Thèse d'exercice : Médecine. Pédiatrie : Université de Nantes : 2003. / Bibliogr. f. 71-78 [60 réf.].

Th.--Méd.--Nancy 1, 1983. N°: 141.

L’identification fréquente de mutations des protéines régulatrices du complément suggère que les lésions endothéliales du syndrome hémolytique et urémique atypique (SHUa) résultent d’une activation incontrôlée de la voie alterne du complément. Les mutations, en soi, ne constituent cependant que des facteurs de susceptibilité et les mécanismes menant de l’anomalie de régulation du complément au développement de lésions de microangiopathie thrombotique rénale restent mal compris. L’objectif de ce projet était donc d'étudier certains mécanismes de l’activation du complément à la surface des cellules endothéliales dans le SHUa et les conséquences de cette activation pour l’endothélium. Dans ce but, ce travail s’est initialement concentré sur la mutation C3R139W, dont nous avons réalisé la caractérisation phénotypique et fonctionnelle et qui a constitué un modèle d’étude des conséquences d’un complément dérégulé sur l’endothélium. Cette mutation a été identifiée de façon sporadique chez 4% des patients de la cohorte française de SHUa. Son étude phénotypique a mis en avant une évolution fonctionnelle rénale souvent sévère mais inhomogène ainsi qu’une fréquence non négligeable d’événements cardio-vasculaires. Sa caractérisation fonctionnelle a révélé une augmentation de son affinité pour le facteur B, à l’origine de la formation d’une « hyper C3 convertase », échappant également en partie aux systèmes de contrôle (diminution de liaison avec la MCP). L’étude de ses conséquences endothéliales a montré, à la surface de cellules pré-activées, une augmentation des produits d’activation du complément et de l’expression membranaire de facteur tissulaire, faisant le lien avec l’acquisition d’un phénotype endothélial prothrombotique. Nous rapportons également, sous l’effet de sérum porteur de cette mutation, une majoration de la perméabilité et du détachement cellulaire, susceptibles de traduire une souffrance endothéliale. Dans la deuxième partie et en vue de préciser les liens entre anomalie du complément et activation des cellules endothéliales, nous nous sommes intéressés au rôle de l’hémolyse, dénominateur commun des SHU. Nous avons ainsi montré que l’hème libre activait la voie alterne du complément dans le sérum et à la surface des cellules endothéliales et ce, de façon exacerbé, en cas de dysrégulation sous-jacente du complément. Nous avons identifié plusieurs mécanismes d’action par lesquels l’hème peut activer le complément : il favorise les interactions C3/C3 et ainsi la formation d’une hyper C3/C5 convertase, déclenche une mobilisation des corps de Weibel-Palade à l’origine de l’expression membranaire de P-selectine, qui est capable d’activer la voie alterne du complément et induit une diminution de l’expression membranaire des régulateurs MCP et DAF. Par ces travaux, nous avons précisé les liens entre activation du complément et acquisition d’un phénotype endothélial prothrombotique dans le SHUa. Nous avons notamment identifié l’hémolyse comme un acteur potentiel de l’amplification des lésions endothéliales complément-dépendantes. Son contrôle pourrait ainsi constituer une nouvelle voie thérapeutique dans le SHU. / Pas de résumé en anglais

Le syndrome hémolytique et urémique atypique (SHUa) est une microangiopathie thrombotiquecomplément-dépendante dont l'atteinte majoritairement rénale reste, à ce jour, incomprise.L'objectif de ce travail était d'améliorer la compréhension de ce tropisme d’organe au moyen dedeux axes d'étude : i) la susceptibilité de l'endothélium glomérulaire à l'hémolyse, celle-ci étant à la fois la conséquence des microthromboses dans le SHUa et un amplificateur de la voie alterne du complément via l'hème libre, molécule issue des globules rouges lysés ; ii) le rôle potentiel du récepteur aux produits de glycation avancés ou RAGE. Ce récepteur membranaire aux fortes propriétés pro inflammatoires et pro thrombotiques a en effet été impliqué dans de nombreuses pathologies rénales, et sa liaison au C3a - anaphylatoxine libérée dans l'activation du complément - a été rapportée par une équipe.La première partie de ce travail a visé à expliquer la vulnérabilité de l'endothélium glomérulaire sous l'effet d'une hémolyse. Nous avons étudié plusieurs types de cellules endothéliales exposées +/- à l'hème, et mis au point un modèle murin traité par de l'hème. En conditions hémolytiques, plusieursfacteurs pouvant participer à cette susceptibilité endothéliale glomérulaire ont ainsi été mis en avant: i) une moindre liaison du facteur H, principal régulateur du complément, à sa surface ; ii) une faible expression de la thrombomoduline, protéine de la coagulation et régulatrice du complément ; iii) une faible expression de l'enzyme principale de dégradation de l'hème, l'hème-oxygénase 1. Ces deux derniers points étaient rattachés à une faible induction endothéliale glomérulaire de leurs facteurs de transcription, KFL2 et KLF4.La seconde partie de ce travail s'est concentrée sur le RAGE. N'ayant pas réussi à reproduire l'interaction RAGE/C3a, nous avons exploré l'hypothèse d'une liaison du RAGE à l'hème. En effet, le seul récepteur endothélial connu jusqu'à présent est le Toll Like Receptor 4 (TLR4), qui partage plusieurs ligands communs avec le RAGE (LPS - lipopolysaccharide, HMGB1 - high–mobility group box1). Nous avons découvert que le RAGE était un récepteur de l'hème, et identifié que le site de liaisonse trouvait sur le domaine V. A l'aide d'un modèle murin invalidé pour le RAGE et traité +/- par l'hème, nous avons mis en évidence que : i) l'invalidation de RAGE avait un effet protecteur en cas d’exposition à l'hème, marqué par une diminution de l'expression de gènes de l'inflammation (IL1β,TNFα) et du facteur tissulaire au niveau pulmonaire, organe exprimant le plus fortement RAGE ; ii)l'hème activait la phosphorylation des voies ERK1/2 et Akt via le RAGE.Par ces travaux, nous avons précisé les liens entre activation du complément, hémolyse et susceptibilité endothéliale glomérulaire dans le SHUa. Parallèlement, nous avons identifié le RAGE comme un nouveau récepteur à l'hème, dont la liaison à ce récepteur activerait différentes voies designalisation de l'inflammation. Le contrôle de l'hème et du RAGE pourrait ainsi constituer de nouvelles voies thérapeutiques dans le SHUa et les maladies hémolytiques. / The atypical haemolytic uremic syndrome (aHUS) is a thrombotic microangiopathy of which the predominantly renal damage remains, to date, misunderstood. The aim of this work was to improve the understanding of this organ tropism by two axes of study: i) the susceptibility of the glomerular endothelium to hemolysis, which is the consequence of microthrombosis in aHUS, and also an complement pathway enhancer via free heme, hemoglobin-mediated hemolysis molecule, ii) the potential role of the receptor for advanced glycation end products, RAGE. Indeed, RAGE is described as an endothelial receptor with high proinflammatory and prothrombotic potential, involved in many kidney diseases; a team also reported that it was a receptor for the C3a molecule, anaphylatoxin released in complement activation.The first part of this work aimed to explain the vulnerability of the glomerular endothelium under the effect of hemolysis. We studied several types of endothelial cells exposed +/- to heme, and developed a murine model treated with heme. In hemolytic conditions, several factors that could participate in the endothelial glomerular susceptibility have been put forward: i) less binding of factor H, the main complement regulator, on its surface; ii) low expression of thrombomodulin, coagulation protein and complement regulator; iii) low expression of heme-oxygenase 1, the main heme degradation enzyme. These last two points were related to low induction, on glomerular endothelial cells, of transcription factors, KFL2 and KLF4.The second part of this work focused on RAGE. Having failed to reproduce the RAGE / C3a interaction, we explored the hypothesis of a linkage of RAGE to heme. Indeed, the only known endothelial receptor is Toll Like Receptor 4 (TLR4), which shares several common ligands (LPS - lipopolysaccharide, HMGB1 - high-mobility group box 1). We found that RAGE was a heme receptor, and identified that the binding site was on domain V. Using a mouse model knock out for RAGE and treated +/- with heme, we demonstrated that i) the invalidation of RAGE had a protective effect in case of exposure to heme, marked by a decrease in the expression of genes of inflammation (IL1β; TNFα; and tissue factor) at the pulmonary level, organ expressing most strongly RAGE, ii) the heme is an activator or the phosphorylation of ERK1 / 2 and Akt pathways via RAGE.Through this work, we have clarified the links between complement activation, hemolysis and glomerular endothelial susceptibility in aHUS. At the same time, we have identified RAGE as a new heme receptor, whose RAGE/heme bindind would activate different signaling pathways for inflammation. The control of heme and RAGE could constitute new therapeutic pathways in the aHUS, and hemolytic diseases.

Dans la première partie nous décrivons la synthèse et l'évaluation biologique de nouveaux inhibiteurs de l'agrégation plaquettaire, composés dont la structure a été établie en partant du 12-HETE et du 13-HODE. Dans la seconde partie nous développons de nouvelles méthodologies pour la préparation de molécules contenant des motifs CF₂R. Tout d'abord une stratégie très flexible a été mise au point pour la préparation de composés gem-difluorobisaryliques et de leurs analogues hétéroaromatiques. Elle est basée sur l'emploi d'intermédiaires gem-difluoropropargyliques faciles d'accès. Par une séquence de Diels-alder-aromatisation on obtient les molécules cibles de la première série. Pour la seconde, des réactions de cycloaddition dipolaire 1,3 ont été utilisées. A partir de ces intermédiaires, des chimiothèques ciblées de molécules fluorées ont été préparées. Nous nous sommes intéressés ensuite à la synthèse de composés fluorés fonctionnalisés et chiraux à travers des réactions d'organocatalyse asymétrique. A partir d'énals gem-difluorés des réactions de Diels-Alder et des additions 1,4 asymétriques ont été réalisées avec succès. / The first part of the thesis deals with the synthesis and biological evaluation of new platelets aggregation inhibitors, based on 12-HETE, 13-HODE and their analogues. In the second part we are interested in novel methodologies for the preparation of CF₂-containing molecules : First, a flexible strategy for the synthesis of gem-difluoro-bisarylic derivatives and heteroaromatic analogues was designed based on the easy synthesis and the reactivity of gem-difluoro propargylic intermediates, which by Diels-Alder cycloaddition and 1,3-dipolar cycloadditions afforded respectively the bisarylic and mixed arylic heteroarylic scaffolds. In addition, two small libraries were constructed around a bisarylic scaffold as representative examples. Second, we were interested in the synthesis of optically active functionalized molecules containing a gem-difluoro group, using asymmetric organocatalysis protocols. After preparation of the gem-difluoro enals, from their difluoropropargylic precursors, asymmetric organocalytic Diels-Alder cycloaddition and 1,4-conjugated additions were successfully performed.

L’analyse de la causalité, qui consiste à déterminer si la prise d’un médicament est la cause de la survenue d’un événement, est la problématique centrale de la pharmacovigilance et de la pharmaco-épidémiologie.La première partie de ce travail aborde l’étude de la causalité au plan individuel, au travers des méthodes d’imputabilité. Nous avons d’abord comparé une méthode d’imputabilité récemment développée, la méthode logistique, et la méthode d’imputabilité officiellement utilisée en France à un jugement consensuel d’experts pris comme référence. Les résultats montrent que la méthode française d’imputabilité tend à sous-coter la responsabilité du médicament (faible sensibilité) alors que la méthode logistique tend à la surestimer (faible spécificité). Par la suite, une nouvelle version de la méthode française d’imputabilité visant à améliorer sa sensibilité et son pouvoir discriminant a été proposée. Le travail de validation portant sur cette méthode réactualisée montre une amélioration de sa sensibilité et des résultats se rapprochant plus du jugement consensuel d’experts. Pour la méthode logistique, les critères d’imputabilité et leurs poids ont été réévalués sur un échantillon plus important d’observations que celui ayant servi à la pondération initiale. La validité de cette nouvelle version et celle de l’un des algorithmes les plus couramment utilisés en pharmacovigilance, la méthode Naranjo, ont été comparées à un jugement consensuel d’experts. Les résultats concernant la validité interne et les qualités prédictives de la méthode Naranjo ne sont pas satisfaisants alors que la méthode logistique présente une spécificité améliorée ainsi qu’une bonne sensibilité et valeurs prédictives. Cette dernière méthode présente donc des caractéristiques qui devraient améliorer l’évaluation de la responsabilité des médicaments dans la survenue des événements indésirables. La mise en place de méthode d’imputabilité spécifique à une classe thérapeutique et/ou à un type d’événement indésirable pourrait aussi améliorer l’évaluation des événements indésirables. Nous proposons une grille d’imputabilité adaptée aux accidents hémorragiques sous antithrombotique. Dans la deuxième partie de cette thèse, l’analyse épidémiologique de la causalité est abordée en proposant deux méthodes : l’analyse populationnelle des cas individuels, en particulier leur délai de survenue après exposition médicamenteuse, et l’approche cas-population. Bien que beaucoup moins robustes que les méthodes classiques, elles sont testées sur des problématiques réelles de pharmacovigilance et les résultats montrent qu’elles peuvent être utiles pour une première exploration d’une association causale potentielle. En conclusion, ce travail méthodologique pourrait aider à mieux évaluer la responsabilité des médicaments dans la survenue d’événements indésirables après leurs autorisations de mise sur le marché. / The analysis of causality, which consists of determining if drug intake is the cause of the event occurrence, is the central issue of pharmacovigilance and pharmacoepidemiology. The first part of this work deals with the study of causality assessment methods at the level of individual cases. We first compared the recently developed logistic causality assessment method and the method officially used in France, to consensusual expert judgement taking as a reference. The results showed that the French causality assessment method tended to underestimate the responsibility of the drug (low sensitivity) whereas the logistic method tended to overestimate it (low specificity). Subsequently a new version of the French causality assessment method aiming to improve its sensitivity and discriminating power was proposed. The validation phase of this updated method showed improved sensitivity and a performance closer to consensual expert judgement. For the logistic method, the criteria of causality assessment and their weights were re-evaluated on a larger sample of drug-event pairs that had been used in the initial weighting. The validity of this method and that of one of the most commonly used algorithms in pharmacovigilance, the Naranjo method, were compared to consensual expert judgement. Results concerning the internal validity and the predictive qualities of the Naranjo method were not satisfactory while the logistic method presented an improved specificity and good sensitivity and predictive values. The logistic method now presents characteristics that should improve the assessment of drug responsibility in the occurrence of adverse events. The implementation of causality assessment method specific to a therapeutic class and / or to a type of adverse event could also improve the assessment of adverse events. We proposed a scale adapted to hemorrhages with antithrombotics and derived from the French causality assessment method. In the second part of this thesis, the epidemiological analysis of causality was tackled by proposing two methods: the populational analysis of individual cases, in particular their time to onset after drug exposure, and the case-population approach. Although less robust than the conventional methods, these were tested on real problems of pharmacovigilance and the results indicate that they may be useful for an initial exploration of a potential causal association. In conclusion, this methodological work could help to better assess drug causality in the occurrence of adverse event in post maketing surveillance.