Membrane proteins represent about one third of all known vertebrate proteins and over half of the current drug targets. Knowledge of their three-dimensional (3D) structure is worth millions of pounds to the pharmaceutical industry. Yet experimental structure elucidation of membrane proteins is a slow and expensive process. In the absence of experimental data, computational modelling tools can be used to close the gap between the numbers of known protein sequences and structures. However, currently available structure prediction tools were developed with globular soluble proteins in mind and perform poorly on membrane proteins. This thesis describes the development of a modelling approach able to predict accurately the structure of transmembrane domains of proteins. In this thesis we build a template-based modelling framework especially for membrane proteins, which uses membrane protein-specific information to inform the modelling process.Firstly, we develop a tool to accurately determine a given membrane protein structure's orientation within the membrane. We offer an analysis of the preferred substitution patterns within the membrane, as opposed to non-membrane environments, and how these differences influence the structures observed. This information is then used to build a set of tools that produce better sequence alignments of membrane proteins, compared to previously available methods, as well as more accurate predictions of their 3D structures. Each chapter describes one new piece of software or information and uses the tools and knowledge described in previous chapters to build up to a complete accurate model of a transmembrane domain.

Nous étudions le ribozyme VS de Neurospora, en tant que système modèle, pour augmenter nos connaissances sur la relation entre la structure et la fonction chez les ARNs, ainsi que pour mieux comprendre le mécanisme de clivage de ce ribozyme. Il a été proposé précédemment que la boucle interne A730 dans la tige-boucle VI (SLVI) contient le site actif du ribozyme et lie un ou plusieurs ions métalliques qui pourraient participer au mécanisme réactionnel. Nous avons déterminé par spectroscopie RMN la structure de la tige-boucle SLVI contenant la boucle A730 afin d’éclaircir ce mécanisme. La structure obtenue est en accord avec les études biochimiques antérieures et présente un ou plusieurs sites de liaison au magnésium associé à la boucle interne. Suite à des études de cinétique et de mutagenèse, il a été proposé qu’une adénine localisée dans le site actif, A756, participe à la catalyse par acide/base générale. Des études de pH effectuées précédemment ont identifié un pKa catalytique (5.2-5.8) qui correspond probablement à l’équilibre de protonation du A756. À l’aide de méthodes utilisant le carbone-13, nous avons identifié un pKa modifié appartenant au A756, ce qui supporte le rôle de ce résidu dans la catalyse par acide/base générale. Les études structurales présentées ici aident donc à augmenter notre compréhension du mécanisme de clivage chez le ribozyme VS. / We are studying the Neurospora VS ribozyme as a model system to increase our knowledge of the structure-function relationship in RNA and to better understand the mechanism of the cleavage reaction. It has been previously postulated that the A730 internal loop of stem-loop VI (SLVI) forms the active site of the VS ribozyme and binds magnesium ion(s) that may participate in catalysis. To get insights into the catalytic mechanism, we have determined by NMR spectroscopy the structure of a SLVI fragment containing the A730 loop. The structure we obtained is in agreement with previous biochemical studies and contains one or more magnesium-ion binding sites in the active site. Based on kinetic and mutagenesis studies, it has been proposed that an adenine in the A730 loop, A756, is important for catalysis and may participate in general acid/base catalysis. Previous pH-dependent enzymatic studies identified a catalytic pKa of 5.2-5.8, which likely corresponds to the protonation equilibrium of this A756 adenine in the A730 loop. Using 13C NMR methods, we have identified a shifted pKa for A756, which gives additional support to the role of this residue in the general acid/base mechanism. The NMR studies presented here therefore increase our understanding of the cleavage reaction in the VS ribozyme.

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L’objectif de cette thèse est de proposer un Alphabet Structural (AS) permettant une caractérisation fine et précise des structures tridimensionnelles (3D) des protéines, à l’aide des chaînes de Markov cachées (HMM) qui permettent de prendre en compte la logique issue de l’enchaînement des fragments structuraux en intégrant l’augmentation des conformations 3D des structures protéiques désormais disponibles dans la banque de données de la Protein Data Bank (PDB). Nous proposons dans cette thèse un nouvel alphabet, améliorant l’alphabet structural HMM-SA27,appelé SAFlex (Structural Alphabet Flexibility), dans le but de prendre en compte l’incertitude des données (données manquantes dans les fichiers PDB) et la redondance des structures protéiques. Le nouvel alphabet structural SAFlex obtenu propose donc un nouveau modèle d’encodage rigoureux et robuste. Cet encodage permet de prendre en compte l’incertitude des données en proposant trois options d’encodages : le Maximum a posteriori (MAP), la distribution marginale a posteriori (POST)et le nombre effectif de lettres à chaque position donnée (NEFF). SAFlex fournit également un encodage consensus à partir de différentes réplications (chaînes multiples, monomères et homomères) d’une même protéine. Il permet ainsi la détection de la variabilité structurale entre celles-ci. Les avancées méthodologiques ainsi que l’obtention de l’alphabet SAFlex constituent les contributions principales de ce travail de thèse. Nous présentons aussi le nouveau parser de la PDB (SAFlex-PDB) et nous démontrons que notre parser a un intérêt aussi bien sur le plan qualitatif (détection de diverses erreurs)que quantitatif (rapidité et parallélisation) en le comparant avec deux autres parsers très connus dans le domaine (Biopython et BioJava). Nous proposons également à la communauté scientifique un site web mettant en ligne ce nouvel alphabet structural SAFlex. Ce site web représente la contribution concrète de cette thèse alors que le parser SAFlex-PDB représente une contribution importante pour le fonctionnement du site web proposé. Cette caractérisation précise des conformations 3D et la prise en compte de la redondance des informations 3D disponibles, fournies par SAFlex, a en effet un impact très important pour la modélisation de la conformation et de la variabilité des structures 3D, des boucles protéiques et des régions d’interface avec différents partenaires, impliqués dans la fonction des protéines / The purpose of this PhD is to provide a Structural Alphabet (SA) for more accurate characterization of protein three-dimensional (3D) structures as well as integrating the increasing protein 3D structure information currently available in the Protein Data Bank (PDB). The SA also takes into consideration the logic behind the structural fragments sequence by using the hidden Markov Model (HMM). In this PhD, we describe a new structural alphabet, improving the existing HMM-SA27 structural alphabet, called SAFlex (Structural Alphabet Flexibility), in order to take into account the uncertainty of data (missing data in PDB files) and the redundancy of protein structures. The new SAFlex structural alphabet obtained therefore offers a new, rigorous and robust encoding model. This encoding takes into account the encoding uncertainty by providing three encoding options: the maximum a posteriori (MAP), the marginal posterior distribution (POST), and the effective number of letters at each given position (NEFF). SAFlex also provides and builds a consensus encoding from different replicates (multiple chains, monomers and several homomers) of a single protein. It thus allows the detection of structural variability between different chains. The methodological advances and the achievement of the SAFlex alphabet are the main contributions of this PhD. We also present the new PDB parser(SAFlex-PDB) and we demonstrate that our parser is therefore interesting both qualitative (detection of various errors) and quantitative terms (program optimization and parallelization) by comparing it with two other parsers well-known in the area of Bioinformatics (Biopython and BioJava). The SAFlex structural alphabet is being made available to the scientific community by providing a website. The SAFlex web server represents the concrete contribution of this PhD while the SAFlex-PDB parser represents an important contribution to the proper function of the proposed website. Here, we describe the functions and the interfaces of the SAFlex web server. The SAFlex can be used in various fashions for a protein tertiary structure of a given PDB format file; it can be used for encoding the 3D structure, identifying and predicting missing data. Hence, it is the only alphabet able to encode and predict the missing data in a 3D protein structure to date. Finally, these improvements; are promising to explore increasing protein redundancy data and obtain useful quantification of their flexibility