Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont la famille de récepteurs membranaires la plus représentée chez les vertébrés, et la plus grande cible thérapeutique chez l'Homme. L'évolution du paradigme initial qui énonçait une stœchiométrie récepteur : protéine G : effecteur de 1 :1 :1 sera présentée sur le modèle des récepteurs aux chimiokines CXCR4 et CCR2. Grâce à la technique de transfert d'énergie par bioluminescence (BRET), les travaux réalisés durant cette thèse montrent (1) que c'est par un couplage alternatif de CXCR4 à Gα13 au lieu de la voie classique Gαi que les cellules de cancer du sein migrent pour former des métastases, (2) que la désensibilisation de CXCR4 implique le recrutement d'une combinaison définie de protéines (GRK et arrestines) permettant l'arrêt sélectif des multiples voies engagées en réponse à l'agoniste, et (3) que le protomère CXCR4 a un rôle déterminant dans l'engagement de la protéine Gαi et le recrutement de la β-arrestine par l'hétéro-oligomère CXCR4/CCR2 lorsque CCR2 est activé. Dans cette dernière et principale étude, les résultats montrent également que le dimère CCR2 peut s' assembler au dimère CXCR4 pour former un tétramère, et que l'activation de CCR2 influence la conformation du dimère CXCR4. Les phénomènes de coopérativité et d'activation asymétrique déjà rapportés pour cet hétérodimère pourraient donc impliquer l'interaction de quatre protomères. En conclusion les travaux effectués durant cette thèse démontrent une régulation supplémentaire de l'activité des récepteurs chimiokines au niveau de leur structure quaternaire, de leur signalisation, et de l'arrêt de cette signalisation. / G protein coupled receptors (GPCR) are the most represented cell surface receptors among vertebrates, and the major therapeutic target in humans. The initial paradigm stating a 1 :1 :1 stoichiometry for receptor :G protein :effector has evolved to a more complex model, as illustrated here with the example of the chemokine receptors CXCR4 and CCR2. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) was used to demonstrate that (1) CXCR4 is able to couple Gα13 instead of Gαi to promote breast cancer metastasis, (2) the multiple pathways engaged by stimulation of CXCR4 are selectively desensitized by the specific recruitment of a defined combination of proteins (GRKs and arrestins) and (3) the CXCR4 protomer plays a crucial role during Gαi engagement and β-arrestin recruitment by the CXCR4/CCR2 heterodimer upon CCR2 activation. In this last and main study, the results shown also demonstrate that CCR2 dimers could assemble with CX CR4 dimers into hetero-tetramers, and that CCR2 activation leads to a conformational change in the CXCR4 dimer. Former results showing cooperativity and asymmetric activation of a simple CXCR4/CCR2 heterodimer could then be applied to a tetramer. To conclude, the work done during this thesis demonstrates a more sophisticated regulation of chemokine receptors than previously suspected at 3 different levels: quaternary structure of the protomers, G protein signalling, and signalling termination

La réaction allergique de type I est caractérisée par une réponse immunitaire inappropriée de type Th2, et /ou par l'absence d'une tolérance immunologique contre un antigène habituellement toléré par la plupart des individus : l'allergène. Des études récentes soulignent le rôle central joué par les lymphocytes T CD4+ spécifiques de l'allergène dans le contrôle des réponses allergiques. Néanmoins, l'étude des mécanismes immunologiques impliqués se doit d'être approfondie. Elle pourrait ainsi fournir d'importants renseignements concernant l'induction de tolérance périphérique contre l'allergène observée chez les individus sains. L'examen de ces réponses spécifiques apparaît alors comme primordial pour améliorer les approches thérapeutiques actuelles, dans l'hypothèse que l'immunothérapie spécifique de l'allergène puisse reproduire une telle réponse immunitaire naturelle protectrice de l'allergène. Durant cette thèse, nous avons conçu et développé des tétramères MHC classe II afin d'analyser à l'échelle de la cellule les réponses lymphocytaires T CD4+ spécifiques de l'allergène à la fois chez les patients allergiques et les volontaires sains. Pour ce faire, nous avons déterminé les conditions expérimentales nécessaires pour s'assurer d'une détection efficace des cellules T CD4+ spécifiques de l'allergène par cet outil. Ce travail a été réalisé dans le cadre d'une analyse des réponses T CD4+ induites d'une part contre l'allergène majeur du pollen de bouleau (Bet v 1) ou d'autre par contre les allergènes majeurs des acariens (Der p 1 et Der p 2). Nous avons ainsi démontré que la tolérance périphérique observée chez les sujets sains est associée à la présence et l'expansion de lymphocytes T CD4+ spécifiques de l'allergène. Nous avons également développé des méthodes expérimentales permettant de caractériser fonctionnellement les cellules tétramères positives. Nous avons ainsi démontré que les cellules T CD4+ spécifiques de l'allergène des volontaires sains sécrètent principalement de l'IFN-γ et de l'IL-10 en réponse à l'allergène et expriment très fortement le marqueur CTLA-4, un marqueur associé aux cellules T régulatrices. A l'inverse, chez les patients allergiques, ces cellules sont clairement de type Th2 confirmant leur rôle dans l'induction et l'amplification des réponses allergiques. Le développement des tétramères MHC classe II dans le contexte de l'allergie fournit une approche pertinente pour définir clairement le rôle joué par les cellules T CD4+ spécifiques de l'allergène. Ce travail, réalisé à la fois chez les individus sains, allergiques ou en cours de désensibilisation, s'inscrit pleinement dans un projet d'entreprise. Ces outils faciliteront le développement de nouveaux candidats vaccins en permettant d'identifier des marqueurs biologiques associés à un bénéfice clinique.

Thèse réalisée en cotutelle avec l'université Montpellier2 dans le laboratoire de pharmacologie moléculaire de Jean-Philippe Pin à l'institut de génomique fonctionnelle (IGF), Montpellier, France. / Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont une famille très diversifiée de protéines membranaires capables de répondre à un grand nombre de signaux chimiques tels que des photons, des molécules odorantes, ou des hormones. En plus de cette diversité, l’étude des RCPG montre que des associations protéiques spécifiques multiplient les possibilités de signalisation de chacun de ces récepteurs. En permettant d’atténuer, de potentialiser, ou de générer une nouvelle voie de signalisation, l’association des RCPG en oligomères s’avère une importante source de diversité. L’utilisation du transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET) qui permet de détecter les interactions protéiques a révélé de nombreuses associations de RCPG. Durant cette thèse, des outils ont été développés pour combiner efficacement le BRET à des essais de complémentation de protéines (PCA) dans le but de savoir si l’oligomérisation des RCPG pouvait impliquer plus de deux récepteurs. Les résultats présentés montrent que les récepteurs de chimiokines CXCR4 et CCR2 forment des homo et hétéro tétramères, et que l’activation d’un dimère CCR2 peut moduler la conformation d’un dimère CXCR4 par un changement conformationnel trans-récepteur. La coopérativité négative de liaison de ligand qui a été démontrée auparavant entre CXCR4 et CCR2 dans des lymphocytes T CD4+ exprimant les récepteurs de manière endogène confirme la validité biologique de cette interaction. Les données présentées suggèrent également que ces complexes peuvent engager les effecteurs Gαi et β-arrestine2, indiquant qu’ils représentent la forme fonctionnelle de ces récepteurs. Enfin, nous avons pu confirmer que chaque récepteur de l’hétérodimère CXCR4-CCR2 est impliqué dans l’engagement des effecteurs lors de l’activation de CCR2. Un autre niveau de complexité dans la signalisation des RCPG est atteint par leur capacité à coupler de multiples protéines G. La liaison du facteur dérivé des cellules stromales (SDF-1) au récepteur CXCR4 permet la migration des lymphocytes T par une voie de signalisation dépendante de la protéine Gαi. Nous avons pu démontrer en revanche que la migration des cellules de cancer du sein était initiée par un couplage de CXCR4 à la voie Gα13-Rho pour former des métastases dans des organes distants. Enfin, un dernier niveau de régulation des RCPG a été abordé par l’étude de la phosphorylation de CXCR4 suite à son activation, qui permet la désensibilisation du récepteur et l’engagement de voies de signalisation dépendantes de la β-arrestine. Il apparaît que la désensibilisation de la voie du calcium serait médiée par la phosphorylation de CXCR4 par les kinases des RCPG (GRK) GRK2 et GRK6 et le recrutement de β- arrestine2, alors GRK3, GRK6 et la β-arrestine1 potentialiseraient l’activation des kinases régulées par les signaux extracellulaires (ERK1/2). Nous suggérons également que c’est la phosphorylation de l’extrémité C-terminale de CXCR4 qui permettrait son association avec la β-arrestine. / G protein-coupled receptors (GPCRs) are a diverse family of membrane proteins capable of responding to a large number of extracellular stimuli including photons, odorant molecules and hormones. In addition to this diversity, it has been shown that GPCRs form specific protein:protein interactions, multiplying the signalling possibilities of each of these receptors. With the ability to diminish, to potentiate or even generate new signalling pathways, the oligomeric association of GPCRs plays an important role in generating this diversity. The use of bioluminescence resonance energy transfer (BRET), which allows the detection of interactions among proteins, has revealed numerous associations between GPCRs. During this thesis, tools have been developed that effectively combine BRET with protein complementation assays (PCA) with the goal of determining if interactions between GPCRs could involve more than two receptors. The results show that the chemokine receptors CXCR4 and CCR2 form both homo and hetero tetramers, and that the activation of a dimer of CCR2 can modulate the conformation of a CXCR4 dimer through a transreceptor conformational change. Negative cooperativity of ligand binding has previously been demonstrated between CXCR4 and CCR2 in CD4+ T lymphocytes endogenously expressing the receptors, confirming the biological validity of this interaction. The data presented also suggests that these complexes can engage the effector proteins Gαi and β- arrestin 2, indicating that they represent a functional form of the receptors. Furthermore, we have confirmed that each receptor of the CXCR4-CCR2 heterodimer is implicated in the engagement of effectors during the activation of CCR2. An additional level of complexity in GPCR-promoted signaling exists in their capacity to couple of multiple G proteins. Binding of stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) to CXCR4 is known to promote T lymphocyte migration through a Gαi-dependent signalling pathway. In addition to this mechanism, we have demonstrated that breast cancer cell migration can initiated by a coupling of CXCR4 to the Gα13-Rho pathway, leading to the formation of metastases in distant organs. Finally, a novel level of GPCR regulation was revealed through the study of CXCR4 phosphorylation following its activation, which leads to the desensitization of the receptor and the engagement of β-arrestin-dependent signalling pathways. It appears that the desensitization of calcium signalling is mediated through the phosphorylation of CXCR4 by the GPCR kinases (GRKs) GRK2 and GRK6 and the recruitment of β-arrestin 2, whereas GRK3, GRK6 and β-arrestin 1 potentiate the activation of extracellular regulated kinase (ERK1/2). We also propose that the phosphorylation of the far C-terminal tail of CXCR4 is required for the interaction between the receptor and β-arrestin.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont une famille très diversifiée de protéines membranaires capables de répondre à un grand nombre de signaux chimiques tels que des photons, des molécules odorantes, ou des hormones. En plus de cette diversité, l’étude des RCPG montre que des associations protéiques spécifiques multiplient les possibilités de signalisation de chacun de ces récepteurs. En permettant d’atténuer, de potentialiser, ou de générer une nouvelle voie de signalisation, l’association des RCPG en oligomères s’avère une importante source de diversité. L’utilisation du transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET) qui permet de détecter les interactions protéiques a révélé de nombreuses associations de RCPG. Durant cette thèse, des outils ont été développés pour combiner efficacement le BRET à des essais de complémentation de protéines (PCA) dans le but de savoir si l’oligomérisation des RCPG pouvait impliquer plus de deux récepteurs. Les résultats présentés montrent que les récepteurs de chimiokines CXCR4 et CCR2 forment des homo et hétéro tétramères, et que l’activation d’un dimère CCR2 peut moduler la conformation d’un dimère CXCR4 par un changement conformationnel trans-récepteur. La coopérativité négative de liaison de ligand qui a été démontrée auparavant entre CXCR4 et CCR2 dans des lymphocytes T CD4+ exprimant les récepteurs de manière endogène confirme la validité biologique de cette interaction. Les données présentées suggèrent également que ces complexes peuvent engager les effecteurs Gαi et β-arrestine2, indiquant qu’ils représentent la forme fonctionnelle de ces récepteurs. Enfin, nous avons pu confirmer que chaque récepteur de l’hétérodimère CXCR4-CCR2 est impliqué dans l’engagement des effecteurs lors de l’activation de CCR2. Un autre niveau de complexité dans la signalisation des RCPG est atteint par leur capacité à coupler de multiples protéines G. La liaison du facteur dérivé des cellules stromales (SDF-1) au récepteur CXCR4 permet la migration des lymphocytes T par une voie de signalisation dépendante de la protéine Gαi. Nous avons pu démontrer en revanche que la migration des cellules de cancer du sein était initiée par un couplage de CXCR4 à la voie Gα13-Rho pour former des métastases dans des organes distants. Enfin, un dernier niveau de régulation des RCPG a été abordé par l’étude de la phosphorylation de CXCR4 suite à son activation, qui permet la désensibilisation du récepteur et l’engagement de voies de signalisation dépendantes de la β-arrestine. Il apparaît que la désensibilisation de la voie du calcium serait médiée par la phosphorylation de CXCR4 par les kinases des RCPG (GRK) GRK2 et GRK6 et le recrutement de β- arrestine2, alors GRK3, GRK6 et la β-arrestine1 potentialiseraient l’activation des kinases régulées par les signaux extracellulaires (ERK1/2). Nous suggérons également que c’est la phosphorylation de l’extrémité C-terminale de CXCR4 qui permettrait son association avec la β-arrestine. / G protein-coupled receptors (GPCRs) are a diverse family of membrane proteins capable of responding to a large number of extracellular stimuli including photons, odorant molecules and hormones. In addition to this diversity, it has been shown that GPCRs form specific protein:protein interactions, multiplying the signalling possibilities of each of these receptors. With the ability to diminish, to potentiate or even generate new signalling pathways, the oligomeric association of GPCRs plays an important role in generating this diversity. The use of bioluminescence resonance energy transfer (BRET), which allows the detection of interactions among proteins, has revealed numerous associations between GPCRs. During this thesis, tools have been developed that effectively combine BRET with protein complementation assays (PCA) with the goal of determining if interactions between GPCRs could involve more than two receptors. The results show that the chemokine receptors CXCR4 and CCR2 form both homo and hetero tetramers, and that the activation of a dimer of CCR2 can modulate the conformation of a CXCR4 dimer through a transreceptor conformational change. Negative cooperativity of ligand binding has previously been demonstrated between CXCR4 and CCR2 in CD4+ T lymphocytes endogenously expressing the receptors, confirming the biological validity of this interaction. The data presented also suggests that these complexes can engage the effector proteins Gαi and β- arrestin 2, indicating that they represent a functional form of the receptors. Furthermore, we have confirmed that each receptor of the CXCR4-CCR2 heterodimer is implicated in the engagement of effectors during the activation of CCR2. An additional level of complexity in GPCR-promoted signaling exists in their capacity to couple of multiple G proteins. Binding of stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) to CXCR4 is known to promote T lymphocyte migration through a Gαi-dependent signalling pathway. In addition to this mechanism, we have demonstrated that breast cancer cell migration can initiated by a coupling of CXCR4 to the Gα13-Rho pathway, leading to the formation of metastases in distant organs. Finally, a novel level of GPCR regulation was revealed through the study of CXCR4 phosphorylation following its activation, which leads to the desensitization of the receptor and the engagement of β-arrestin-dependent signalling pathways. It appears that the desensitization of calcium signalling is mediated through the phosphorylation of CXCR4 by the GPCR kinases (GRKs) GRK2 and GRK6 and the recruitment of β-arrestin 2, whereas GRK3, GRK6 and β-arrestin 1 potentiate the activation of extracellular regulated kinase (ERK1/2). We also propose that the phosphorylation of the far C-terminal tail of CXCR4 is required for the interaction between the receptor and β-arrestin. / Thèse réalisée en cotutelle avec l'université Montpellier2 dans le laboratoire de pharmacologie moléculaire de Jean-Philippe Pin à l'institut de génomique fonctionnelle (IGF), Montpellier, France.

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