Resistance to antiestrogen therapy remains a significant problem in breast cancer. Low expression of inhibitor of growth 4 (ING4) in primary tumors has been correlated with increased rates of recurrence in estrogen receptor-positive (ER+) breast cancer patients, suggesting a role for ING4 in ER signaling. This study provides evidence that ING4 inhibits ER activity. ING4 overexpression increased the sensitivity of T47D and MCF7 ER+ breast cancer cells to hormone deprivation. ING4 attenuated maximal estrogen-dependent cell growth without affecting the dose-response of estrogen. These results indicated that ING4 functions as a noncompetitive inhibitor of estrogen signaling and may inhibit estrogen-independent ER activity. Supportive of this, treatment with fulvestrant but not tamoxifen rendered T47D cells sensitive to hormone deprivation as did ING4 overexpression. ING4 did not affect nuclear ER alpha protein expression, but repressed selective ER-target gene transcription. Taken together, these results demonstrated that ING4 inhibited estrogen-independent ER activity, suggesting that ING4-low breast tumors recur faster due to estrogen-independent ER activity that renders tamoxifen less effective. This study puts forth fulvestrant as a proposed therapy choice for patients with ING4-low ER+ breast tumors.

Afin d’étudier la fonction de TFF1 (Trefoil Factor 1) dans les cancers du sein, de grandes quantités de TFF1 recombinant semblable au TFF1 humain physiologique sont indispensables.Parmi différents systèmes de production étudiés, seul TFF1 recombinant produit dans E.Coli s’est avéré avoir le bon poids moléculaire et être fonctionnel. En effet, la présence de TFF1 produit dans E.Coli a permis d’augmenter la capacité migratoire des cellules épithéliales mammaires MCF10A de 70 % au cours d’un test de reconstitution in vitro.L’étude de l’hétérodimère TFF1-GKN2 (GKN: Gastrokine2) , précédemment mis en évidence dans l’estomac humain sain, suggère que sa formation est peu spécifique. De plus, la co-exprimant TFF1 et GKN2 dans les cellules gastriques n’a pas d’impact, ni sur la prolifération, ni sur la migration cellulaire.En conclusion, seul le système d’expression bactérien permet l’obtention de TFF1 recombinant fonctionnel. Une formation et une éventuelle fonction de l’hétérodimère TFF1-GKN2 semblent peu probables. / In order to study the function of TFF1 (Trefoil Factor 1) in breast cancer, important quantities of recombinant physiologic-like TFF1 peptide is required.Among several production system studied, only E. coli produced TFF1 has a molecular weight identical to the physiological one and is active. Indeed, when compared to the negative control, recombinant TFF1 peptide produced in E. coli can increase the migratory capabilities of MCF10A (mammary epithelial cells) cells by 70% in a wound healing assay.The study of the heterodimer TFF1-GKN2 (GKN: Gastrokine2) , previously shown to form in healthy human stomach, suggest that its formation is not specific. Furthermore the co-expression of TFF1 and GKN2 in gastric cell lines did not impact migration nor proliferation of these cells.In conclusion, only the bacterial expression system (E. coli) has allowed us to obtain functional recombinant TFF1. The specific formation of TFF1-GKN2 heterodimer in vitro seems to be very weak.

Le rétinoblastome, un cancer pédiatrique de la rétine en développement, est la tumeur intraoculaire la plus fréquente chez l’enfant et représente environ 4 % de tous les cancers infantiles. Bien qu'il s'agisse d'une maladie rare, l'hôpital Curie (centre de référence pour le rétinoblastome en France) accueille environ 50 à 60 nouveaux patients chaque année. Notre groupe a précédemment caractérisé deux sous-types de rétinoblastomes. Les tumeurs de type « cone-like » ou sous-type 1 sont plutôt différenciées et homogènes, présentent une surexpression des gènes liés aux cellules cônes (photorécepteurs) de la rétine, sont diagnostiquées cliniquement plus tôt et regroupent la majorité des formes héréditaires et bilatérales. Les tumeurs « mixed-type » ou sous-type 2, présentent une hétérogénéité intra-tumorale et une surexpression des gènes liés aux cellules des cônes et des cellules ganglionnaires de la rétine, sont enrichies en patients unilatéraux qui sont diagnostiqués cliniquement à des âges plus avancés. Nous avons caractérisé le paysage moléculaire et génomique de 102 rétinoblastomes provenant de trois institutions : l'Institut Curie (France), l'Hôpital Garrahan (Argentine) et l'Hôpital Sant Joan de Déu (Espagne). Le développement d'une signature de méthylation par pyroséquençage pour la classification des échantillons nous a permis d'élargir nos échantillons classés, d'une première série de 72 à notre dernière série de 102 tumeurs. L'analyse du paysage mutationnel de notre série a révélé que les tumeurs du sous-type 2 avaient plus de mutations somatiques par échantillon que les tumeurs du sous-type 1. De plus les gènes BCOR et ARID1A étaient les deux seuls gènes mutés de manière récurrente, et identifiés uniquement dans le sous-type 2. En divisant notre cohorte de tumeurs en sous-type 1 et 2, la distribution des mutations le long de RB1 était significativement différente. Par ailleurs, nous avons identifié une région de la protéine RB1 (dans le Domaine A) enrichie en mutations provenant des tumeurs du sous-type 2, avec très peu de mutations du sous-type 1. En plus, nous avons caractérisé deux événements récurrents de fusion chromosomique perturbant le gène DACH1. Les tumeurs de sous-type 2 sont caractérisées par une surexpression de TFF1, non exprimée dans la rétine normale. L'analyse par immunohistochimie de TFF1 dans des tumeurs localement invasives provenant de l'hôpital Garrahan a révélé la présence de cellules TFF1+ envahissant la région rétrolaminaire du nerf optique. Nous avons exploré un possible rôle oncogène de TFF1 dans le rétinoblastome lié à la survie cellulaire, à la migration cellulaire et à l'invasion cellulaire, qui n'a finalement pas été mis en évidence in vitro. Le sous-type moléculaire 2 regroupe les tumeurs MYCN amplifiées et les tumeurs avec une activation de la voie de signalisation MYC et des gènes cibles de MYC. L'utilisation de JQ1 et OTX015 (inhibiteurs des protéines BET) a fortement réduit la viabilité in vitro de lignées cellulaires de rétinoblastomes représentatives du sous-type 2, avec une régulation négative significative du gène et de la protéine MYC/MYCN. Nos résultats préliminaires suggèrent une nouvelle piste thérapeutique par l'inhibition des protéines BET dans le rétinoblastome. Les modèles précliniques largement utilisés dans la recherche sur le rétinoblastome n'ont pas été caractérisés ou classés au niveau moléculaire. Nous avons utilisé la même approche que pour la classification des tumeurs primaires et avons constaté que la plupart des modèles cellulaires et PDX étudiés étaient classés dans le sous-type moléculaire 2 et partageaient des caractéristiques moléculaires, génomiques et protéiques trouvés dans les tumeurs primaires de ce sous-type moléculaire. En conclusion, nous avons pu caractériser de façon plus approfondie le sous-type 2 des rétinoblastomes, qui semble présenter un phénotype plus agressif et qui est le sous-type représenté dans les modèles précliniques analysés. / Retinoblastoma (RB) is a rare pediatric cancer of the developing retina that represents the most common intraocular tumor in children, and accounts for about 4% of all childhood cancers. Although being a rare disease, the Curie Hospital (the referral center for retinoblastoma in France) treats about 50-60 new patients each year. Our group has previously characterized two retinoblastoma subtypes. The cone-like or subtype 1 tumors rather differentiated and homogenous, presenting an overexpression of genes related to cone photoreceptor retinal cells, clinically diagnosed earlier and grouping the majority of hereditary and bilateral forms. The mixed-type or subtype 2 tumors, displaying an intra-tumoral heterogeneity and showing overexpression of genes related to cone and retinal ganglion cells, are enriched in unilateral patients clinically diagnosed at older ages. The general goal of my thesis was to extend the molecular characterization of these subtype 2 retinoblastomas. We characterized the molecular and genomic landscape of retinoblastoma in a series of 102 primary tumors, integrating samples from three institutions: the Curie Institute (France), the Garrahan Hospital (Argentina) and Sant Joan de Déu Hospital (Spain). The development of a pyrosequencing-based tool for sample classification allowed us to enlarge our classed samples, from an initial series of 72, to our final series of 102 tumors. Analysis of the mutational landscape in our series revealed that tumors from the subtype 2 had significantly more somatic mutations per sample than tumors from the subtype 1. Besides RB1 gene, BCOR and ARID1A where the only two recurrently mutated genes, and identified only in the subtype 2. Distribution of mutations alongside the RB1 gene has so far been analyzed in terms of a single group of retinoblastomas. When splitting our cohort in subtype 1 and subtype 2 tumors, the distribution of mutations was significantly different. Besides, we identified a region of the RB1 protein (in Domain A) enriched in mutations from tumors of the subtype 2, and devoid of mutations of the subtype 1. Besides somatic mutations, we characterized two recurrent chromosomal fusion events disrupting DACH1. Subtype 2 tumors are characterized by an overexpression of TFF1, not expressed in the normal retina. Immunohistochemical analysis of TFF1 in locally invasive tumors coming from the Garrahan Hospital revealed the presence of TFF1+ cells invading the retrolaminar region of the optic nerve. We then explored a possible oncogenic role of TFF1 in retinoblastoma related to cell survival, cell migration and cell invasion, which was not fully uncovered. Molecular subtype 2 regroups the MYCN amplified tumors and tumors with MYC signaling pathway activation and upregulation of hallmark MYC target genes. The use of JQ1 and OTX015 (BET bromodomains inhibitors) strongly reduced the viability in vitro of retinoblastoma cell lines representatives of the subtype 2, together with a significant MYC/MYCN gene and protein downregulation. We provided preliminary results to explore a new therapeutic avenue of BET protein inhibition in retinoblastoma. Preclinical models widely used in retinoblastoma research has not been characterized or classified at the molecular level. We have used the same approach as for primary human tumor’s classification, and found that most cellular and PDX models studied classed in the molecular subtype 2 and shared many of the molecular, genomic and protein characteristics found in primary tumors of this molecular subtype. Taken together, we have performed a deeper characterization of subtype 2 retinoblastomas, which seems to represent a more aggressive phenotype, and is the represented subtype in the preclinical models analyzed.

Le contrôle de la prolifération des cellules cancéreuses mammaires est un phénomène complexe. Les oestrogènes jouent un rôle important dans le contrôle de cette prolifération. L'action des oestrogènes se fait via le récepteur des oestrogènes α (REα), un facteur de transcription qui complexé à l'oestradiol, est capable de moduler la transcription de nombreux gènes impliqués dans la prolifération, l'apoptose ou la différentiation cellulaire. L'utilisation d'anti-hormones qui sont des inhibiteurs compétitifs de l'œstradiol bloquent la prolifération des cellules cancéreuses mammaires. Malheureusement les patientes métastatiques traitées par ce type de molécules développent systématiquement une résistance aux thérapies anti-hormonales. Les facteurs de croissance, tels que l'EGF ou l'IGF-I, qui entraînent une activation du REα de manière ligand indépendante pourraient être responsable de l'apparition de ces phénomènes de résistance. L'étude des voies d'activation du REα par ces facteurs de croissance est donc importante. Le facteur de croissance IGF-I participe au contrôle du développement de la glande mammaire pendant l'embryogenèse et il a une activité œstrogène dans les cellules cancéreuses mammaires. Cette activité oestrogène de l'IGF-I requiert l'expression du récepteur des oestrogènes α (REα), mais on ne connaît pas les mécanismes moléculaires mis en jeu. Nous avons démontré que sur un promoteur complexe tel que le promoteur du gène oestrogéno régulé pS2/TFF1, qui contient un site de liaison au REα et un site de liaison au complexe AP1, l'activation transcriptionnelle de ce gène requiert le REα et le complexe AP1. L'ensemble de ces travaux a permis de mettre en évidence un mécanisme d'action original et non conventionnel du REΑ, en absence d'hormone. En présence du facteur de croissance IGF-I, le REα est nécessaire mais pas suffisant pour activer la transcription et le complexe AP1 joue un rôle aussi important que le REα dans l'activation transcriptionnelle du gène pS2/TFF1. Ce complexe AP1, ou les voies conduisant à son activation pourrait donc être des cibles thérapeutique de choix pour le traitement du cancer du sein.

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