Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

L’érythropoïèse inefficace joue un rôle central dans la physiopathologie de l’anémie des β-TM. Ses caractéristiques sont triple: accélération de la différenciation érythroïde, arrêt de maturation au stade d’érythroblaste polychromatophile et mort par apoptose à ce stade de différenciation. Les mécanismes précis de cette apoptose et de l’arrêt de la maturation n’ont pas encore été élucidés. Il a été montré, au cours de l’érythropoïèse physiologique, que la protéine chaperonne Hsp70, en se localisant dans le noyau des érythroblastes en cours de différenciation, protège GATA-1 (facteur de transcription érythroïde majeur) de sa destruction par la caspase-3. Cette enzyme clé de l’apoptose est en effet activée physiologiquement au cours de la différenciation érythroïde et peut cliver GATA-1. Notre travail se base sur l’hypothèse suivante : Hsp70 pourrait, au cours de l’érythropoïèse des β-TM, être séquestrée dans le cytoplasme des érythroblastes matures (stade d’une intense hémoglobinisation) afin d’exercer son rôle de chaperonne des chaînes d’α-globine libres. Cela aurait comme conséquence néfaste l’absence de localisation nucléaire d’Hsp70 et, en conséquence, la destruction de GATA-1 à l’origine de l’arrêt de maturation et de la mort cellulaire. Nous avons montré dans ce travail qu’Hsp70 était localisée principalement dans le cytoplasme des érythroblastes matures dans la moelle de patients β-TM, avec un défaut d’expression nucléaire. Par ailleurs, GATA-1 n’est plus exprimé dans ces cellules. Nous avons confirmé ces résultats dans un système de culture cellulaire érythroïde humaine en milieu liquide reproduisant les étapes de la différenciation érythroïde terminale. Une intéraction physique directe entre Hsp70 et l’α-globine a été identifiée par techniques de microscopie confocale, d’immunoprécipitation et de double hybride. Enfin, la transduction dans les érythroblastes de β-TM d’un mutant d’Hsp70-S400A, principalement nucléaire, ou d’un mutant de GATA-1 non clivable par la caspase-3 corrige l’érythropoïèse inefficace.Une modélisation mathématique du complexe Hsp70/α-globine nous a permis de préciser les domaines impliqués dans l’intéraction, ce qui ouvre la voie à une possibilité de criblage de petites molécules permettant la rupture de ce complexe afin de ramener Hsp70 dans le noyau avec un espoir thérapeutique pour améliorer l’érythropoïèse inefficace des β-TM. / Β-TM is an inherited hemoglobinopathy caused by a quantitative defect in the synthesis of the β-globin chains of hemoglobin, leading to the accumulation of free α-globin chains that form toxic aggregates. Despite extensive knowledge on the molecular defects causing β-TM, little is known about the mechanisms responsible for ineffective erythropoiesis (IE), which is characterised by accelerated erythroid differentiation, maturation arrest and apoptosis at the polychromatophilic stage. We have previously demonstrated that normal human erythroid cell maturation requires a transient activation of caspase-3. Although GATA-1, the master transcriptional factor of erythropoiesis, is a caspase-3 target, we have shown that during human erythroid differentiation, it is protected from cleavage through its association with the chaperone Hsp70 in the nucleus. Hsp70 is constitutively highly expressed in normal human erythroid cells. The best-known role of this ubiquitous chaperone is to participate in proteins folding and refolding of proteins denatured by cytoplasmic stress, thus preventing their aggregation.In this study, we have evidenced that during the maturation of human β-TM erythroblasts, Hsp70 is sequestrated in the cytoplasm by the excess of free α-globin chains, resulting in nuclear GATA-1 cleavage and, in turn, end-stage maturation arrest and apoptosis. A molecular modeling shows that α-globin binds to a highly electronegative cavity formed by all Hsp70 domains. Additionally, the transduction of a nuclear-targeted Hsp70 mutant (Hsp70-S400A) or caspase-3 uncleavable GATA-1 mutant (µGATA-1) corrects β-TM ineffective erythropoiesis in human cultured β-TM cells. Our data indicate that cytosolic Hsp70 sequestration by α-globin chains prevents its nuclear localization and is a key mechanism of the β-TM IE. In order to increase nuclear Hsp70 translocation, developing small molecules that could increase Hsp70 expression or disrupt the Hsp70/α-globin complex could be a novel approach of targeted therapies to improve erythropoiesis in β-TM.

Le premier objectif de cette thèse était d’améliorer l’utilisation et la compréhension des outils de mesure de la déformabilité du globule rouge (GR) dans la drépanocytose (Etudes 1 et 2). L’étude 1 a montré l’importance de la standardisation des mesures de déformabilité par ektacytométrie chez les enfants drépanocytaires. Au cours de l’étude 2, les propriétés des GR ont été modifiées et la variation des courbes de déformabilité érythrocytaire « classique » (index d’élongation en fonction de la contrainte de cisaillement en milieu isotonique) a été comparée aux résultats d’osmoscan (mesure de la déformabilité érythrocytaire en gradient osmolaire à contrainte de cisaillement fixe), méthode de référence pour étudier les anomalies de la membrane du GR. Ainsi, les variations de déformabilité érythrocytaire au-delà de 3 Pa sont affectées à la fois par la viscosité interne du GR et par des modifications de la surface cellulaire (rapport surface/volume) alors que les modifications de l’élasticité membranaire affectent la déformabilité érythrocytaire quelles que soient les forces de cisaillements utilisées (faibles, modérées ou hautes). Le deuxième objectif de cette thèse était d’apporter des éléments supplémentaires sur l’implication des facteurs génétiques, des paramètres hémorhéologiques et du niveau de stress oxydant sur la survenue des complications vaso-occlusives chez les patients atteints de syndrome drépanocytaire majeur (Etudes 3 à 6). La mise en commun des résultats d’hémorhéologie obtenus sur 165 patients de notre cohorte lyonnaise et 240 patients de la cohorte guadeloupéenne a permis de montrer que la rhéologie du GR chez les patients drépanocytaires était dépendante de l’âge. Ainsi, la viscosité sanguine augmente avec l’âge pour atteindre un plateau vers 30 ans alors que la déformabilité érythrocytaire diminue avec l’âge (Etude 3). Ces modifications participent vraisemblablement à l’apparition de complications chroniques chez l'adulte drépanocytaire. Les études 4 et 5 ont été réalisées sur la cohorte pédiatrique lyonnaise. Au cours de ces 2 études, nous avons étudié l’influence sur la rhéologie du sang et la survenue de crises vaso-occlusives (CVO) des facteurs génétiques (alpha-thalassémie, déficit en Glucose-6-Phosphate Déshydrogénase (G6PD) et haplotypes S) d’une part (Etude 4) et du niveau de stress oxydant et nitrosatif d’autre part (Etude 5). L’alpha-thalassémie augmente la déformabilité des GR et l’agrégation érythrocytaire. Ces 2 phénomènes pourraient participer à augmenter le risque de CVO. De plus, l’alpha-thalassémie, en diminuant l’hémolyse, diminuerait le niveau de stress oxydant, élément majeur impliqué dans la physiopathologie de la drépanocytose. Enfin, l’étude 6 a montré que la rhéologie sanguine des patients Sbêta+ était quasi-identique à celle des sujets sains AA mais que les patients les plus sévères pourraient avoir un déficit en monoxyde d’azote circulant. En conclusion, mon travail de thèse contribue à une meilleure compréhension de la physiopathologie de la drépanocytose / The first goal of this thesis (Study 1 and 2) was to improve the use and the comprehension of tools for red blood cell (RBC) deformability measurements in sickle cell disease (SCD). The first study showed the importance of standardization of RBC deformability measurements by ektacytometry in SCD children. In the study 2, the RBC proprieties was modified and the variation of « classic » RBC deformability curve (elongation index as a function of the shear stress in isotonic medium) was compared to osmoscan results (elongation index in hyperosmolar gradient and constant shear stress), the gold standard for RBC membrane defect studies. Thus, the modifications of RBC deformability curve above 3 Pa were affected by RBC internal viscosity and cellular surface modification (and thus surface/volume ratio) while membran elasticity modifications affected RBC deformability whatever the shear stress (low, moderate or high). The second goal of this thesis was to study the effects of genetic modifiers, hemorheological parameters and oxidative stress level on vaso-occlusive complications (VOC) in SCD (Study 3 to 6). Hemorheological parameters were measured on 165 patients from Lyon and 240 patients from Gwada and the results showed that blood viscosity increased until the age of 30 and RBC deformability decreased with age (Study 3). This modifications probably play role in the chronic complications of SCD adult patients. The studies 4 and 5 were conducted on SCD children. We studied the effects of genetic modifiers (alpha-thalassemia, glucose-6-phospho-deshydrogenase deficiency and S haplotypes ; study 3) and nitro-oxidative stress level (study 5). Alpha-thalassemia increase RBC deformability and RBC aggregation. This phenomenon could contribute to increase VOC. Moreover, alpha-thalassemia decreased hemolysis and thus oxidative stress, a major component of SCD physiopathology. Then the study 6 showed that Sbeta+ patient hemorheology was quite the same of AA ubjects but the more severe patients could have a defect in circulating nitric oxide. To conclude, my thesis contribute to a better understanding of SCD physiopathology

De nombreuses études ont mis en évidence le caractère plastique du muscle strié squelettique en réponse à de nombreux stimuli. Ce travail de thèse s’est attelé à caractériser les modifications structurales et fonctionnelles potentielles de ce tissu en présence de deux hémoglobinopathies génétiques : la drépanocytose (dans sa forme homozygote et hétérozygote), due à la production d'une hémoglobine anormale (appelée S), et/ou l’alpha-thalassémie (dans sa forme hétérozygote, parfois associée à la drépanocytose), se caractérisant par une anémie microcytaire. Les analyses histologiques et biochimiques de prélèvements biopsiques du muscle vastus Iateralis témoignent d’un remodelage structural et fonctionnel du muscle et notamment du réseau micro-vasculaire des sujets drépanocytaires. Une raréfaction des micro-vaisseaux, associée à une augmentation de leur diamètre et une diminution de leur tortuosité sont rapportées, adaptations qui pourraient limiter les troubles hémorhéologiques inhérents à l'hémoglobine S. Les activités des enzymes clés du métabolisme oxydatif (CS : citrate synthase et COx : cytochrome c oxydase) ont également été trouvées altérées chez les sujets porteurs de l’hémoglobine S. L’a-thalassémie fait elle aussi l’objet d’un léger remodelage micro-vasculaire marqué par une augmentation de la tortuosité des micro-vaisseaux. Enfin, l'association drépanocytose hétérozygote/a-thalassémie, connue pour atténuerles désordres hémorhéologiques et inflammatoires, n’engendrerait aucune modification notable descaractéristiques structurales et fonctionnelles du tissu musculaire par rapport à une population contrôle (HbAA) / Several studies have demonstrated the skeletal striated muscle plasticity in answer to differentstimuli. The aim of this thesis work was to characterize the structural and functional modifications of this particular tissue face to the sickle cell disease (in both homozygous and heterozygous forms), due to the production of an abnormal hemoglobin (called hemoglobin S), and/or the alpha thalassemia (in her heterozygous form, regularly associated with sickle cell disease). The histochemical and biochemical analysis of the vastus Iateralis biopsy showed evidence for 3 significant structural and functional remodeling of the sickle cell subjects muscle and most particularly of the microvasculature. A reduced capillary density, associated with enlarged microvessels and lower tortuosity are reported, that may possibly limit the hemorheological disorders linked to hemoglobin S. The main oxidative enzymes activities (CS: citrate synthase and COx: cytochrome c oxydase) were also altered in sickle cell subjects. Remodeling of the microvascular network occurs to a lesser extent in a-thalassemia, with an increase of the microvessels tortuosity. Finally, the association of the sickle cell heterozygous form with a-thalassemia, known to reduced hemorheological and inflammatory disorders, does not seem to modify muscle characteristics in comparison to a control population with normal hemoglobin

L'érythropoïèse inefficace joue un rôle central dans la physiopathologie de l'anémie des β-TM. Ses caractéristiques sont triple: accélération de la différenciation érythroïde, arrêt de maturation au stade d'érythroblaste polychromatophile et mort par apoptose à ce stade de différenciation. Les mécanismes précis de cette apoptose et de l'arrêt de la maturation n'ont pas encore été élucidés. Il a été montré, au cours de l'érythropoïèse physiologique, que la protéine chaperonne Hsp70, en se localisant dans le noyau des érythroblastes en cours de différenciation, protège GATA-1 (facteur de transcription érythroïde majeur) de sa destruction par la caspase-3. Cette enzyme clé de l'apoptose est en effet activée physiologiquement au cours de la différenciation érythroïde et peut cliver GATA-1. Notre travail se base sur l'hypothèse suivante : Hsp70 pourrait, au cours de l'érythropoïèse des β-TM, être séquestrée dans le cytoplasme des érythroblastes matures (stade d'une intense hémoglobinisation) afin d'exercer son rôle de chaperonne des chaînes d'-globine libres. Cela aurait comme conséquence néfaste l'absence de localisation nucléaire d'Hsp70 et, en conséquence, la destruction de GATA-1 à l'origine de l'arrêt de maturation et de la mort cellulaire. Nous avons montré dans ce travail qu'Hsp70 était localisée principalement dans le cytoplasme des érythroblastes matures dans la moelle de patients β-TM, avec un défaut d'expression nucléaire. Par ailleurs, GATA-1 n'est plus exprimé dans ces cellules. Nous avons confirmé ces résultats dans un système de culture cellulaire érythroïde humaine en milieu liquide reproduisant les étapes de la différenciation érythroïde terminale. Une intéraction physique directe entre Hsp70 et l'-globine a été identifiée par techniques de microscopie confocale, d'immunoprécipitation et de double hybride. Enfin, la transduction dans les érythroblastes de β-TM d'un mutant d'Hsp70-S400A, principalement nucléaire, ou d'un mutant de GATA-1 non clivable par la caspase-3 corrige l'érythropoïèse inefficace.Une modélisation mathématique du complexe Hsp70/-globine nous a permis de préciser les domaines impliqués dans l'intéraction, ce qui ouvre la voie à une possibilité de criblage de petites molécules permettant la rupture de ce complexe afin de ramener Hsp70 dans le noyau avec un espoir thérapeutique pour améliorer l'érythropoïèse inefficace des β-TM.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’érythropoïèse est le processus de formation des globules rouges. L’anémie demeure à l’heure actuelle un problème de santé publique majeur. Par conséquent, une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le contrôle de ce processus dans des conditions physiologiques et pathologiques, ainsi que l’établissement de stratégies thérapeutiques ciblées constituent un enjeu de recherche majeur. Le récepteur de la transferrine 1 (CD71/RTf1) est un élément essentiel de l'érythropoïèse, la majorité des travaux de recherche étant focalisés sur son rôle indéniable dans le métabolisme du fer. Cependant, de nouveaux ligands du RTf1 ont été découverts ouvrant de nouvelles perspectives relatives aux fonctionnalités de ce récepteur. Ayant démontré que le RTf1 fixait les immunoglobulines A1 (IgA1), nous nous sommes intéressés au rôle des IgA1 dans l’érythropoïèse. Nous montrons que le RTf1 lié aux polymères d'IgA1 (pIgA1) induit la croissance et une augmentation de la prolifération des érythroblastes en concentration sous-optimale d'érythropoïétine (Epo). De même, l'expression transgénique d’IgA1 humaine (souris alpha1-KI), ou le traitement de souris de type sauvage avec les pIgA1 permettent une récupération accélérée de l’anémie aiguë. L’engagement du RTf1 module la sensibilité à l'Epo, en diminuant le seuil d'activation cellulaire, et en induisant les voies de signalisation MAPK/ERK et phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K/AKT). Ces données mettent en évidence un nouveau rôle du RTf1 en tant que régulateur positif de l'érythropoïèse. Parallèlement au RTf1, nous avons identifié un autre récepteur pouvant constituer une cible thérapeutique pour corriger une érythropoïèse inefficace : le récepteur de l’activine de type IIA (ActRIIA). Dans un modèle murin de Beta-thalassémie intermédiaire (Hbbth1/th1), résultant d'une déficience génétique de la chaîne Beta de la globine, nous montrons que l'administration d'une protéine de fusion constituée du domaine extracellulaire de l’ActRIIA lié à un fragment Fc d’IgG de souris (RAP-011), corrige l'anémie, augmente le taux d'hémoglobine et diminue la splénomégalie. Ce traitement favorise l’érythropoïèse splénique et diminue la saturation de la transferrine et l’hémolyse. Fait intéressant, des niveaux élevés de GDF11 (Growth Differentiation Factor 11) sont observés sur des coupes spléniques de souris thalassémiques ainsi que dans le sérum de patients thalassémiques. In vivo, l’inhibition de l’interaction GDF11/ActRIIa par le RAP-011 favorise l’apoptose des érythroblastes précoces par la voie Fas/FasLigand. Ces résultats suggèrent que l’activation constitutive des signaux GDF11/ActRIIA contribue à l’établissement d’une érythropoïèse inefficace caractéristique de la Beta-thalassémie. La neutralisation de cette signalisation inverse ce processus. En conclusion, nos travaux ouvrent de nouvelles perspectives dans la compréhension de l'hématopoïèse normale et pathologique, et pourraient conduire à envisager des traitements innovants pour l'anémie. / Anemia produced by a variety of underlying causes is the most common disorder of the blood, and remains a major global public health problem associated with a poor quality of life for many patients. Thus, better understanding the erythroid process in physiological and pathological conditions, and developing new strategies to boost erythropoiesis appear of great interest. Transferrin receptor 1 (CD71/TfR1) plays an essential role in erythropoiesis, and investigations of TfR1 functions have been focused on their undeniable role in iron metabolism. However, recent data demonstrate that TfR1 is a multi-ligand receptor that participates in a wide array of cellular functions. We have identified TfR1 as a receptor for A1 isotype immunoglobulins (IgA1). In this work, we show that pIgA1s are able through their interaction with the TfR1, to stimulate erythropoiesis by sensitizing erythroblasts to Epo. Likewise, transgenic expression of human IgA1 (Alpha1-KI mice) or treatment of wild-type mice with pIgA1 accelerated recovery from acute anemia. TfR1 engagement by pIgA1 increased cell sensitivity to Epo by inducing activation of mitogen-activated protein kinase (MAPK) and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathways. These findings unveiled a new role of TfR1 as a signaling competent molecule positively regulating erythropoiesis. In addition to TfR1, our work identifies another receptor as a putative target for correcting ineffective erythropoiesis: the activin receptor IIA (ActRIIA). Indeed, using a mouse model of Beta-thalassemia intermedia (Hbbth1/th1) resulting from a genetic deficiency of Beta-globin chain, we show that administration of a ligand trap (named RAP-011), consisting in a fusion protein between the extracellular domain of ActRIIA and the Fc fragment of a mouse IgG, improves anemia, increases total hemoglobin levels and decreases splenomegaly. In addition, targeting ActRIIa signaling corrects ineffective erythropoiesis in the spleen, reduces hemolysis and transferrin saturation. Interestingly, high levels of Growth Differentiation Factor 11 (GDF11) are detected in spleen sections from Beta-thalassemic mice, as well as in sera from thalassemic patients. In addition, the inactivation of GDF11 promotes terminal erythroblast differentiation. Finally, blockade of the GDF11/ActRIIa signaling, promotes premature apoptosis of early erythroblasts through induction of Fas/FasLigand pathway. Therefore, these results first suggest that constitutive GDF11/ActRIIa signaling pathway may promote ineffective erythropoiesis in Beta-thalassemia intermedia, and secondly, support the use of ActRIIa traps for the treatment of chronic anemia and ineffective erythropoiesis. Altogether, these results open new perspectives in the understanding of normal and pathological hematopoiesis and lead to propose innovative treatments for anemia.

Le premier objectif de cette thèse était de déterminer les effets isolés et combinés de l'alpha thalassémie, des polymorphismes inducteurs (QTLs) de l'HbF et du génotype G6PD dans un contexte d'évolution naturelle de la drépanocytose (Etudes 1 et 2). L'étude 1 a permis d'évaluer pour la première fois les fréquences alléliques de ces gènes modificateurs chez 301 enfants sénégalais SS. Contrairement aux autres populations africaines, le Variant Betica de la G6PD était majoritaire par rapport au variant A(-). De plus, 12% de notre cohorte avait un déficit en G6PD combiné à une absence d'alpha-thalassémie. Ces patients-là seront à privilégier pour la réalisation d'un Doppler transcrânien. Les résultats obtenus dans l'étude 2 nous ont permis de conclure que l'alpha-thalassémie et les QTLs de l'HbF sont interdépendants et ne doivent pas être étudiés séparément pour une prédiction clinique précise. En effet, une combinaison d'alpha-thalassémie avec au moins 2 QTLs de l'HbF est nécessaire pour retarder de manière significative la première complication de la maladie. Cependant, une alpha-thalassémie homozygote, même associée à 3 à 6 QTLs de l'HbF, augmente la fréquence des CVO pendant l'enfance. Par conséquent, une alpha-thalassémie hétérozygote avec au moins deux QTL HbF constituerait le génotype le plus favorable relativement à la survenue des CVO. Le deuxième objectif de cette thèse était d'étudier les interrelations entre le stress oxydant (phénotype et génotype) et la sévérité clinique de la maladie (Etudes 3 à 4). La drépanocytose est caractérisée par un stress oxydatif élevé pouvant expliquer une partie des manifestations cliniques. Nos résultats ont montré que l'alpha-thalassémie homozygote semble diminuer le stress oxydatif, ce qui contribuerait à son effet protecteur sur certaines complications du sous-phénotype hémolytique. En outre, les patients qui ont le moins d'hospitalisations et de CVO semblent présenter une meilleure défense antioxydante (activités catalase et GPx augmentées). Dans l'étude 4 nous avons étudié 4 SNPs de gènes du stress oxydant (rs4880 du gène SOD2, rs207454 du gène XO, rs233322 du gène MPO et rs35652124 du gène NFE2L2). Le SNP rs4880 aurait un effet favorable au niveau biologique (réticulocytose moindre, activité GPx augmentée) mais sans traduction clinique associée. Il en est de même pour rs233322 qui serait associé à une hémolyse et à un stress oxydatif (AOPP) plus importants. En revanche, une tendance à un effet protecteur de rs207454 vis-à-vis de certaines complications (hospitalisations, ostéonécrose, sepsis, STA) a été observée. Notre travail contribue à la compréhension de l'impact des gènes modificateurs dans la drépanocytose. Il pourrait donc permettre, via une sélection positive des patients à risque, d'améliorer la prise en charge de la maladie dans les pays où les traitements de fond (hydroxyurée, doppler transcrânien, échanges transfusionnels) ne peuvent être proposés à tous / The primary objective of this thesis was to determine the isolated and combined effects of alpha-thalassemia, inductors polymorphisms (QTLs) of HbF and genotype G6PD in a context of natural progression of sickle cell disease (Studies 1 and 2). Study 1 was undertaken to evaluate for the first time the allelic frequencies of these modifiers genes in 301 Senegalese SS children. Unlike other African populations, the G6PD Betica Variant was predominant over the A (-) variant. In addition, 12% of our cohort had G6PD deficiency combined with no alpha-thalassemia. These patients will be favoured for the realization of a transcranial doppler. The results obtained in Study 2 allowed us to conclude that alpha thalassemia and QTLs of HbF are interdependent and should not be studied separately for accurate clinical prediction. Indeed, a combination of alpha thalassemia with at least 2 QTLs of HbF is required to significantly delay the first complication of the disease. However, a homozygous alpha thalassemia, even associated with 3 to 6 QTLs of HbF, increases the frequency of CVOs during childhood. Therefore, a heterozygous alpha-thalassemia with at least two QTL HbFs would be the most favourable genotype for the occurrence of CVOs. The second objective of this thesis was to study the interrelationships between oxidative stress and the clinical severity of the disease (Studies 3 to 4). Sickle cell disease is characterized by high oxidative stress that may explain some of the clinical manifestations. Our results showed that homozygous alpha-thalassemia appears to reduce oxidative stress, which would contribute to its protective effect on certain complications of the hemolytic sub-phenotype. In addition, patients with the least hospitalization and CVO appear to have better antioxidant defense (catalase and GPx activities increased). In Study 4 we studied 4 SNPs of oxidative stress genes (rs4880 of the SOD2 gene, rs207454 of the XO gene, rs233322 of the MPO gene and rs35652124 of the NFE2L2 gene). The rs4880 SNP would have a favourable effect on the biological level (less reticulocytosis, increased GPx activity) but without associated clinical translation. The same is true for rs233322, which is associated with greater haemolysis and oxidative stress (AOPP). On the other hand, a tendency to a protective effect of rs207454 for some complications (hospitalizations, osteonecrosis, sepsis, STA) was observed. Our work contributes to the understanding of the impact of modifiers genes in sickle cell disease. It could therefore, through a positive selection of at-risk patients, improve the management of the disease in countries where the basic treatments (hydroxyurea, transcranial doppler, blood transfusion) cannot be offered to all

L’hémoglobine est une protéine contenue dans les globules rouges dont la principale fonction est le transport de l’oxygène. Chaque molécule d’hémoglobine est un tétramère constitué de deux paires de globines identiques de type α et β. La β-thalassémie est une maladie génétique hématopoïétique provenant de mutations du gène encodant l'hémoglobine. Ce désordre se caractérise par une diminution ou une absence totale de la synthèse de la chaîne β-globine résultant principalement en une anémie hémolytique sévère ainsi que des complications multisystémiques, telles que la splénomégalie, des déformations osseuses et une dysfonction hépatique et rénale. Actuellement, les transfusions sanguines chroniques représentent le traitement standard des patients β-thalassémiques. Cette thérapie nécessite l’administration conjointe d’un traitement chélateur de fer puisqu’elle entraîne une accumulation pathologique du fer, considéré à ce jour comme la source principale des complications cardiovasculaires de la β-thalassémie. Néanmoins, malgré le traitement efficace de la surcharge de fer transfusionnelle, l’insuffisance cardiaque demeure encore la principale cause de mortalité chez les patients atteints de β-thalassémie. Cette observation indique possiblement la présence d’un mécanisme complémentaire dans le développement de la physiopathologie cardiaque β-thalassémique. L’objectif du présent projet consistait donc à étudier les altérations cardiovasculaires de la β-thalassémie indépendamment de la surcharge de fer transfusionnelle. En utilisant un modèle murin non-transfusé de la β-thalassémie majeure, nous avons d’abord évalué in vivo, par méthode d’imagerie novatrice échographique à haute fréquence, les propriétés hémodynamiques vasculaires. Nos résultats d’index de Pourcelot ainsi que de résistance vasculaire périphérique totale ont démontré une perturbation de l’écoulement microcirculatoire chez les souris β-thalassémiques non-transfusées. Subséquemment, nous avons étudié la fonction endothéliale de régulation du tonus vasculaire de vaisseaux mésentériques isolés. Nos résultats ont révélé un dysfonctionnement de la réponse vasodilatatrice dépendante de l’endothélium chez les souris β-thalassémiques malgré une augmentation de l’expression de l’enzyme de synthèse du monoxyde d’azote ainsi qu’un remodelage de la carotide commune caractérisé par un épaississement de la paroi vasculaire. Finalement, notre étude échocardiographique de la fonction et la morphologie cardiaque a montré, chez les souris β-thalassémiques, le développement d’une hypertrophie et une dysfonction ventriculaire gauche en l’absence de transfusions sanguines chroniques ou de dépôts directs de fer dans le myocarde. L’ensemble des résultats présentés dans le cadre de cette thèse indique la présence d’une pathologie cardiovasculaire chez les souris β-thalassémiques non-transfusés. Nos travaux permettent de proposer un mécanisme de la pathophysiologie cardiovasculaire β-thalassémique, indépendant de la charge de fer transfusionnelle, impliquant les effets compensatoires d’une anémie chronique combinés à une vasculopathie complexe initiée par les érythrocytes endommagés et l’hémolyse intravasculaire. / Hemoglobin is the major protein in red blood cells and is responsible of the oxygen transport. Each hemoglobin molecule is a tetramer consisting of two identical α- and β-globin subunits. β-thalassemia is a genetic hematopoietic disease caused by mutations in hemoglobin genes. This disorder is characterized by a decrease or absence of production of β-globin chain leading mainly to a severe hemolytic anemia and several systemic manifestations, including splenomegaly, skeletal deformities as well as hepatic and renal dysfunctions. Chronic blood transfusions remain the standard treatment for β-thalassemic patients. This therapy requires iron chelating management since it leads to pathological iron accumulation which is currently considered the main cause of cardiovascular complications of β-thalassemia. However, despite adequate control of transfusional iron loading, heart failure remains the leading cause of mortality in β-thalassemia. This issue is possibly indicative of additional pathogenic mechanisms underlying the development of the β-thalassemic cardiac pathology. The objective of the present research project was to study cardiovascular alterations of β-thalassemia independently of transfusional iron overloading. Using an untransfused murine model of β-thalassemia major, we have evaluated in vivo, by non-invasive high-frequency ultrasound imaging, vascular hemodynamic properties. Our results of Pourcelot indices and total peripheral vascular resistance have shown microcirculatory flow disturbances in untransfused β-thalassemic mice. Consequently, we have studied ex vivo the endothelial vasomotor function in isolated mesenteric arterioles. Our findings have pointed out endothelium-dependent vasodilator dysfunction in β-thalassemic mice despite increased expression of nitric oxide synthase, as well as remodeling of the common carotid artery wall. Lastly, our echocardiography studies of heart morphology and function in β-thalassemic mice have demonstrated the development of left ventricle hypertrophy and dysfunction in the absence of chronic blood transfusions or direct myocardial iron deposits. In conclusion, findings presented in this thesis have demonstrated for the first time development of severe cardiovascular complications in untransfused β-thalassemic mice. Based on our results, we have proposed a novel mechanism, independent of direct myocardial iron deposition, responsible for the cardiovascular complications in β-thalassemia. This model combines compensatory effects of chronic anemia with a complex vasculopathy initiated by abnormal erythrocytes and intravascular hemolysis.