Guzmania monostachia é uma bromélia-tanque epífita que apresenta uma alta plasticidade fotossintética, sendo capaz de regular positivamente o metabolismo ácido das crassuláceas (CAM) em resposta ao déficit hídrico. Também foi visto para essa espécie que o incremento do CAM se dá de forma diferente ao longo do comprimento da folha, sendo mais intenso na região apical do que na basal. Trabalhos anteriores indicaram que o óxido nítrico (NO) parece estar envolvido na regulação do CAM, mas nada se sabe dos mecanismos pelos quais isso ocorre. Uma vez que parecem não existir receptores específicos de NO, acredita-se que ele seja capaz de se ligar diretamente às proteínas, através de um processo conhecido como nitrosilação. O presente trabalho visou determinar se o NO estaria atuando na regulação do CAM em G. monostachia através da nitrosilação de proteínas relacionadas a esse metabolismo. Para tanto, foram feitos três desenhos experimentais. No primeiro, folhas destacadas de G. monostachia foram mantidas por 7 dias em água (controle) ou em uma solução contendo 30% de PEG (déficit hídrico). Durante esse período, foram monitorados parâmetros indicativos de estresse (porcentagem de água, potencial hídrico, além dos teores de clorofilas, carotenoides e proteínas), CAM (atividade da fosfoenolpiruvato carboxilase - PEPC - e acúmulo noturno de malato e citrato) e emissão de NO. Todas as análises foram feitas nas porções basal e apical das folhas. Ao final dos 7 dias de escassez hídrica, também foram feitas dosagens de nitrosotióis totais e a visualização em gel de proteínas nitrosiladas na porção apical. O segundo experimento visou verificar a modulação da atividade de enzimas pela nitrosilação. Para tanto, extratos proteicos de folhas de G. monostachia foram incubados com glutationa reduzida (GSH) ou S-nitrosoglutationa (GSNO) para, em seguida,verificar diferenças nas atividades das enzimas PEPC, malato desidrogenase (MDH), ascorbato peroxidase (APX), catalase (CAT) e isocitrato desidrogenase dependente de NADP+ (NADP-ICDH). No terceiro experimento foi feita a aplicação do sequestrador de NO 2-(4-carboxifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxil-3-óxido (cPTIO) ou de NO gasoso em folhas destacadas mantidas em PEG ou água, respectivamente. Os resultados mostraram que o aumento do CAM se dá seis dias após o início do tratamento de déficit hídrico, concomitantemente com o aumento na produção de NO. Esses dois fenômenos ocorreram somente na porção apical da folha. A quantidade de proteínas nitrosiladas, no entanto, diminuiu em resposta ao déficit hídrico nesta porção, indicando que o aumento na emissão de NO pode ser oriundo de uma desnitrosilação de proteínas. De fato, a atividade de três (PEPC, APX e NADP-ICDH) das cinco enzimas analisadas mostraram uma diminuição em resposta ao tratamento com GSNO. Dessa forma, o NO parece não se ligar diretamente às enzimas do CAM para regular sua atividade. Mesmo assim, a aplicação de NO gasoso causou um aumento em todos os parâmetros relacionados ao CAM após 5 dias, sugerindo algum tipo de controle transcricional sobre genes relacionados a esse tipo de fotossíntese / Guzmania monstachia is an epiphytic tank-bromeliad capable of up-regulating CAM under water deficit. Moreover, the increase in CAM is stronger in the apical portion of the leaf, when compared to the base. Nitric oxide (NO) is a signaling molecule involved in the regulation of CAM, but the mechanisms underlying this phenomenon are still largely unknown. NO is capable of interacting with proteins through a process known as nitrosylation. Here, we investigated whether NO could regulate CAM by protein nitrosylation. In order to do so, we performed three experiments. In the first one, detached leaves were maintained for 7 days in water or in a solution containing 30% of poliethylene glycol 6000 (PEG). During this period, the water percentage, water potential, contents of chlorophylls and carotenoids, phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) activity, nocturnal malate and citrate accumulation, and NO emission were monitored daily in the basal and apical portions of the leaf. At the seventh day of the water shortage, quantification of total nitrosothiols and in-gel visualization of nitrosylated proteins were also performed in the apical portion. The second experiment consisted in incubating proteic extracts of G. monostachia with reducedglutathione (GSH) or S-nitrosoglutathione (GSNO) to assess the impact of nitrosylation in enzymatic activity. The enzymes selected to this step were PEPC, malate dehydrogenase (MDH), ascorbate peroxydase (APX), catalase (CAT) and NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase (NADP-ICDH). The third experiment consisted in the application of the NO scavenger 2-(4-carboxifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxil-3-óxido (cPTIO) or gaseous NO to leaves maintained in water or in PEG 30%, respectively. The results show that there was an increase of both CAM and NO in the leaf apex at the sixth day of water deficit. The level of nitrosylated proteins, however, decreased in this portion, indicating that the emission of NO may be the result of a de-nitrosylation process. In fact, the activity of three (PEPC, APX and NADP-ICDH) out of five enzymes analyzed decreased with nitrosylation. Therefore, NO does not regulate directly the activity of CAM enzymes. Nevertheless, exogenous NO increased all of the assayed CAM parameters after 5 days, indicating transcriptional control of CAM-related genes

Guzmania monostachia é uma bromélia-tanque epífita que apresenta uma alta plasticidade fotossintética, sendo capaz de regular positivamente o metabolismo ácido das crassuláceas (CAM) em resposta ao déficit hídrico. Também foi visto para essa espécie que o incremento do CAM se dá de forma diferente ao longo do comprimento da folha, sendo mais intenso na região apical do que na basal. Trabalhos anteriores indicaram que o óxido nítrico (NO) parece estar envolvido na regulação do CAM, mas nada se sabe dos mecanismos pelos quais isso ocorre. Uma vez que parecem não existir receptores específicos de NO, acredita-se que ele seja capaz de se ligar diretamente às proteínas, através de um processo conhecido como nitrosilação. O presente trabalho visou determinar se o NO estaria atuando na regulação do CAM em G. monostachia através da nitrosilação de proteínas relacionadas a esse metabolismo. Para tanto, foram feitos três desenhos experimentais. No primeiro, folhas destacadas de G. monostachia foram mantidas por 7 dias em água (controle) ou em uma solução contendo 30% de PEG (déficit hídrico). Durante esse período, foram monitorados parâmetros indicativos de estresse (porcentagem de água, potencial hídrico, além dos teores de clorofilas, carotenoides e proteínas), CAM (atividade da fosfoenolpiruvato carboxilase - PEPC - e acúmulo noturno de malato e citrato) e emissão de NO. Todas as análises foram feitas nas porções basal e apical das folhas. Ao final dos 7 dias de escassez hídrica, também foram feitas dosagens de nitrosotióis totais e a visualização em gel de proteínas nitrosiladas na porção apical. O segundo experimento visou verificar a modulação da atividade de enzimas pela nitrosilação. Para tanto, extratos proteicos de folhas de G. monostachia foram incubados com glutationa reduzida (GSH) ou S-nitrosoglutationa (GSNO) para, em seguida,verificar diferenças nas atividades das enzimas PEPC, malato desidrogenase (MDH), ascorbato peroxidase (APX), catalase (CAT) e isocitrato desidrogenase dependente de NADP+ (NADP-ICDH). No terceiro experimento foi feita a aplicação do sequestrador de NO 2-(4-carboxifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxil-3-óxido (cPTIO) ou de NO gasoso em folhas destacadas mantidas em PEG ou água, respectivamente. Os resultados mostraram que o aumento do CAM se dá seis dias após o início do tratamento de déficit hídrico, concomitantemente com o aumento na produção de NO. Esses dois fenômenos ocorreram somente na porção apical da folha. A quantidade de proteínas nitrosiladas, no entanto, diminuiu em resposta ao déficit hídrico nesta porção, indicando que o aumento na emissão de NO pode ser oriundo de uma desnitrosilação de proteínas. De fato, a atividade de três (PEPC, APX e NADP-ICDH) das cinco enzimas analisadas mostraram uma diminuição em resposta ao tratamento com GSNO. Dessa forma, o NO parece não se ligar diretamente às enzimas do CAM para regular sua atividade. Mesmo assim, a aplicação de NO gasoso causou um aumento em todos os parâmetros relacionados ao CAM após 5 dias, sugerindo algum tipo de controle transcricional sobre genes relacionados a esse tipo de fotossíntese / Guzmania monstachia is an epiphytic tank-bromeliad capable of up-regulating CAM under water deficit. Moreover, the increase in CAM is stronger in the apical portion of the leaf, when compared to the base. Nitric oxide (NO) is a signaling molecule involved in the regulation of CAM, but the mechanisms underlying this phenomenon are still largely unknown. NO is capable of interacting with proteins through a process known as nitrosylation. Here, we investigated whether NO could regulate CAM by protein nitrosylation. In order to do so, we performed three experiments. In the first one, detached leaves were maintained for 7 days in water or in a solution containing 30% of poliethylene glycol 6000 (PEG). During this period, the water percentage, water potential, contents of chlorophylls and carotenoids, phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) activity, nocturnal malate and citrate accumulation, and NO emission were monitored daily in the basal and apical portions of the leaf. At the seventh day of the water shortage, quantification of total nitrosothiols and in-gel visualization of nitrosylated proteins were also performed in the apical portion. The second experiment consisted in incubating proteic extracts of G. monostachia with reducedglutathione (GSH) or S-nitrosoglutathione (GSNO) to assess the impact of nitrosylation in enzymatic activity. The enzymes selected to this step were PEPC, malate dehydrogenase (MDH), ascorbate peroxydase (APX), catalase (CAT) and NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase (NADP-ICDH). The third experiment consisted in the application of the NO scavenger 2-(4-carboxifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxil-3-óxido (cPTIO) or gaseous NO to leaves maintained in water or in PEG 30%, respectively. The results show that there was an increase of both CAM and NO in the leaf apex at the sixth day of water deficit. The level of nitrosylated proteins, however, decreased in this portion, indicating that the emission of NO may be the result of a de-nitrosylation process. In fact, the activity of three (PEPC, APX and NADP-ICDH) out of five enzymes analyzed decreased with nitrosylation. Therefore, NO does not regulate directly the activity of CAM enzymes. Nevertheless, exogenous NO increased all of the assayed CAM parameters after 5 days, indicating transcriptional control of CAM-related genes

Les Broméliacées sont une vaste famille de plantes à fleurs néotropicales dont certaines ont la capacité de retenir de l’eau et des détritus grâce à l’agencement de leurs feuilles qui forment un phytotelme (du grec phyto : plante et telma : mare). Elles fournissent ainsi un habitat pour de nombreux organismes aquatiques, depuis les micro-organismes jusqu’aux vertébrés. Dans cet écosystème aquatique, les détritus collectés sont le plus souvent de la litière qui constitue la base du réseau trophique dont dépend la Broméliacée pour l’acquisition des nutriments. Ces phytotelmes forment des microcosmes aquatiques naturels très nombreux et distribués dans des environnements très divers, allant du sous-bois de la forêt tropicale à des sites très exposés comme les inselbergs. De plus, certaines espèces entretiennent des relations mutualistes très poussées avec des invertébrés terrestres tels que les fourmis, alors que d’autres, qui ont évolué dans des environnements très pauvres en nutriments, ont eu recours à l’insectivorie. Si les communautés d’invertébrés de ces phytotelmes ont fait l’objet de nombreux projets de recherche en écologie, nos connaissances sur la structure des communautés de micro-organismes sont très parcellaires, et les facteurs de contrôle qui façonnent ces communautés sont le plus souvent déduits d’études réalisées dans d’autres écosystèmes aquatiques. L’objectif général de ce travail de thèse a été d’analyser l’influence de facteurs environnementaux et biologiques sur la structure et la diversité des communautés microbiennes aquatiques des phytotelmes des Broméliacées localisées dans des environnements contrastés de Guyane française. Nous avons examiné les communautés aquatiques de 8 espèces de Broméliacées à réservoirs situées sur deux sites en Guyane française, en considérant différentes variables abiotiques et biotiques, tels que les traits végétatifs des plantes, la taille de l’habitat, les groupes fonctionnels d’invertébrés, l’association mutualiste avec des fourmis, etc. Les résultats obtenus mettent en lumière l’ubiquité de différents groupes de microorganismes (virus, bactéries, champignons, algues eucaryotes et cyanobactéries, protozoaires et micro-métazoaires) dans cet écosystème et l’importance fonctionnelle d’organismes autotrophes dans ce réseau trophique considéré jusque-là comme exclusivement détritique. Ces plantes procurent ainsi une grande variété d’environnements aquatiques, depuis des écosystèmes exclusivement hétérotrophes (e.g. Guzmania lingulata) jusqu’à des écosystèmes ayant un fonctionnement autotrophe dominant, en particulier chez les plantes les plus exposées (e.g.Catopsis berteroniana). La structure du réseau trophique microbien des Broméliacées dépend en grande partie (1) de la structure de l’habitat, c’est-à-dire des traits végétatifs des plantes tels que la taille de celles-ci et le nombre de réservoirs, et (2) des conditions environnementales dans lesquelles sont situées les plantes, à savoir l’exposition à la lumière et l’approvisionnement en ressources détritiques. Pour la Broméliacée de jardins de fourmis Aechmea mertensii, l’identité de la fourmi associée conditionne la structure de l’habitat et la localisation de la plante, ce qui influence indirectement la structure du réseau trophique microbien. Les invertébrés aquatiques sont impliqués dans le contrôle des communautés microbiennes de par leur filtration sur les micro-organismes. L’analyse des patterns de distribution suggère toutefois que leurs activités d’excrétion, de fragmentation des détritus et de recyclage de la matière organique ont un effet positif sur le réseau microbien. Les communautés bactériennes de la Broméliacée insectivore Catopsis berteroniana, sont principalement modulées par le nombre de carcasses de fourmis, qui constituent l’essentiel des proies de cette plante. (...) / Bromeliads are a large family of neotropical flowering plants. The leaves of many bromeliads are tightly interlocking, forming wells that collect water and organic detritus. These phytotelmata (plant-held water) provide habitat for numerous aquatic organisms ranging from microorganisms to vertebrates. In this aquatic ecosystem, detritus (usually leaf litter) form the basis of a food web upon which depends the nutrition of the bromeliad. In tropical forests, these phytotelmata form abundant natural aquatic microcosms, distributed in a large range of tropical environments, from understory to overstory. In addition, some species of tank-bromeliads share mutualistic relationships with terrestrial invertebrates such as ants, while others have evolved in nutrient-poor environments and have become insectivorous. Although numerous ecological studies have dealt with invertebrates communities, analyses of the structure of microbial communities in tank-bromeliads remain very scarce and factors that shape these communities derived mostly from studies of others aquatic ecosystems. Here, we analyzed the impact of environmental and biological factors on the structure and the diversity of aquatic microbial communities in tank-bromeliads located in contrasted environments in French Guiana. We examined aquatic communities inhabiting tanks of 8 bromeliad species located in two sites of French Guiana, and analyzed the impact of different abiotic and biotic variables, such as vegetative traits of plants, habitat size, functional feeding groups of invertebrates, mutualistic association with ants, etc. Our results highlight the ubiquity of microbial groups (virus, bacteria, fungi, eukaryotic algae and cyanobacteria, protozoans and micrometazoans) in this ecosystem and the significance of autotrophic organisms in this detritus-based system. These plants provide a wide variety of aquatic environments ; from strict heterotrophic systems (e.g. Guzmania lingulata) to mixed systems in which the autotrophic compartment sometimes dominates (e.g. Catopsis berteroniana). The structure of the microbial food web in tank-bromeliad largely depends on (1) the habitat structure (i.e. the vegetative traits of the plants such as plant height and the number of wells), and (2) the environmental conditions of the plants (i.e. light exposure and input of detrital organic matter). For the ant-garden bromeliad Aechmea mertensii, we found that the identity of the associated ant affects both habitat structure and plant location, which in turn influence the structure of the microbial food web. Through their filtration, aquatic invertebrates are involved in the control of microbial communities. However, the analysis of the distribution patterns suggests that their activities of excretion, detrital processing and nutrient cycling positively affect the microbial food web. In the insectivorous tank-bromeliad Catopsis berteroniana, bacterial communities were mostly driven by the number of dead ants, which represent the main trapped preys in this plant. This work highlights the huge diversity of aquatic ecosystems that are created by bromeliads, and their significance for the maintenance of taxonomic and functional diversity of microorganisms in tropical forests.

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