposé est observé lorsque MtRTL1b est exprimé de façon ectopique dans la racine. Les analyses des données de séquençage nous ont permis de mettre en évidence que le RNAi conduit à la sous-expression de 1038 gènes, incluant plus de 109 gènes codant des NCRs qui sont des peptides intervenant dans le développement des bactéroïdes et/ou pour leur viabilité dans les nodosités indéterminées. De plus,des gènes impliqués dans les voies métaboliques et la régulation de l’état d'oxydo-réduction mais aussi dans le processus symbiotique, comme la leghémoglobine, sont également sous-exprimés. Des données de séquençage de petits ARN et d’ARN double brins sont en cours d’analyse afin de caractériser les changements dans les populations de petit ARN et identifier les substrats ARN double brin de cette RNase III lors du développement des nodosités. / Almost all Legumes are able to establish symbiosis with soil bacteria called Rhizobia. During this interaction, a new organ is formed, the nodule. In this organ, bacteria fix the atmospheric nitrogen for the host plant. During Rhizobia-Legumes symbiosis twotranscriptomic changes were observed by different technologies like RNAseq (Maunoury et al., 2010) or microarrays experiment (Benedito et al., 2008). These dramatic changes occur at the different steps of nodule development and are mediated by various gene expression regulators including several keys transcription factors and small RNAs. These small regulatory RNAs are produced after cleavage of long double-stranded or hairpin RNA precursors by particular enzymes of the ribonuclease III (RNase III) family, called DICERLIKEproteins (DCL). However, additional RNase III encoding genes are present in plant genomes, whose roles remain to be fully determined.In this work, we characterized the RNAse III family in the model M. truncatula, as well as other legumes species. We also investigated the involvement in nodule development of MtRTL1b, one RNAse III, a nodule-specific orthologue of AtRTL1, a putative silencing repressor in Arabidopsis thaliana. First, we showed that the expression of this gene is activated just before differentiation and is mainly restricted in the interzone, where bacteroid become fully differentiated into the host cells and in the nitrogen fixation zone of the nodule. Repression of MtRTL1b expression, by RNA interference in transgenic roots, affected nodule development, nitrogen fixation and bacteroid viability while an opposite phenotype was observed in roots with ectopic expression of this gene. Then, RNASeq analyses showed that the RNAileads to the down-regulation of 1038 genes, including more than 109 NCRs, encoding peptides involved in bacteroid development and/or viability in indeterminate nodules. Moreover, genes involved in metabolic pathways and redox regulations as well as other genes involved in symbiosis, like leghemoglobins, are also down-regulated. RNAseq of small RNAs and double strand RNAs are under analysis to characterize changes in sRNA populations and identify dsRNA substrates of this RNAse III during nodule development.

L’insecte phytophage Riptortus pedestris, appartenant au sous-ordre des Hétéroptères, est un ravageur notoire de cultures agricoles en Asie du sud-est qui se nourrit préférentiellement de plants de soja. Cette punaise est associée à une bactérie symbiotique du genre Burkholderia nommée Burkholderia insecticola, localisée dans une région spécifique de l’intestin de l’insecte appelée la région M4. Cette région M4, organisée en cryptes, constitue l’organe symbiotique dans lequel le symbiote prolifère de manière extracellulaire. Cette interaction favorise la croissance et le développement de la punaise. Récemment, il a été montré que Riptortus produit des peptides antimicrobiens au sein des cryptes, appelés “crypt-specific cysteine-rich peptides” ou peptides CCR pour lesquels le symbiote est particulièrement résistant. Il a été proposé que les peptides antimicrobiens de l’hôte,incluant les peptides CCR, participent à la colonisation spécifique de l’organe symbiotique par B. insecticola. Dans ce travail, une approche Tn-seq a été utilisée pour identifier les gènes bactériens impliqués dans la résistance aux peptides antimicrobiens et dans la symbiose. Dans un premier temps, la robustesse de la méthode Tn-seq a été évaluée en identifiant le génome essentiel de B. insecticola. Puis dans un second temps, les facteurs bactériens impliqués dans la résistance aux peptides antimicrobiens ont été caractérisés via une approche gènes-candidats et l’approche Tn-seq. Dans une dernière partie, une expérience de Tn-seq in vivo a permis d’évaluer l’ampleur du goulot d’étranglement sur la population symbiotique lors de l’infection de l’organe symbiotique et d’identifier les facteurs symbiotiques impliqués dans la colonisation de R. pedestris. / The phytophagous insect Riptortus pedestris, belonging to the Heteroptera suborder, is a notorious crop pest in South-Eastern Asia which feeds preferentially on soybean plants. This bean bug is associated with a bacterial symbiont, a specific Burkholderia species named Burkholderia insecticola, located in the M4 region of the insect’s midgut. This M4 region is organized in crypts and constitutes the symbiotic organ where the symbiont proliferates extracellularly. This interaction promotes the growth and the development of the bean bug. Recently, it was demonstrated that Riptortus produces antimicrobial peptides in the midgut crypts called crypt-specific cysteine-rich peptides (CCR) for which the bacterial symbiont demonstrates a high resistance profile. It was proposed that host antimicrobial peptides, including the CCR peptides, contribute to the specific colonization of the symbiotic organ by B. insecticola. In this work, a Tn-seq approach was used to find bacterial fitness genes involved in antimicrobial peptide resistance and symbiosis. First, the robustness of the Tn-seq method was assessed by identifying the essential genome of B. insecticola. Second, the bacterial factors for antimicrobial peptide resistance were characterized, based on both a candidate-gene and the Tn-seq approach. Finally, a Tn-seq in vivo experiment was performed to reveal the infection bottleneck effect on the symbiotic population and to identify the bacterial symbiosis factors for the colonization of R. pedestris.

La machinerie pour l’exploitation des ressources minérales qui se trouvent au fond des océans est déjà opérationnelle et la délivrance de permis miniers est imminente malgré d’inquiétantes lacunes de connaissances sur ces écosystèmes. En effet, dans une optique de sauvegarde, il est particulièrement important de mieux connaître les processus clés de l’écologie des profondeurs. Quelles sont les conséquences évolutives de la symbiose si répandue dans les écosystèmes profonds? Comment les sources hydrothermales sont-elles connectées? Quelles adaptations permettent la résilience des espèces endémiques de ces milieux? Dans le Pacifique est, la faune hydrothermale est caractérisée par de denses populations de palourdes de la famille Vesicomyidae et de vers polychètes tubicoles qui servent de niche à une multitude d'autres espèces. Ces deux groupes d'invertébrés dépendent pour leur nutrition de bactéries symbiotiques chimiolithotrophes. Celles-ci sont directement transmises de génération en génération chez les palourdes, et acquises de novo à partir de sources environnementales chez les vers. De plus, les vers possèdent une grande plasticité phénotypique associée aux conditions environnementales très variées (en terme de température, d’oxygène et de concentration de minéraux) dans lesquelles ils se retrouvent. Du fait du contraste dans leurs mode de transmission des symbiotes, de leur distribution étendue, et de leur rôle écologique important, ces deux groupes taxonomiques sont un excellent modèle pour étudier l’évolution, la connectivité et la résilience dans les écosystèmes marins profonds basés sur la chimiosynthèse. Ainsi, les objectifs de ma thèse sont de 1) déterminer les conséquences du mode de transmission des symbiotes sur leur évolution, 2) comparer la connectivité inter-sources entre les populations d’hôtes et de symbiotes, et 3) caractériser la méthylation de l'ADN chez les polychètes des sources hydrothermales et déterminer si ce mécanisme épigénétique joue un rôle adaptatif important. Ces objectifs sont abordés dans trois études indépendantes qui révèlent que 1) des processus à la fois neutres et sélectifs façonnent les génomes des symbiotes bactériens, 2) les populations de symbiotes bactériens dans les cheminées hydrothermales ne sont pas panmictiques mais sont influencées par des modèles locaux de connectivité, et 3) la méthylation de l'ADN est un mécanisme important d'adaptation dans les grands fonds marins. Ultimement, ces études permettent d'établir des lignes directrices en matière de conservation pour les opérations minières, et aident à l’établissement d’aires marines protégées. / The mining industry is ready to exploit the mineral resources lying on the seafloor and the issuing of mining permits is imminent despite concerning knowledge gaps about the key evolutionary and ecological processes at play in these ecosystems. What are the evolutionary consequences of symbioses which are ubiquitous in deep-sea benthic ecosystems? How are chemosynthetic-based ecosystems connected? What kind of adaptations enable the resilience of vent endemic species to their extreme environment? In the eastern Pacific, chemosynthetic-based communities are characterized by dense aggregations of vesicomyid clams (in hydrocarbon seeps) or tubeworms (in hydrothermal vents) both of which offer habitat for many other species. Both invertebrates rely on chemolithotrophic bacteria for their nutrition. In the clams these symbionts are transmitted directly to the next generation through the eggs whereas in the tubeworms the symbionts are acquired de novo from the environment. The tubeworms also display striking phenotypic plasticity according to the physico-chemical conditions of their habitat. Because of their contrasting symbiont transmission mode, extended distribution, and ecological significance, these two taxonomic groups constitute an excellent model to study evolution, connectivity, and resilience in deep-sea chemosynthetic-based ecosystems. Thus, the objective of my thesis are to 1) identify the consequences of symbiont transmission mode on their evolution, 2) compare host and symbiont populations connectivity, and 3) characterize DNA methylation in deep-sea polychaetes and assess whether this epigenetic mechanism could explain their resilience. These objectives were addressed in three independent studies which revealed that 1) both neutral and selective processes participate in shaping the genomes of bacterial symbionts, 2) the populations of bacterial symbionts in hydrothermal vents are not panmictic but are influenced by local patterns of connectivity, and 3) DNA methylation is an important mechanism of adaptation in the deep-sea. Ultimately, these studies provide conservation guidelines for mining operations and help with the establishment of marine protected areas.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2002-2003 / Les relations source/puits de carbone (C) dans la symbiose mycorhizienne à arbuscules (MA) ont été examinées sous différents aspects. Une première partie éco-physiologique rapporte l’existence d’échanges de C entre espèces végétales en conditions naturelles via des champignons MA répondant à la phénologie différente des plantes impliquées. Deux études physiologiques basées sur le système de «split-root» ont montré que la force de puits de C des champignons MA est dépendante de l’espèce fongique, de la souche fongique, ainsi que de l’hôte végétal. Enfin, une étude écologique se positionnant dans un contexte de perturbation naturelle (verglas) endommageant le houppier d’arbres matures a révélé qu’une mauvaise reprise de croissance post-traumatique peut être associée à des taux de mycorhization racinaire plus élevés que ceux d’arbres à bonne reprise de croissance. En résumé, les besoins en C des champignons MA varient en fonction des espèces impliquées dans la symbiose et du stade phénologique de chacune d’elles. / Different aspects of the carbon (C) source-sink relationships in the arbuscular mycorrhizal (AM) symbiosis were investigated. In an initial ecophysiological-based study carried under natural conditions, the existence of AM fungal mediated C exchanges between plant species with different phenology was reported. Two physiological studies based on a split-root system showed the C sink strength of AM fungi to be fungal species, fungal strain and plant species dependent. Finally, an ecological study carried out subsequently to the ice storm of 1998 (natural disturbance) which severely damaged mature tree crowns revealed that poor post-traumatic crown regrowth was associated with higher mycorrhizal colonization levels than in good regrowth trees. In conclusion, the C demand of AM fungi varies with the species involved in the symbiosis and with the phenological stage and health of the phytobiont.

Titre de l'écran-titre (visionné le 23 mai 2023) / La découverte de la co-dépendance entre les communautés de microorganismes symbiotiques et leurs hôtes eucaryotes a redéfini l'unité biologique soumise à l'action des forces évolutives, à « l'ensemble de l'hôte et son microbiote symbiotique », appelé holobionte. Les holobiontes aquatiques sont retrouvés dans une multitude d'environnements extrêmes sur Terre, allant des sources d'eau chaude, aux profondeurs océaniques, aux calottes polaires, jusqu'aux cours d'eau contaminés par les métaux lourds. De plus en plus d'études montrent que l'établissement d'associations symbiotiques avec des microbes a permis à la diversité animale de se développer dans ces environnements hostiles. Les Poissons, retrouvés dans une étonnante diversité d'environnements contrastés, constituent d'excellents modèles pour comprendre la nature des symbioses hôte-microbiote, tant en termes de composition des communautés impliquées, que d'identification des facteurs environnementaux et génétiques qui modulent leurs interactions avec l'organisme hôte. Au contraire des microbiotes humains, nos connaissances sur le microbiote des Poissons en sont à leurs tous débuts. De manière générale, le projet de thèse visait à mieux comprendre l'influence des facteurs modulant les communautés bactériennes chez les Poissons, ainsi qu'à détailler la nature de l'interaction symbiotique existant entre ces communautés et leurs hôtes. Pour y parvenir, nous avons utilisé une approche holistique qui s'intéressait aux différentes composantes modulant les interactions hôte-microbiote chez différentes espèces de poissons amazoniens. Premièrement, nous avons caractérisé la composition et les facteurs environnementaux qui altèrent le bactérioplancton amazonien, ce dernier représentant la source principale de bactéries recrutées par les poissons. Un échantillonnage de bactérioplancton au sein d'un gradient physicochimique de 15 sites naturels a montré que les communautés bactériennes environnementales varient en composition et en activité selon le type d'environnement échantillonné, les Betaprotéobactéries dégradant le carbone humique étant particulièrement abondantes en eau noire, un milieu acide et pauvre en ions. Deuxièmement, nous avons tenté d'évaluer l'effet du génotype de l'hôte sur le recrutement du microbiote chez les poissons amazoniens, afin de déterminer s'il s'agit d'un facteur significatif pouvant moduler le microbiote des Poissons. Suite à la caractérisation du génotype et du microbiote bactérien de quatre espèces de piranha génétiquement proches, nous avons montré l'existence de corrélations significatives entre le génotype de l'hôte et la structure de son microbiote cutané, ce qui n'était pas le cas pour le microbiote intestinal. Par la suite, nous avons profité des particularités d'un système d'étude unique en Amazonie, où on observe un découplage génotype X environnement, afin de quantifier les contributions respectives du génotype du poisson-hôte, des paramètres physicochimiques environnementaux et de la composition du bactérioplancton à la composition du microbiote branchial, représentant une des communautés microbiennes icthyienne la plus exposée à l'environnement. Pour se faire, nous avons mené une étude comparative sur plusieurs populations génétiques de poissons échantillonnées dans des types d'eau ayant des profils physicochimiques contrastés, et avons montré que le recrutement des souches bactériennes environnementales dépend davantage de la composition de l'assemblage bactérien planctonique, que du génotype du poisson-hôte. Finalement, nous avons étudié la nature des interactions poisson-microbiote en milieu extrême, en tentant de comprendre si des fonctions bactériennes des symbiotes branchiaux sont essentielles à la survie des poissons en eau noire, un milieu acide et pauvre en ions imposant d'importants défis physiologiques pour les poissons résidents. La caractérisation simultanée du transcriptome de l'organisme hôte et de sa communauté microbienne chez quatre espèces de Poissons, collectées le long d'un gradient physicochimique comprenant plusieurs sites d'eau noire, suggère que les bactéries branchiales jouent des rôles essentiels dans la régulation des processus d'ionorégulation de l'hôte. Par exemple, l'expression de plusieurs systèmes de transport transmembranaire d'ions n'était observée qu'en cas de surexpression de certaines Betaprotéobactéries connues pour moduler la perméabilité membranaire eucaryote. La contribution du bactérioplancton dans cette interaction a été étudiée davantage par l'implantation d'un modèle de poissons axéniques (stériles) exposés à ce même gradient physico-chimique amazonien, mais dans différents environnements stériles/non stériles en laboratoire. Les résultats de cette dernière expérience ont révélé que les bactéries autochtones/endémiques de l'eau noire d'Amazonie jouent un rôle crucial dans la survie des poissons dans ce type d'eau, puisque l'absence de celles-ci provoque une mort rapide. En conclusion, ce projet de thèse contribue à démontrer l'importance de considérer le microbiote de l'hôte, tout comme le microbiote environnemental, dans les études concernant l'évolution et l'écologie des Poissons. / The discovery of the codependency between communities of symbiotic microorganisms and their eukaryotic hosts has redefined the biological unit subject to the action of evolutionary pressures, from the hosts only, to the hosts and their symbiotic microbiota, known as "holobionts". Aquatic holobionts are found in a multitude of extreme environments on Earth, including hot springs, deep oceans, icy waters of Antarctica, and streams contaminated with heavy metals. More and more studies show that in these hostile environments, it is through the establishment of symbiotic associations with microbes that animal diversity has been able to develop. Fish, which are found in an astonishing diversity of contrasting environments, constitute excellent models for understanding the nature of host-microbiota symbiosis, the composition of the communities involved, as well as the environmental and genetic factors that modulate their interactions with their host organisms. Unlike human microbiota, our knowledge of the fish microbiota is still in its infancy. In general, this thesis project aimed to better understand the influence of factors modulating fish bacterial communities, as well as to detail the nature of the symbiotic interaction existing between these communities and their hosts. To achieve this, we used a holistic approach that focused on the many components modulating host-microbiota interactions in different Amazonian fish species. Firstly, we characterized the composition and the environmental factors that alter Amazonian bacterioplankton, the latter representing the main source of bacteria recruited by fish. A sampling of bacterioplankton within a physicochemical gradient of 15 natural sites showed that environmental bacterial communities vary in composition and activity depending on the type of environment sampled, with humic-carbon-degrading Betaproteobacteria being particularly abundant in black water, an acidic and ion-poor environment. Secondly, we attempted to assess the effect of the host genotype on microbiota recruitment in Amazonian fish, to determine if it is a significant factor that can modulate fish microbiota. Following the characterization of the genotype and bacterial microbiota of four genetically similar piranha species, we evidenced the existence of significant correlations between the host genotype and the structure of fish skin microbiota, which was not the case for the gut microbiota. Subsequently, we took advantage of a unique study system in Amazonia, where fish genotype X environment decoupling is observed, in order to quantify the respective contributions of the fish host genotype, physicochemical parameters and bacterioplankton community composition in shaping the composition of the gill microbiota, one of the most environmentally-exposed community on fish hosts. To do this, we conducted a comparative study on several genetic populations of fish sampled in water types with contrasting physicochemical profiles, and showed that the recruitment of environmental bacterial strains depends more on the composition of the planktonic bacterial assembly, than on the genotype of the host fish. Finally, we studied the nature of fish-microbiota interactions in extreme environments, trying to understand whether there are bacterial functions expressed by symbiotic gill bacteria, that are essential for fish survival in black water, an acidic and ion-poor environment imposing significant physiological challenges for resident fish. The simultaneous characterization of the host gill and microbiota transcriptome of four fish species, collected along a physicochemical gradient including multiple blackwater sites, suggests that gill bacteria play essential roles in regulating host ionoregulatory processes. For example, the host expression of several transmembrane ion transport systems was only observed concurrently with the overexpression of specific Betaproteobacteria known to modulate eukaryotic membrane permeability. The contribution of bacterioplankton in this interaction was further studied by implementing an axenic (sterile) fish model exposed to this same Amazonian physico-chemical gradient, but in different sterile/non-sterile environments in the laboratory. The results of this latest experiment revealed that autochthonous/endemic Amazonian blackwater bacteria play key roles in the survival of fish in this water type, such that when hosts are devoid of bacteria, they do not survive in such an environment. In conclusion, this thesis project contributes to highlight the importance of considering the host microbiota, as well as the environmental microbiota, in studies concerning fish evolution and ecology.

Les associations symbiotiques constituent un moteur majeur de la diversification écologique et évolutive des organismes métazoaires. Chez les insectes, elles ont conduit, au cours de l’évolution, à l’émergence d’un nouveau type cellulaire spécialisé dans l’hébergement des bactéries symbiotiques, les bactériocytes. Ces cellules demeurent une énigme fascinante de la symbiose, les processus déterminant leur développement, leur morphogenèse et leur dégénérescence restant encore méconnus. Dans cette étude, nous avons utilisé la symbiose entre le puceron Acyrthosiphon pisum et son endosymbiote obligatoire, Buchnera aphidicola, comme système modèle. En combinant des approches inédites de cytométrie en flux et d’imagerie cellulaire, nous avons démontré une régulation fine et coordonnée des dynamiques de croissance et de dégénérescence des bactériocytes et des symbiotes bactériens, en accord avec les besoins physiologiques de l’insecte. De l’embryon à l’âge adulte, les cellules symbiotiques croissent de manière exponentielle, répondant aux besoins nutritionnels de l’hôte qui nécessite pour son développement de grandes quantités d’acides aminés essentiels produits par le métabolisme bactériocytaire. Avec la sénescence du puceron, les bactériocytes diminuent en nombre, en taille et subissent une dégénérescence progressive. Ce processus dégénératif ne montre pas les signes classiques de l’apoptose. Il résulte d’une hypervacuolisation cytoplasmique, dérivée du réticulum endoplasmique, déclenchant une cascade de réponses cellulaires dont l’activation des voies autophagique et lysosomale. Ce phénomène de mort cellulaire non-apoptotique en deux étapes, rappelant la paraptosis, n’a jamais été décrit chez les insectes et sa découverte ouvre la voie à l’étude des régulations agissant sur l’homéostasie bactériocytaire. Dans le dernier volet de cette thèse, nous avons procédé à l’étude fonctionnelle du gène PAH, fortement exprimé dans les bactériocytes et potentiellement impliqué dans la régulation de leur homéostasie. Les résultats obtenus n’ont pas révélé de phénotype bactériocytaire, après ARN interférence, mais ont permis de démontrer un rôle essentiel de ce gène dans la morphogenèse des insectes. / Symbiotic associations constitute a driving force in the ecological and evolutionary diversification of metazoan organisms. Over the evolution, they have led to the emergence, in insects, of a novel eukaryotic cell type, the bacteriocytes, specialized in harboring symbiotic bacteria. These cells constitute a fascinating enigma in cell biology, as the processes underpinning their development, morphogenesis and degeneration remain still unsolved. In my PhD thesis, we have used the nutritional symbiosis between the aphid, Acyrthosiphon pisum, and its obligate endosymbiont, Buchnera aphidicola, as a model system. We have first developed a novel approach for counting symbiotic bacteria, based on flow cytometry, and showed that the endosymbiont population increases exponentially throughout aphid nymphal development, with a growing rate that has never been characterized by indirect molecular techniques. Using histology and imaging techniques, we have shown that bacteriocytes also increase significantly in number and size during nymphal development. Once adulthood is reached, the dynamics of symbiont and host cells is reversed: the number of endosymbionts decreases progressively and bacteriocytes start to degenerate. These results show a coordination of the cellular dynamics between bacteriocytes and primary symbionts, and reveal a fine-tuning of aphid symbiotic cells to the nutritional demand imposed by the host physiology throughout development. Interestingly, the degenerative process that bacteriocytes undergo with aging exhibits morphological features distinct from the evolutionary conserved apoptotic cell deaths. It originates from an extensive ER-derived hypervacuolation, triggering a cascade of cellular stress responses including the activation of autophagy and lysosomal pathways. This stepwise non-apoptotic cell death, sharing several features with paraptosis, has hitherto never been characterized in insects and its discovery opens the way to the identification of the molecular mechanisms acting on bacteriocyte homeostasis. In the last part of this PhD project, we have proceeded to the characterization of the PAH gene functions in aphid physiology, using an RNA interference (RNAi) approach. Our results show that, even though this gene is highly expressed in bacteriocytes, it is not involved in the regulation of their homeostasis. Nevertheless, we have demonstrated a new role for this metabolic gene in insect embryonic development and morphogenesis.

Parce qu'ils sont constamment en contact avec toutes sortes de microorganismes présents dans leur environnement, les organismes pluricellulaires ont développé un système immunitaire qui leur permet de détecter leur présence et contrôler leur croissance. Les contacts se produisent naturellement au niveau des surfaces de l'animal qui sont exposés à l'environnement extérieur, comme la peau ou les muqueuses. Il existe au minimum deux types d'interactions : dans le premier cas, la présence de l'autre ne cause aucun problème pour chacun, et peut même éventuellement apporter un bénéfice. Dans le second, l'un des partenaires est aggressif envers l'autre, qui doit répondre à cette situation de stress en essayant de préserver son intégrité pour assurer sa survie. Du côté de l'hôte, cette réponse implique le système immunitaire et a généralement pour but de détruire le microorganisme. En utilisant l'insecte drosophila melanogaster comme organisme hôte modèle, j'ai étudié les interactions hôtes - microbes. Dans le cadre d'un premier projet, je me suis interessé aux cellules circulantes de la drosophiles, les plasmatocytes. Nous savions qu'elles sont capables de manifester certaines activités biologiques (sécrétion de cytokine et de facteurs coagulant, phagocytose), mais leur importance dans la résistance aux infections n'a jamais été évaluée. En générant des drosophiles dépourvues de plasmatocytes, j'ai pu montrer que ces cellules sont requises pour assurer la résistance à certaines infections bactériennes systémiques chez l'adulte, dont Staphylococcus aureus et Salmonella typhimurium, mais pas toutes. / Because they are constantly exposed to contact with the various type of microorganisms present in their environment, multicellular organisms have evolved an immune system that allow them to sense their presence and control their growth. Close contact with these microbes naturally occurs in body parts that are exposed to the environment, like external body surfaces and internal mucosa, and at least two diffrerent kind of relations can be described. In the first case both the two parts do not harm the other, eventually allowing the relationship to go for a mutual benefit. In the second case, one part is agressive towards the other and lead it to induce a response to this stressful situation in order to preserve it's integrity and ultimately it's survival. From the host point of view, this response involves the immune system and most frequently aims at the eradication of the microbes. Using the fruitfly drosophila melanogaster as a model for the host side, i was interested in studying host-microbe interactions. A first project i worked on focused on drosophila circulating cells, the plasmatocytes, about which we knew some activities (secretion of cytokines, cloting factors, phagocytosis) but whose functional relevance to resist infection has never been tested. By generating plasmatocytes-depleted flies, I show that these cells are required for the survival of the adult upon some type of systemic bacterial infections, including Staphylococcus aureus and Salmonella typhimurium, but not all.

Le monoxyde d'azote (NO) est une molécule gazeuse impliquée dans de nombreux processus biologiques chez les plantes, de la germination de la graine à la mise en place de réponses à des stress abiotiques et biotiques. Dans les interactions plante/ pathogène, le NO fait partie de l'arsenal de défenses de l'hôte. En réponse, les pathogènes ont développé des mécanismes pour contrer les effets du NO. Dans la symbiose fixatrice d'azote entre la légumineuse modèle Medicago truncatula et la bactérie Sinorhizobium meliloti, du NO a été détecté durant toutes les phases de l'interaction. L'équipe avait précédemment montré que la réponse de S. meliloti au NO est nécessaire au maintien de la symbiose puisque des nodules formés par une souche mutée dans le gène hmp (le gène hmp est induit par le NO et code pour une protéine qui dégrade le NO) sénescent prématurément. Au cours de cette thèse, nous avons étudié 3 nouveaux gènes de S. meliloti induits par le NO : nnrS1, nnrS2 et norB. nnrS1 et nnrS2 codent pour deux protéines de fonction inconnue et norB code pour une NO réductase qui dégrade le NO. Nous avons montré que ces 3 protéines participent d'une part à la résistance des bactéries au NO en culture et d'autre part, au maintien de l'interaction symbiotique. Par ailleurs, nous avons montré que ces 3 protéines sont impliquées directement ou indirectement dans la dégradation du NO et des résultats préliminaires suggèrent que NnrS1 présente une activité NO réductase. De plus, nous avons montré que NnrS1 et Hmp n'agissent pas seulement sur les bactéries mais aussi sur les protéines végétales. Il était connu que dans les nodules de M. truncatula, la glutamine synthétase (GS) végétale, une enzyme clé de la symbiose, est inhibée par tyrosine nitration, une modification post-traductionnelle dépendante du NO. Nous avons montré que NnrS1 et Hmp, en modulant le niveau de NO dans les nodules, contrôlent l'activité de la GS. Enfin des expériences préliminaires montrent que d'autres protéines (bactériennes et/ou végétales) pourraient être tyrosine nitratées. / Nitric oxide (NO) is a gaseous molecule involved in a large range of biological processes in plants from the seed germination to abiotic and biotic stress responses. In plant-pathogen interactions, NO is part of the defense systems. In response, pathogens have developed mechanisms in order to counteract the NO effects. In the nitrogen fixing symbiosis between the model leguminous plant Medicago truncatula and the bacterium Sinorhizobium meliloti, NO has been detected at all stages of the symbiosis. The team had previously shown that the S. meliloti response to NO is necessary to maintain the symbiotic interaction since nodules elicited by a strain mutated in the hmp gene (hmp is induced by NO and codes for a flavohemoglobine that degrades NO) senesce prematurely. During this thesis, we have studied 3 new genes of S. meliloti whose expression is induced by NO: nnrS1, nnrS2 and norB. nnrS1 and nnrS2 encode two proteins of unknown function and norB codes for a NO reductase which degrades NO. We have shown that these 3 proteins participate on one hand in bacterial NO resistance in culture and on the other hand in maintaining the symbiotic interaction. Furthermore, we have shown that these 3 proteins are involved, directly or indirectly, in NO degradation and preliminary results suggest that NnrS1 displays a NO reductase activity. Moreover, we have shown that NnrS1 and Hmp are not only dedicated to protect bacteria against NO but also play a role on plant proteins. It was already known that, in M. truncatula nodules, the plant glutamine synthétase (GS), a key enzyme of the symbiosis is inhibited by tyrosine nitration, a NO post-translational modification. We have shown that NnrS1 and Hmp, by modulating NO levels in nodules, control the GS activity. Finally, preliminary experiments suggest that other proteins (from bacterial and/or plant origin), could be tyrosine nitrated.

Nous avons réalisé la synthèse de précurseurs d'analogues sulfures de facteurs NOD, messagers chimiques intervenant lors du phénomène de nodulation rencontré dans l'association symbiotique entre certaines plantes légumineuses et des bactéries de la famille rhizobium. Cette association permet à la plante de fixer l'azote atmosphérique préalablement métabolisé par les bactéries. Ces analogues devraient permettre de mieux comprendre les différents processus intervenant au cours de la symbiose plante/ bactérie ainsi qu'étudier l'hydrolyse des facteurs NOD par des enzymes, les chitinases. Nous avons choisi de préparer des analogues fonctionnalisés pour lersquels seule la liaison O-glycosidique entre deux unités serait remplacée par une liaison thioglycosidique. Grâce à l'utilisation de donneurs de glycosyle sous la forme de trichloroacétimidate, nous avons réalisé la synthèse d'un thiotrisaccharide ainsi que celle d'un thiotétrasaccharide, précurseur d'analogues de facteurs NOD, dont les unités réductrices et non réductrices sont potentiellement différenciées en vue de leur fonctionnalisation. Par ailleurs, le transfert d'une unité de glucosamine sur un thiodisaccharide, à l'aide de la bétâ-1,4-galactosyltranférase, a conduit à la préparation d'un thiotrisaccharide. Cette dernière étape a permis d'envisager la synthèse d'un thiotétrasaccharide par voie chimio-enzymatique. Ces précurseurs devraient conduire à de nouveaux analogues sulfures de facteurs NOD sur lesquels des tests biologiques pourraient être réalisés afin d'évaluer l'activité de nodulation ainsi que la résistance aux chitinases

Since available phosphate (Pi) resources in soil are limited, symbiotic interactions between plant roots and arbuscular mycorrhizal (AM) fungi are a widespread strategy to improve plant phosphate nutrition. The repression of AM symbiosis by a high plant Pi-status indicates a link between Pi homeostasis signalling and AM symbiosis development. This assumption is supported by the systemic induction of several microRNA399 (miR399) primary transcripts in shoots and a simultaneous accumulation of mature miR399 in roots of mycorrhizal plants. However, the physiological role of this miR399 expression pattern is still elusive and offers the question whether other miRNAs are also involved in AM symbiosis. Therefore, a deep sequencing approach was applied to investigate miRNA-mediated posttranscriptional gene regulation in M. truncatula mycorrhizal roots. Degradome analysis revealed that 185 transcripts were cleaved by miRNAs, of which the majority encoded transcription factors and disease resistance genes, suggesting a tight control of transcriptional reprogramming and a downregulation of defence responses by several miRNAs in mycorrhizal roots. Interestingly, 45 of the miRNA-cleaved transcripts showed a significant differentially regulated between mycorrhizal and non-mycorrhizal roots. In addition, key components of the Pi homeostasis signalling pathway were analyzed concerning their expression during AM symbiosis development. MtPhr1 overexpression and time course expression data suggested a strong interrelation between the components of the PHR1-miR399-PHO2 signalling pathway and AM symbiosis, predominantly during later stages of symbiosis. In situ hybridizations confirmed accumulation of mature miR399 in the phloem and in arbuscule-containing cortex cells of mycorrhizal roots. Moreover, a novel target of the miR399 family, named as MtPt8, was identified by the above mentioned degradome analysis. MtPt8 encodes a Pi-transporter exclusively transcribed in mycorrhizal roots and its promoter activity was restricted to arbuscule-containing cells. At a low Pi-status, MtPt8 transcript abundance inversely correlated with a mature miR399 expression pattern. Increased MtPt8 transcript levels were accompanied by elevated symbiotic Pi-uptake efficiency, indicating its impact on balancing plant and fungal Pi-acquisition. In conclusion, this study provides evidence for a direct link of the regulatory mechanisms of plant Pi-homeostasis and AM symbiosis at a cell-specific level. The results of this study, especially the interaction of miR399 and MtPt8 provide a fundamental step for future studies of plant-microbe-interactions with regard to agricultural and ecological aspects. / Phosphat ist ein essentieller Bestandteil der pflanzlichen Ernährung und ein Mangel führt zu schwerwiegenden Folgen für Wachstum, Entwicklung und Reproduktion der Pflanze. Eine der wichtigsten Strategien, um einen Mangel an löslichem Phosphat im Boden auszugleichen, ist die arbuskuläre Mykorrhiza, einer Wurzelsymbiose zwischen Pflanzen und im Boden lebenden Mykorrhizapilzen. Die Symbiose dient dem gegenseitigen Nährstoffaustausch, der über bäumchenartige Strukturen in Wurzelzellen, den Arbuskeln, realisiert wird. Über ein weit reichendes Netzwerk im Boden verbessert der Pilz die Phosphatversorgung der Pflanzen, wohingegen die Pflanze photosynthetisch erzeugte Zucker zur Verfügung stellt. Ein erhöhter Phosphatgehalt in der Pflanze führt zur Unterdrückung der Symbiose. Da weitestgehend unbekannt ist, wie genau Pflanzen diese Einschränkung der Symbiose regulieren, kann die Erforschung dieses Zusammenhangs einen wichtigen Beitrag für Agrarwirtschaft und Umweltschutz leisten. Im Rahmen dieser Arbeit konnte durch die Entdeckung eines neuen, bisher unbekannten Zielgens aufgezeigt werden, dass die für den Ausgleich des pflanzlichen Phosphathaushalts wichtige Mikro-RNA (miR) 399 auch in der Regulation der arbuskulären Mykorrhizasymbiose von besonderer Bedeutung ist. MiRNAs regulieren die Aktivität von Zielgenen indem sie die jeweiligen Transkripte durch Bindung für den Abbau markieren. In kolonisierten Wurzeln, insbesondere in arbuskelhaltigen Wurzelzellen, konnte eine erhöhte Anhäufung der miR399 beobachtet werden. Durch das Verfahren der Hochdurchsatz-Sequenzierung des Wurzeldegradoms, bei dem alle abgebauten Transkripte analysiert werden, konnte das neue Zielgen der miR399 Familie, MtPT8, identifiziert werden. Dieses codiert für einen Phosphat-Transporter, der diesen Studien zufolge ausschließlich in mykorrhizierten Wurzeln vorkommt und dessen Transkription auf arbuskelhaltige Zellen beschränkt ist. Mit der Identifizierung dieses neuen Zielgens konnte erstmals der Beweis für die direkte Verbindung der pflanzlichen Phosphathomöostase durch miR399 und der arbuskulären Mykorrhizasymbiose gezeigt werden. Die Untersuchung der physiologischen Funktion dieses mykorrhizaspezifischen Phosphat-Transporters bietet die Möglichkeit, die Zusammenhänge der phosphatabhängigen Regulation der Symbiose aufzuklären und weit reichende Einblicke in die Regulationsmechanismen während der Pflanze-Pilz-Interaktion zu erhalten.