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Méthodes d'analyse et variations du microbiote digestif / Gut microbiota : study methods and variationsDubourg, Grégory 16 September 2016 (has links)
L’étude de la composition de la flore digestive ainsi que son implication avec la santé et les maladies est devenue un enjeu majeur. Nous avons étudié la flore de malades traités par de très nombreux antibiotiques, à la fois par culturomics et par pyroséquençage. Ce travail a montré une diminution importante du nombre de bactéries différentes colonisant le tube digestif après traitement. Cette diminution était d’autant plus importante que le traitement était prolongé. Les bactéries offrant une protection immunitaire contre certains pathogènes, il est à présent proposé des vaccinations contres des microorganismes invasifs après traitement antibiotique au long cours. Par ailleurs, les techniques de séquençage ont montré pour deux des échantillons un haut taux de colonisation par Akkermansia muciniphila, un microorganisme appartenant au phylum des Verrucomicrobia. Ce résultat a par ailleurs été confirmé en utilisant des techniques d’hybridation de fluorescence in situ (FISH). Les tentatives de culture ce microorganisme se sont révélées infructueuses. Au final ce travail nous aura permis de cultiver 7 nouvelles espèces que nous avons décrites en utilisant la taxonogénomique, une approche incluant des données phénotypiques et le séquençage du génome.Nous avons également étudié la flore de patients infectés par le virus du VIH par métagénomique et avons observé une augmentation considérable des bactéries qui supportent l’oxygène, alors que les bactéries intolérantes étaient très diminuées. Ces changements étaient associés aux marqueurs de progression de la maladie, ouvrant la voie à une supplémentation en antioxydants. / The study of the composition of the intestinal flora as well as its involvement with health and disease has become a major issue.We studied the flora of patients treated by broad-spectrum antibiotics by both culture and pyrosequencing. This work showed a significant decrease in the number of different bacteria colonizing the digestive tract after treatment. This decrease was even more important that treatment was extended. Bacteria interacting with immune protection against some pathogens, it is now proposed vaccinations against invasive microorganisms after prolonged antibiotic treatment. Furthermore, the sequencing techniques have shown for two samples a high-level colonization by Akkermansia muciniphila a microorganism belonging to the phylum Verrucomicrobia. Despite the successive failures of culture attempt of this organism, this finding was also confirmed using fluorescence in situ hybridization technique (FISH). Ultimately this work has enabled us to discover 7 new species that have been described using the taxonomogenomics approach which includes phenotypic data and genome sequencing.We also studied the flora of HIV-infected patients by metagenomics, and observed a significant increase in bacteria that withstand oxygen, while intolerant bacteria were deceased. These changes were associated with markers of disease progression, opening the way for antioxidant supplementation.
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Exploration du microbiote respiratoire humain / Human respiratory microbiota explorationMbogning Fonkou, Maxime Descartes 22 November 2018 (has links)
L'établissement d'un répertoire exhaustif ainsi que son élargissement constituent les deux objectifs principaux de ce travail. Nous avons d'abord établi la toute première liste de bactéries identifiées par culture des voies respiratoires au travers de la littérature scientifique. Nous répertorions ici 756 espèces, ce qui représente 27,23% de l'ensemble des bactéries isolées chez l'homme lorsque comparé au répertoire établi récemment par Bilen et al. Parmi ces bactéries, 514 avaient déjà été isolées au moins une fois dans les poumons. Plus de la moitié (i.e., 65,5%) des bactéries isolées pour la première fois dans des échantillons de poumons, ont été identifiées après les années 2000, soulignant la nécessité de poursuivre les efforts pour cultiver des microbes à partir des échantillons de voies respiratoires. Nous pensons que la combinaison de méthodes de culture à grande échelle telles que la culturomique et la métagénomique aidera à mieux décrire le microbiote pulmonaire. Des études antérieures sur le microbiote digestif le démontre. Nous avons ensuite utilisé des approches culturomiques et métagénomiques pour explorer le microbiote respiratoire d'individus sains. Nous avons isolé 193 bactéries par culturomics. Parmi ceux-ci, nous avons ajouté 84 au répertoire du microbiote respiratoire, dont 14 nouvelles espèces. En utilisant des approches métagénomiques, 139 OTU identifiées au rang de l'espèce dont seulement 49 (17,3%) étaient également retrouvées par culturomique, confortant la complémentarité des deux approches. Enfin, nous avons utilisé la taxonogénomique, une nouvelle approche permettant la description de nouvelles espèces bactériennes, pour décrire 19 bactéries. / The establishment of a comprehensive directory and its expansion through the use of high-speed culture methods are the two main objectives of this thesis work. We first established the first list of bacteria identified by airway culture through the scientific literature. Here we list 756 species, representing 27.23% of all bacteria isolated from humans when compared to the recently established repertoire of Bilen et al. Of these bacteria, 514 had already been isolated at least once in the lungs. Considering bacteria isolated for the first time in lung samples, more than half (ie, 65.5%) were identified after the 2000s, highlighting the need for continued efforts to grow microbes from lane samples respiratory. We believe that the combination of large scale culture methods such as culturomics and metagenomics will help to better describe the pulmonary microbiota. Previous studies on the digestive microbiota have shown the complementarity of these two approaches. We then used culturomic and metagenomic approaches to explore the respiratory microbiota of healthy individuals. We isolated 193 bacteria by culturomics. Of these, we added 84 bacteria to the repertoire of the respiratory microbiota, including 14 new species discovered. Using metagenomic approaches, 139 OTUs identified with the rank of the species of which only 49 (17.3%) were also recovered by culturomics, reinforcing the complementarity of the two approaches. Finally, we used taxonogenomics, a new approach for describing new bacterial species by integrating genomic and proteomic data with those that are classically integrated. Using this approach, 19 bacteria were described as part of this work.
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Les maladies associées à la dysbiose explorées par analyse génomique / Dysbiosis-associated diseases explored by whole-genome analysisAlhosny, Michel 22 November 2018 (has links)
La dysbiose est une cause importante dans la survenue de maladies, favorisant la prolifération de pathogènes ou induisant l’inflammation. L’étude de ce phénomène est devenue possible grâce aux approches d’analyse génomique (AG) associé avec d’autres techniques. L’entérocolite nécrosante (ECN) et l’infection du pied diabétique (IPD) demeurent deux maladies associées à la dysbiose dans lesquels différents bactéries ont été décrites, notamment C. butyricum dans l’ECN, E. coli et S. aureus dans l’IPD. Dans le cadre de l’ECN, C. butyricum demeure l’espèce la plus fréquente chez les ECN. L’identification clusters liés géographiquement et en fonction du temps. Le portage asymptomatique est suggéré par une similarité génomique des souches patients et contrôles. La prédiction d’un gène de β-hémolysine ainsi leur effet cytotoxique sur les cellules Jurkat avait été observé. De même, sur les cellules Caco-2 malgré le KO du gène de β-hémolysine. En se basant sur l’analyse physico-chimique du surnageant bactérien, nous avons suggéré que la fraction cytotoxique est protéique. La purification de la fraction cytotoxique a permis de trouver une protéine codant pour PspC family possédant un domain conservé commun avec celui de la toxine A/B. L’inactivation du gène codant pour cette protéine n’a pas supprimé l’effet cytotoxique, suggérant la présence d’une combinaison gènes. En parallèle, nous avons ciblé l’impact de C. neonatale par qRPC spécifique rpoB. Cette espèce était plus fréquente chez les patients, ainsi de clones géographiques ont été identifiées. Enfin, des SNPs ont été observés dans des gènes de virulence dans le cas des E. coli et S. aureus isolés de l’IPD. / Dysbiosis remains a main cause during the establishment of several diseases, by promoting bacterial translocation, leading to inflammation process. Specific microorganisms were involved in the pathogenesis of dysbiosis-associated diseases, notably necrotizing enterocolitis (NEC) and diabetic foot (DF). This was possible by the implication of whole-genome analysis (WGA) in association with other techniques. In case of NEC, C. butyricum was significantly associated with in NEC; tested on a South-East French cohort. Geographical and/or temporal clusters were identified, thus genomic relationship between NEC-associated isolates and controls, suggesting the presence of asymptomatic carriage. Genes encoding for β-hemolysin was detected and C. butyricum supernatant exhibited cytotoxic effect on Jurkat cells. Cytotoxic effect was also presented on Caco-2 cells. Supernatant of β-hemolysin-mutant C. butyricum showed enterotoxic effect. Basing on physico-chemical data, we assumed that the evaluated fraction was a protein. Proteomics analysis revealed that PspC family was the cytotoxic protein. This protein owned a glucan-binding domain, shared by C. difficile toxin A/B. The KO of PspC gene was enterotoxic, suggesting by this the existence of a combination of genes. In parallel, a specific rpoB-based qPCR was developed to identify C. neonatale. We found that, C. neonatale was more prevalent in NEC than in controls. Although co-identified in association with C. butyricum. C. neonatale clones were distinguished especially in strains isolated from the same hospital. Regarding to DF infection, SNPs were identified within S. aureus and E. coli genomes, especially in virulent genes.
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