Uma das estratégias utilizadas no desenvolvimento de novas drogas envolve a descoberta de compostos que modulem a atividade de enzimas, importantes no processo infeccioso de patógenos. Uma abordagem interessante na triagem de novos ligantes é o uso de métodos baseados na imobilização de enzimas em suportes cromatográficos acoplados a sistemas de cromatografia líquida. O uso de IMERs (Immobilized Enzyme Reactors) como uma fase estacionária acoplado a sistemas de cromatografia líquida de alta eficiência consiste em uma estratégia para triagem de compostos rápida e eficiente e tem vantagens em relação ao uso de enzimas em solução. A enzima NTPDase-1 de Trypanosoma cruzi age como um facilitador da infecção do patógeno, inibindo assim a resposta imune do hospedeiro, permitindo uma infecção silenciosa, o que sugere seu uso como um bom alvo na busca por inibidores. Neste trabalho, a enzima NTPDase-1 foi imobilizada na parede interna de capilares de sílica fundida formando ICERs (Immobilized Capillary Enzyme Reactors). Estudos das condições de uso destes biorreatores juntamente com o desenvolvimento de um método cromatográfico multidimensional, foram realizados e validados. A otimização do método cromatográfico e sua validação, apresentaram ótimos resultados em relação aos valores obtidos para os parâmetros avaliados para métodos bioanalíticos. A imobilização da enzima foi realizada com sucesso, sendo possível a detecção da atividade catalítica no sistema cromatográfico (TcNTPDase1-ICER). Foi realizado também, o estudo cinético para ATP no TcNTPDase1-ICER, obtendo-se KM de 0,317 ± 0,044 mM, que comparado com estudos em solução, KM de 0,096 mM, ainda apresenta grande afinidade pelo substrato. / One of the strategies used in the development of new drugs involves the discovery of compounds that modulate the activity of enzymes, important in the infectious pathogens process. An interesting approach in the screening of new ligands is the use of methods based on immobilization of enzymes in chromatographic supports coupled to liquid chromatography systems. The use of IMERs (Immobilized Enzyme Reactors) as a stationary phase coupled to high performance chromatographic systems consist in a strategy to a fast and efficient compounds screening and it has advantages comparing to the use of enzymes in solution. The enzyme NTPDase-1 Trypanosoma cruzi acts as a pathogen infection facilitator, thus inhibits the host immune response allowing a silent infection, suggesting its use as a good target in the search for inhibitors. In this paper, the enzyme NTPDase-1 was immobilized for the manufacturing of ICERs (Immobilized Capillary Enzyme Reactors). Studies of conditions to the use of these bioreactors in the ligands screening along with the development of a multidimensional chromatographic method were performed and validated. The chromatographic method optimization and validation, presented excellent results, relating to the obtained values, from evaluated parameters in bioanalytical methods. The enzyme immobilization was successfully performed, being possible to detect the catalytic activity in the chromatographic system (TcNTPDase1-ICER). The kinetic study for the substrate ATP was also performed in the TcNTPDase1-ICER, obtaining KM of 0.317 ± 0.044 mM, which in comparison with studies in solution KM of 0.096 mM, still presents high affinity for the substrate.

Uma das estratégias utilizadas no desenvolvimento de novas drogas envolve a descoberta de compostos que modulem a atividade de enzimas, importantes no processo infeccioso de patógenos. Uma abordagem interessante na triagem de novos ligantes é o uso de métodos baseados na imobilização de enzimas em suportes cromatográficos acoplados a sistemas de cromatografia líquida. O uso de IMERs (Immobilized Enzyme Reactors) como uma fase estacionária acoplado a sistemas de cromatografia líquida de alta eficiência consiste em uma estratégia para triagem de compostos rápida e eficiente e tem vantagens em relação ao uso de enzimas em solução. A enzima NTPDase-1 de Trypanosoma cruzi age como um facilitador da infecção do patógeno, inibindo assim a resposta imune do hospedeiro, permitindo uma infecção silenciosa, o que sugere seu uso como um bom alvo na busca por inibidores. Neste trabalho, a enzima NTPDase-1 foi imobilizada na parede interna de capilares de sílica fundida formando ICERs (Immobilized Capillary Enzyme Reactors). Estudos das condições de uso destes biorreatores juntamente com o desenvolvimento de um método cromatográfico multidimensional, foram realizados e validados. A otimização do método cromatográfico e sua validação, apresentaram ótimos resultados em relação aos valores obtidos para os parâmetros avaliados para métodos bioanalíticos. A imobilização da enzima foi realizada com sucesso, sendo possível a detecção da atividade catalítica no sistema cromatográfico (TcNTPDase1-ICER). Foi realizado também, o estudo cinético para ATP no TcNTPDase1-ICER, obtendo-se KM de 0,317 ± 0,044 mM, que comparado com estudos em solução, KM de 0,096 mM, ainda apresenta grande afinidade pelo substrato. / One of the strategies used in the development of new drugs involves the discovery of compounds that modulate the activity of enzymes, important in the infectious pathogens process. An interesting approach in the screening of new ligands is the use of methods based on immobilization of enzymes in chromatographic supports coupled to liquid chromatography systems. The use of IMERs (Immobilized Enzyme Reactors) as a stationary phase coupled to high performance chromatographic systems consist in a strategy to a fast and efficient compounds screening and it has advantages comparing to the use of enzymes in solution. The enzyme NTPDase-1 Trypanosoma cruzi acts as a pathogen infection facilitator, thus inhibits the host immune response allowing a silent infection, suggesting its use as a good target in the search for inhibitors. In this paper, the enzyme NTPDase-1 was immobilized for the manufacturing of ICERs (Immobilized Capillary Enzyme Reactors). Studies of conditions to the use of these bioreactors in the ligands screening along with the development of a multidimensional chromatographic method were performed and validated. The chromatographic method optimization and validation, presented excellent results, relating to the obtained values, from evaluated parameters in bioanalytical methods. The enzyme immobilization was successfully performed, being possible to detect the catalytic activity in the chromatographic system (TcNTPDase1-ICER). The kinetic study for the substrate ATP was also performed in the TcNTPDase1-ICER, obtaining KM of 0.317 ± 0.044 mM, which in comparison with studies in solution KM of 0.096 mM, still presents high affinity for the substrate.

A enzima glicossomal gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) de Tripanosoma cruzi e os mutantes D210L e D210L-G213D foram expressos em E. coli, purificados e submetidos a ensaios de cinética enzimática e de cristalização. A enzima GAPDH tipo selvagem e o mutante D210L-G213D cristalizaram-se no grupo espacial P21 e os cristais apresentaram padrões de difração de raios-X de boa qualidade. A estrutura cristalográfica da enzima tipo selvagem foi determinada a 2.5 e 2.15 A de resolução, a partir de coletas de dados realizadas a 277 e 100 K respectivamente. Os fatores R cristalográficos finais dos refinamentos foram de 16.0% para a estrutura a 277 K e 18.8% para a estrutura a 100 K. A estrutura do mutante GAPDH D210L-G213D foi determinada a 2.15 A de resolução e refinada até um fator R cristalográfico de 18.9%. A comparação entre as estruturas da enzima tipo selvagem determinadas nas duas temperaturas levou a resultados interessantes no que diz respeito ao empacotamento cristalino. O resfriamento dos cristais provocou uma redução no volume da cela unitária de 10.5%, tendo a maior variação ocorrido no parâmetro de rede a (14.5%). A sobreposição das celas unitárias mostrou uma rotação do conteúdo da unidade assimétrica de cerca de 5 graus em torno de um eixo aproximadamente paralelo a b. Por outro lado, a análise das estruturas da enzima tipo selvagem e mutante, juntamente com os parâmetros cinéticos, permitiram a discussão a respeito de alguns detalhes do mecanismo catalítico da enzima, principalmente no que se refere ao papel do resíduo Arg249. Tal resíduo, que apresenta grande mobilidade conformacional de sua cadeia lateral, parece estar envolvido na etapa de reorientação de um dos intermediários durante o processo catalítico. / The glycosomal glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) from Typanosoma cruzi and its mutants D210L and D210L-G213D were expressed in E. coli and purified, followed by kinetic and crystallization assays. Both wild type enzyme and D210L-G213D mutant were crystallized in P21 space group and the crystals presented good X-ray diffraction patterns. The three-dimensional structure of the wild type enzyme was determined at 2.5 and 2.15 A resolution from data collected at 277 and 100 K respectively. The structures were refined to a crystallographic R-factor of 16.0% for data collected at 277 K and 18.8% for those collected at 100 K. Also, the structure of the D210L-G213D mutant was solved at 2.15 A resolution and refined to a crystallographic R-factor of 18.9% with good geometry indicators. Comparison between the wild type enzyme structures solved at both temperatures led to interesting results concerning the crystal packing. Flash-cooled crystals presented a 10.5% shrink in the unit cell volume being the major reduction observed in the parameter a (14.5%). Superposition of the unit cells showed a global rotation of the asyrnmetric unit content of about 5 degrees around an axis approximately parallel to b. On the other hand, the analysis of the wild type and mutant enzyme structures, together with the kinetic parameters, allowed a discussion about some catalytic mecanism details, mainly the role of the Arg249 residue. The results showed that this residue might be involved in the reorientation of one of the intermediates during the catalytic process.

A enzima glicossomal gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) de Tripanosoma cruzi e os mutantes D210L e D210L-G213D foram expressos em E. coli, purificados e submetidos a ensaios de cinética enzimática e de cristalização. A enzima GAPDH tipo selvagem e o mutante D210L-G213D cristalizaram-se no grupo espacial P21 e os cristais apresentaram padrões de difração de raios-X de boa qualidade. A estrutura cristalográfica da enzima tipo selvagem foi determinada a 2.5 e 2.15 A de resolução, a partir de coletas de dados realizadas a 277 e 100 K respectivamente. Os fatores R cristalográficos finais dos refinamentos foram de 16.0% para a estrutura a 277 K e 18.8% para a estrutura a 100 K. A estrutura do mutante GAPDH D210L-G213D foi determinada a 2.15 A de resolução e refinada até um fator R cristalográfico de 18.9%. A comparação entre as estruturas da enzima tipo selvagem determinadas nas duas temperaturas levou a resultados interessantes no que diz respeito ao empacotamento cristalino. O resfriamento dos cristais provocou uma redução no volume da cela unitária de 10.5%, tendo a maior variação ocorrido no parâmetro de rede a (14.5%). A sobreposição das celas unitárias mostrou uma rotação do conteúdo da unidade assimétrica de cerca de 5 graus em torno de um eixo aproximadamente paralelo a b. Por outro lado, a análise das estruturas da enzima tipo selvagem e mutante, juntamente com os parâmetros cinéticos, permitiram a discussão a respeito de alguns detalhes do mecanismo catalítico da enzima, principalmente no que se refere ao papel do resíduo Arg249. Tal resíduo, que apresenta grande mobilidade conformacional de sua cadeia lateral, parece estar envolvido na etapa de reorientação de um dos intermediários durante o processo catalítico. / The glycosomal glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) from Typanosoma cruzi and its mutants D210L and D210L-G213D were expressed in E. coli and purified, followed by kinetic and crystallization assays. Both wild type enzyme and D210L-G213D mutant were crystallized in P21 space group and the crystals presented good X-ray diffraction patterns. The three-dimensional structure of the wild type enzyme was determined at 2.5 and 2.15 A resolution from data collected at 277 and 100 K respectively. The structures were refined to a crystallographic R-factor of 16.0% for data collected at 277 K and 18.8% for those collected at 100 K. Also, the structure of the D210L-G213D mutant was solved at 2.15 A resolution and refined to a crystallographic R-factor of 18.9% with good geometry indicators. Comparison between the wild type enzyme structures solved at both temperatures led to interesting results concerning the crystal packing. Flash-cooled crystals presented a 10.5% shrink in the unit cell volume being the major reduction observed in the parameter a (14.5%). Superposition of the unit cells showed a global rotation of the asyrnmetric unit content of about 5 degrees around an axis approximately parallel to b. On the other hand, the analysis of the wild type and mutant enzyme structures, together with the kinetic parameters, allowed a discussion about some catalytic mecanism details, mainly the role of the Arg249 residue. The results showed that this residue might be involved in the reorientation of one of the intermediates during the catalytic process.

Doenças como malária, esquistossomose, filaríase linfática, dengue, leishmaniose e mal de Chagas são endêmicas em países tropicais. Referente ao período entre 1975 e 2004, apenas 1% dos 1.556 novos fármacos registrados foi destinado ao tratamento destas doenças. Somente a doença de Chagas possui aproximadamente 18 milhões de casos em todo mundo. Até o momento, a quimioterapia para o tratamento dessa antropozoonose constitui-se basicamente de dois fármacos, o nifurtimox, proscrito no Brasil, e o benznidazol. Estes fármacos, além de apresentarem vários efeitos colaterais, são pouco eficazes, o que dificulta a adesão dos pacientes ao tratamento. Diante da necessidade imediata de novos fármacos para o combate de tripanossomíase americana, estratégias de modificação molecular têm se mostrado como ferramenta promissora para obtenção de novos fármacos, geralmente inspirados na estrutura molecular de fármacos já conhecidos. A estratégia de modificação molecular permite aumentar as chances de sucesso no processo de descoberta de novos fármacos, reduzindo tempo e custo da pesquisa. Este trabalho teve como objetivo o planejamento, a síntese e a avaliação da atividade anti-T. cruzi e a identificação das propriedades físico-químicas que são responsáveis por modular a atividade anti-T. cruzi da série dos 2-[5-nitrotiofeno- 2-il]-3-acetil-5-[4-fenil-substituído]-2,3-diidro-1,3,4-oxadiazolinas, compostos com estrutura análoga à nifuroxazida, fármaco antimicrobiano que também apresenta atividade antiparasitária. O planejamento da série de compostos estudados foi realizado com base no diagrama de Craig. A obtenção dos derivados 1,3,4-oxadiazolínicos foi realizada em quatro etapas sintéticas: esterificação, amonólise, obtenção da base de Schiff e ciclização oxidativa. As estruturas planejadas foram confirmadas por RMN 1H e RMN 13C, enquanto a pureza foi avaliada pela faixa de fusão e de análise elementar de CHN. A atividade antiparasitária dos compostos foi determinada frente à cepa Y da forma epimastigota do T. cruzi e a concentração de parasitas foi quantificada através da absorbância em espectrofotômetro UV/Vis (λ = 580 nm). Os quinze compostos da série foram avaliados em 6 diferentes concentrações (3,75; 5; 7,5 ; 10; 15; 20 µM), sendo que somente o etoxi-derivado não foi mais ativo que o fármaco padrão, o benznidazol. Entre os compostos analisados identificaram-se o mais e o menos ativo da série, respectivamente: o 2-[5-nitro-tiofeno-2-il]-3-acetil-5-[4 fenil-acetoxi]-2,3-diidro-1,3,4-oxadiazolinas (IC50=7,91 µM) e o 2-[5-nitrotiofeno-2-il]-3-acetil-5-[4 fenil-etoxi]-2,3-diidro-1,3,4-oxadiazolinas ((IC50=26,60 µM). Através de estudos de QSAR-2D, a atividade anti-T. cruzi foi correlacionada com descritores físico-químicos, como a hidrofobicidade, os efeitos eletrônicos e o volume molecular. Com a aplicação de modelos matemáticos, ficou evidenciado que a atividade anti-T. cruzi desta série de compostos sofre notável influência da hidrofobicidade e dos efeitos eletrônico de ressonância, o que permite a continuidade deste trabalho através da variação planejada destas propriedades, visando identificar o análogo mais potente da série de compostos estudados. / Diseases like malaria, schistosomiasis, lymphatic filariasis, dengue, leishmaniasis and Chagas\'disease are endemic in tropical countries. From 1975 to 2004, only 1% of 1.556 new drugs were registered for the treatment of these diseases. Chagas disease itself has approximately 18 million of cases worldwide, and the chemotherapy for the treatment of this anthropozoonosis consists basically of two drugs, nifurtimox, which is prohibited in Brazil, and benznidazole. These drugs have various side effects and can also be ineffective, making patients give up the treatment. Given the immediate need for new drugs to treat american trypanosomiasis, molecular modification strategies have been shown as a promising tool for obtaining new drugs, often inspired by the molecular structure of known drugs. The strategy of molecular modification will increase the chances of success in the discovery process of new drugs, reducing the time and the costs of research. Given the situation above described, this work aims to design synthesis and evaluate the anti-Trypanosoma cruzi activity of new drugs as well as identification physicochemical properties that are responsible for modulating the anti-T. cruzi activity. Series of 2-[5-nitro-thiofen-2-yl]-3-acetyl-5-[4-phenyl-substituted]-2,3-dihydro-1,3,4-oxadiazolines, compounds with similar structure to nifuroxazide, an antimicrobial drug that also has antiparasitic activity. The planning of the series of compounds was carried out based on the Craig diagram. The obtainment of the1,3,4-oxadiazolinics derivatives was performed with four synthetic steps, as follows: esterification, ammonolysis, obtention of the Schiff base and oxidative cyclization. The designed structures were confirmed by 1H and 13C NMR and purity was assessed by melting point and elemental analysis of CHN. The antiparasitic activity of compounds was determined against the Y strain of T. cruzi in the epimastigote form and the concentration of parasites was quantified by absorbance in a spectrophotometer UV / Vis (λ = 580 nm). The fifteen compounds obtained were evaluated in six different concentrations (3.75, 5, 7.5, 10, 15, 20 µM), and only the ethoxy-derivative was less active than the standard drug, benznidazole. The 2-[5-nitrothiofen- 2-yl]-3-acetyl-5-[4-acetoxyphenyl]-2,3-dihydro-1,3,4-oxadiazolines (IC50=7.91µM) and of 2-[5-nitro-thiofen-2-yl]-3-acetyl-5-[4-etoxyphenyl]-2,3-dihydro-1,3,4-oxadiazolines (IC50=26.60 µM) derivatives were identified as the most and the least active of the series, respectively. Through 2D-QSAR studies, the anti-T. cruzi activity was correlated with physicochemical descriptors such as hydrophobicity, molecular volume and electronic effects. Applying mathematical models, it became evident that the activity of anti-T. cruzi activity in this series of compounds undergoes remarkable influence of hydrophobicity and electronic effects of resonance, which allows the continuity of the work planned by varying these properties to identify the most potent analogue among the series of compounds studied.

Doenças como malária, esquistossomose, filaríase linfática, dengue, leishmaniose e mal de Chagas são endêmicas em países tropicais. Referente ao período entre 1975 e 2004, apenas 1% dos 1.556 novos fármacos registrados foi destinado ao tratamento destas doenças. Somente a doença de Chagas possui aproximadamente 18 milhões de casos em todo mundo. Até o momento, a quimioterapia para o tratamento dessa antropozoonose constitui-se basicamente de dois fármacos, o nifurtimox, proscrito no Brasil, e o benznidazol. Estes fármacos, além de apresentarem vários efeitos colaterais, são pouco eficazes, o que dificulta a adesão dos pacientes ao tratamento. Diante da necessidade imediata de novos fármacos para o combate de tripanossomíase americana, estratégias de modificação molecular têm se mostrado como ferramenta promissora para obtenção de novos fármacos, geralmente inspirados na estrutura molecular de fármacos já conhecidos. A estratégia de modificação molecular permite aumentar as chances de sucesso no processo de descoberta de novos fármacos, reduzindo tempo e custo da pesquisa. Este trabalho teve como objetivo o planejamento, a síntese e a avaliação da atividade anti-T. cruzi e a identificação das propriedades físico-químicas que são responsáveis por modular a atividade anti-T. cruzi da série dos 2-[5-nitrotiofeno- 2-il]-3-acetil-5-[4-fenil-substituído]-2,3-diidro-1,3,4-oxadiazolinas, compostos com estrutura análoga à nifuroxazida, fármaco antimicrobiano que também apresenta atividade antiparasitária. O planejamento da série de compostos estudados foi realizado com base no diagrama de Craig. A obtenção dos derivados 1,3,4-oxadiazolínicos foi realizada em quatro etapas sintéticas: esterificação, amonólise, obtenção da base de Schiff e ciclização oxidativa. As estruturas planejadas foram confirmadas por RMN 1H e RMN 13C, enquanto a pureza foi avaliada pela faixa de fusão e de análise elementar de CHN. A atividade antiparasitária dos compostos foi determinada frente à cepa Y da forma epimastigota do T. cruzi e a concentração de parasitas foi quantificada através da absorbância em espectrofotômetro UV/Vis (λ = 580 nm). Os quinze compostos da série foram avaliados em 6 diferentes concentrações (3,75; 5; 7,5 ; 10; 15; 20 µM), sendo que somente o etoxi-derivado não foi mais ativo que o fármaco padrão, o benznidazol. Entre os compostos analisados identificaram-se o mais e o menos ativo da série, respectivamente: o 2-[5-nitro-tiofeno-2-il]-3-acetil-5-[4 fenil-acetoxi]-2,3-diidro-1,3,4-oxadiazolinas (IC50=7,91 µM) e o 2-[5-nitrotiofeno-2-il]-3-acetil-5-[4 fenil-etoxi]-2,3-diidro-1,3,4-oxadiazolinas ((IC50=26,60 µM). Através de estudos de QSAR-2D, a atividade anti-T. cruzi foi correlacionada com descritores físico-químicos, como a hidrofobicidade, os efeitos eletrônicos e o volume molecular. Com a aplicação de modelos matemáticos, ficou evidenciado que a atividade anti-T. cruzi desta série de compostos sofre notável influência da hidrofobicidade e dos efeitos eletrônico de ressonância, o que permite a continuidade deste trabalho através da variação planejada destas propriedades, visando identificar o análogo mais potente da série de compostos estudados. / Diseases like malaria, schistosomiasis, lymphatic filariasis, dengue, leishmaniasis and Chagas\'disease are endemic in tropical countries. From 1975 to 2004, only 1% of 1.556 new drugs were registered for the treatment of these diseases. Chagas disease itself has approximately 18 million of cases worldwide, and the chemotherapy for the treatment of this anthropozoonosis consists basically of two drugs, nifurtimox, which is prohibited in Brazil, and benznidazole. These drugs have various side effects and can also be ineffective, making patients give up the treatment. Given the immediate need for new drugs to treat american trypanosomiasis, molecular modification strategies have been shown as a promising tool for obtaining new drugs, often inspired by the molecular structure of known drugs. The strategy of molecular modification will increase the chances of success in the discovery process of new drugs, reducing the time and the costs of research. Given the situation above described, this work aims to design synthesis and evaluate the anti-Trypanosoma cruzi activity of new drugs as well as identification physicochemical properties that are responsible for modulating the anti-T. cruzi activity. Series of 2-[5-nitro-thiofen-2-yl]-3-acetyl-5-[4-phenyl-substituted]-2,3-dihydro-1,3,4-oxadiazolines, compounds with similar structure to nifuroxazide, an antimicrobial drug that also has antiparasitic activity. The planning of the series of compounds was carried out based on the Craig diagram. The obtainment of the1,3,4-oxadiazolinics derivatives was performed with four synthetic steps, as follows: esterification, ammonolysis, obtention of the Schiff base and oxidative cyclization. The designed structures were confirmed by 1H and 13C NMR and purity was assessed by melting point and elemental analysis of CHN. The antiparasitic activity of compounds was determined against the Y strain of T. cruzi in the epimastigote form and the concentration of parasites was quantified by absorbance in a spectrophotometer UV / Vis (λ = 580 nm). The fifteen compounds obtained were evaluated in six different concentrations (3.75, 5, 7.5, 10, 15, 20 µM), and only the ethoxy-derivative was less active than the standard drug, benznidazole. The 2-[5-nitrothiofen- 2-yl]-3-acetyl-5-[4-acetoxyphenyl]-2,3-dihydro-1,3,4-oxadiazolines (IC50=7.91µM) and of 2-[5-nitro-thiofen-2-yl]-3-acetyl-5-[4-etoxyphenyl]-2,3-dihydro-1,3,4-oxadiazolines (IC50=26.60 µM) derivatives were identified as the most and the least active of the series, respectively. Through 2D-QSAR studies, the anti-T. cruzi activity was correlated with physicochemical descriptors such as hydrophobicity, molecular volume and electronic effects. Applying mathematical models, it became evident that the activity of anti-T. cruzi activity in this series of compounds undergoes remarkable influence of hydrophobicity and electronic effects of resonance, which allows the continuity of the work planned by varying these properties to identify the most potent analogue among the series of compounds studied.