River discharge leads to extensive phytoplankton blooms often observed in ocean color satellite images to extend far into the open ocean as high chlorophyll plumes. We investigated diversity, distribution and ecology of phytoplankton populations in the Mississippi River plume, both spatially and in the water column using molecular tools. A method was developed for the quantification of diatom/pelagophyte rbcL (large subunit of Ribulose-1,5-bisphosphate Carboxylase/Oxygenase) mRNA using quantitative PCR and applied to cultures and in the plume. The vertical structure of phytoplankton species in the Mississippi River plume was described by flow cytometry, pigments, rbcL mRNA and rbcL cDNA libraries. High productivity in the plume was associated with a large population of Synechococcus and elevated levels of cellular form IA rbcL mRNA. rbcL cDNA libraries indicated two vertically separated clades of Prochlorococcus (high-light and low-light adapted) in addition to a diverse group of prymnesiophytes and a microdiverse clade of prasinophytes, which may have dominated the SCM (Subsurface Chlorophyll Maximum). In situ sampling and satellite image analysis were used to estimate that the plume accounted for 41% and 13% of all surface water column ix productivity in the oligotrophic Gulf of Mexico, while covering less than 3% of its area. Coastally the plume is dominated by diatoms, which are replaced by a bloom of Synechococcus as the plume moves offshore. Diatoms as indicated by pigments and rbcL clone libraries again dominated the offshore, least productive plume. 15N uptake measurements indicated that rapid recycling of ammonium despite higher levels of nitrate primarily drives production in the offshore plume. rbcL mRNA levels and photosynthetic capacity displayed strong diel patters in three out of four time series sampled during the GRIST (Geochemical Rate/mRNA Integrated Study). In addition it was demonstrated that transcriptional regulation of the global nitrogen regulatory protein NtcA in Synechococcus WH7803 may involve a small cis-encoded anti-sense mRNA. Methods for the generation of large insert BAC (Bacterial Artificial Chromosome) from cultures and the environment were refined. Partial sequencing and genomic comparison of an ntcA containing BAC clone obtained from Synechococcus WH7803 indicated that ntcA is not part of a larger nitrogen assimilation operon in cyanobacteria.

With a volcanic origin, Lake Kivu is deep and meromictic, and shows a very particular limnology and some astonishing features. The data available on its limnology and phytoplanktic communities are limited, dispersed or outdated. This is the first deep, long term study (2002-2004) on limnology and phytoplankton ecology of Lake Kivu, combining different techniques: HPLC analysis of marker pigments, flow cytometry, light, epifluorescence and electron microscopy. Lake Kivu combines a relatively shallow euphotic layer (~18m) usually smaller than its mixed layer (20 – 60 m), and with a weak thermal gradient in the mixolimnion. With an annual average chlorophyll a in the mixed layer of 2.2 mg m-3 and low nutrient levels in the euphotic zone, the lake is clearly oligotrophic. Concerning its phytoplanktonic composition, the most common species were the pennate diatoms Nitzschia bacata Hust. and Fragilaria danica (Kütz.) Lange Bert., and the cyanobacteria Planktolyngbya limnetica (Lemm.) Komárková-Legnerová and Cronberg and Synechococcus sp. Diatoms were the dominant group in the lake, particularly during the dry season episodes of deep mixing. During the rainy season, the stratified water column, with high light and lower nutrient availability, favoured dominance of cyanobacteria. Phycoerythrin-rich phototrophic picoplankton and heterotrophic bacteria cell numbers were constantly high, with relatively subtle spatial, seasonal and vertical variations. In open lake waters, where allochthonous carbon inputs are most probably inconsequential, HNA heterotrophic bacteria abundance is strongly correlated with chlorophyll a. Recent investigations revealed an increasing methane production in the deep waters during the past three decades, leading to an accumulation of gas and the subsequent lowering of the energy required to trigger a devastating release of gasses. The role of primary producers and the probable changes on the export ratio of the organic matter into deep waters after the introduction of the planktivorous sardine from Lake Tanganyika Limnothrissa miodon, is discussed. The actual primary production, 0.71 g C m-2 d-1 (~ 260 g C m-2 y-1), doesn’t seem substantially different from some punctual measurements made in the past, which discards the hypothesis of anthropogenic eutrophication. We believe that the export ratio of organic matter into the deep waters was largely affected by biological changes that could explain part of the methane increase in the past 30 years in Lake Kivu.

Tesis por compendio / [ES] Enmarcada en la línea de investigación de nuestro laboratorio sobre señalización por nitrógeno principalmente en la cianobacteria Synechococcus elongatus PCC7942, con esfuerzos centrados en las proteínas PII y PipX y su red de señalización, esta Tesis amplía el espectro de moléculas investigadas en relación con dicha red. Estudia y caracteriza el miembro no canónico de la superfamilia de la proteína PII denominado CutA, generalmente anotado como de protección frente a metales divalentes, altamente conservado en todos los dominios de la vida (incluidos animales y el ser humano). En ella examinamos la posible protección frente a metales provista por CutA en dos bacterias muy distantes, Escherichia coli y Synechococcus elongatus, usando knockouts para ambas del gen que codifica para CutA. Ni los estudios de complementación en E. coli del gen silvestre ni los observacionales de sensibilidad a metales en S. elongatus han dado soporte a la función anotada para CutA, a pesar de que demostramos mediante seguimiento turbidimétrico que el Cu2+ hace agregar a la proteína CutA pura de S. elongatus (producida recombinantemente) y por tanto se une a ella, aunque con una afinidad baja por comparación con las concentraciones tóxicas de este metal para dicha cianobacteria. Buscando profundizar en el conocimiento de CutA, hemos determinado a muy alta resolución mediante difracción de rayos X la estructura de esta proteína de S. elongatus, sin evidenciar complejo alguno con cobre, pero demostrando que los tres bolsillos intersubunidades en el homotrímero de CutA son capaces de transportar moléculas orgánicas (en nuestro caso Bis-Tris). Estos resultados apoyan una posible función de CutA basada en la unión a estos bolsillos de biomoléculas neutras o positivamente cargadas y capaces de formar varios puentes de hidrógeno con las paredes de potencial negativo y fuerte carácter polar de estos bolsillos. También hemos estudiado la proteína PipY de S. elongatus, identificada recientemente como pareja funcional de la antes mencionada PipX, determinando sus propiedades espectroscópicas, unión de piridoxal fosfato (PLP) y resolviendo su estructura mediante difracción de rayos X. Probamos que PipY es monomérica y que tiene PLP unido. Su estructura no apoya que sea un enzima, siendo aparentemente apropiada para ejercer una posible función en la homeostasis de PLP. Dado que muy recientemente se ha descrito una epilepsia genética humana dependiente de vitamina B6 debida a mutaciones en el gen humano ortólogo de pipY, PROSC (ahora llamado PLPBP; codifica la proteína PLPHP), usamos inicialmente PipY de S. elongatus y luego PROSC humana como banco de pruebas de la patogenicidad de las mutaciones que se han asociado a esta epilepsia, utilizando para ello mutagénesis dirigida y producción de las formas silvestre y mutantes de estas proteínas, comparando sus propiedades. Estos estudios han demostrado la patogenicidad y establecido mecanismos para la misma para cada una de las mutaciones de cambio de sentido de PROSC descritas hasta ahora en esta epilepsia. Nuestros estudios han representado un importante avance en la comprensión de las proteínas de tipo PipY y de la epilepsia asociada a la forma humana de las mismas. / [CA] Emmarcada en la línia d'investigació del nostre laboratori de senyalització per nitrogen principalment en el cianobacteri Synechococcus elongatus PCC7942, amb esforços centrats en les proteïnes PII i PipX i la seua xarxa de senyalització, esta Tesi amplia l'espectre de molècules investigades en relació amb la dita xarxa. Estudia i caracteritza el membre no canònic de la superfamília de la proteïna PII denominat CutA, generalment anotat com de protecció a metalls divalents, altament conservat en tots els dominis de la vida (inclosos animals i l'ésser humà). En ella examinem la possible protecció front a metalls proveïda per CutaA en dos bacteris molt distants, Escherichia coli i Synechococcus elongatus, usant knockouts del gen que codifica CutA per a ambdues. Ni els estudis de complementació en E. coli del gen silvestre ni els observacionals de sensibilitat a metalls en S. elongatus han donat suport a la funció anotada per CutA, tot i que vam demostrar mitjançant seguiment turbidimétric que el Cu2 + fa agregar a la proteïna CutA pura de S. elongatus (produïda de forma recombinant) i per tant s'uneix a ella, encara que amb una afinitat baixa per comparació amb les concentracions tòxiques d'aquest metall per a aquest cianobacteri. Buscant aprofundir en el coneixement de CutA, hem determinat a molt alta resolució mitjançant difracció de raigs X l'estructura d'aquesta proteïna de S. elongatus, sense evidenciar cap complex amb coure, però demostrant que les tres cavitats formades entre les subunitats del homotrimer de CutA són capaços de transportar molècules orgàniques (en el nostre cas Bis-Tris). Aquests resultats donen suport a una possible funció de CutA basada en la unió a aquestes cavitats de biomolècules neutres o positivament carregades i capaços de formar diversos ponts d'hidrogen amb les parets de potencial negatiu i fort caràcter polar d'aquestes cavitats. També hem estudiat la proteïna PipY de S. elongatus, identificada recentment com a parella funcional de l'abans esmentada PipX, determinant les seves propietats espectroscòpiques, unió de piridoxal fosfat (PLP) i resolent la seva estructura mitjançant difracció de raigs X. Vam provar que PipY és monomèrica i que té PLP unit. La seva estructura no recolza que sigui un enzim, sent aparentment apropiada per a exercir una possible funció en l'homeòstasi de PLP. Atès que molt recentment s'ha descrit una epilèpsia genètica humana dependent de vitamina B6 deguda a mutacions en el gen humà ortòleg de pipY, PROSC (ara anomenat PLPBP; codifica la proteïna PLPHP), fem servir inicialment PipY de S. elongatus i després PROSC humana com banc de proves de la patogenicitat de les mutacions que s'han associat a aquesta epilèpsia, utilitzant mutagènesi dirigida i produint les formes silvestre i mutants d'aquestes proteïnes, comparant les seves propietats. Aquests estudis han demostrat la patogenicitat i establert mecanismes per a la mateixa per a cadascuna de les mutacions de canvi de sentit de PROSC descrites fins ara en aquesta epilèpsia. Els nostres estudis han representat un important avanç en la comprensió de les proteïnes de tipus PipY i de l'epilèpsia associada a la forma humana de les mateixes. / [EN] In the context of research of our laboratory on nitrogen signaling mainly in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC7942, with efforts focused on the PII and PipX proteins and their signaling network, this Thesis extends the spectrum of molecules investigated in relation to such network. It studies and characterizes the non-canonical member of the PII protein superfamily named CutA, a highly conserved protein in all domains of life (including animals and humans) which is generally annotated as protecting against divalent metals. We examine the possible protection provided by CutA against metals, using knockouts for the CutA-encoding gene of two phylogenetically distant bacteria, Escherichia coli and Synechococcus elongatus PCC7942. Neither complementation studies in E. coli by the wild-type gene, nor observational studies of sensitivity to metals in the S. elongatus knockout have supported the function annotated for CutA, although we show by turbidimetric monitoring that Cu2+ causes aggregation of pure S. elongatus CutA (produced recombinantly) and therefore binds to it, although with a low affinity by comparison with the concentrations of this metal that are toxic for this cyanobacterium. Aiming at getting further insight into CutA, we have determined at very high resolution, by X-ray diffraction, the structure of this protein of S. elongatus, failing to observe Cu2+ bound in this structure, but showing that the three pockets formed at intersubunit boundaries in the CutA homotrimer are capable of transporting organic molecules (in our case Bis-Tris) without inducing conformational changes in the protein. This finding supports a possible function of CutA based on the binding to these pockets of neutral or positively charged biomolecules capable of forming several hydrogen bonds with the pocket walls, which are endowed with negative potential and have a strong polar character. We have also studied the PipY protein of S. elongatus, recently identified as a functional partner of the aforementioned PipX, determining its spectroscopic properties, binding of pyridoxal phosphate (PLP) and solving its structure by X-ray diffraction. We prove that PipY is monomeric and has PLP attached. Its structure does not favor an enzymatic role of PipY, being more appropriate for exerting a possible function in the homeostasis of PLP. Given the very recent description of a human vitamin B6-dependent genetic epilepsy associated to mutations in the human orthologue of the pipY gene, PROSC (now called PLPBP, encoding the PROSC protein, now named PLPHP), we used first S. elongatus PipY and afterwards and more extensively human PROSC to test by site-directed mutagenesis the pathogenicity of the mutations that have been associated with this epilepsy. These studies have demonstrated the pathogenicity and established mechanisms for this pathogenicity for each of the missense mutations reported thus far in patients with PROSC-associated epilepsy. Our studies represent an important advance in the understanding of PipY-like proteins and of epilepsy associated with the human form thereof. / Para la realización de esta Tesis, Lorena Tremiño Agulló ha disfrutado de una Beca de Formación de Personal Investigador (FPI) (BES-2012-058304) otorgado por el Ministerio de Economía, Industria y Competitividad. El trabajo se ha llevado a cabo en el grupo 739 del CIBERER-Instituto de Salud Carlos III (IP, V. Rubio) y se ha enmarcado dentro de los proyectos: -“Luz estructural sobre señalización y regulación por nitrógeno y sobre biosíntesis de arginina/urea, sus errores congénitos, y su conexión con biología del envejecimiento”, (BFU2011-30407) del Ministerio de Economía y Competitividad del Gobierno de España (Investigador principal,V. Rubio). -“Una mirada molecular al control de la detoxificación de amonio y a sus patologías y errores congénitos, y a la señalización por amonio. En busca del papel de la proteína CutA”, (BFU2014-58229) del Ministerio de Economía y Competitividad del Gobierno de España (Investigador principal, V. Rubio). -"BioMeder. Genes, proteínas y rutas de señalización en enfermedades raras" (PrometeoII/2014/029) de la Conselleria d'Educació de la Generalitat Valenciana (investigadores, P. Sanz, A. Marina y V. Rubio). / Tremiño Agulló, L. (2019). Bases estructurales de la señalización y regulación por nitrógeno y procesos asociados [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/117999 / TESIS / Compendio