Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Tecnologias Química e Biológica, 2016. / Texto parcialmente liberado pelo autor. Foram disponibilizados Resumo e Abstract. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-12-20T11:32:54Z No. of bitstreams: 1 2016_DiegoArantesTeixeiraPires_Parcial.pdf: 408452 bytes, checksum: a5e35ad32a95997f5762b792a670e41e (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-02-02T11:54:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_DiegoArantesTeixeiraPires_Parcial.pdf: 408452 bytes, checksum: a5e35ad32a95997f5762b792a670e41e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-02T11:54:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_DiegoArantesTeixeiraPires_Parcial.pdf: 408452 bytes, checksum: a5e35ad32a95997f5762b792a670e41e (MD5) / A tirosinase é uma enzima oxidase que contém cobre no sítio ativo e pode ser encontrada em plantas, fungos e animais. Em animais, a tirosinase está diretamente envolvida na biossíntese da melanina, sendo que a produção anormal deste pigmento pode levar a uma série de problemas dermatológicos, como hiperpigmentação, hipopigmentação, age spot, melasma, câncer de pele, dentre outros. Por esses motivos, a busca por novos inibidores e ativadores dessa enzima é de grande interesse para a medicina, indústria alimentícia e também para a agricultura. Nesse sentido, estudar o modo de interação de novos inibidores e ativadores com a tirosinase é de fundamental importância para o planejamento de novas drogas mais eficientes. Esse estudo de interação ligante-enzima é feito principalmente por Ressonância Magnética Nuclear (RMN), envolvendo análises de variações de deslocamento químico, tempos de relaxação, coeficientes de difusão e técnicas como STD e INPHARMA, além de Química Computacional. Neste trabalho, novos compostos foram sintetizados e suas caracterizações feitas por infravermelho, espectrometria de massa e RMN. Após testes biológicos, alguns desses compostos foram selecionados para estudos de interação com a tirosinase por RMN, bem como por cálculos mecânico-quânticos e de docking molecular. Os resultados alcançados permitem vislumbrar os modos de interação de ligantes com essa enzima, dando um passo fundamental para o desenho racional de novos fármacos. / Tyrosinase is an oxidase enzyme that contains copper in the active site and it can be found in plants, fungi and animals. In animals, tyrosinase is directly involved in the biosynthesis of melanin. Abnormal production of this pigment can lead to many dermatologic problems, such as hyperpigmentation, hypopigmentation, age spot, melasma, skin cancer, among others. For this reason, there is a special interest in finding new inhibitors and activators of this enzyme. Thereby, the study of the interactions mode of new inhibitors and activators with tyrosinase is very important for the planning of new and more powerful drugs. This study can be primarily done by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) by analyzing chemical shift changes, relaxation times, diffusion coefficients and techniques such as STD and INPHARMA, among others. In this work, new compounds were characterized and studied by IR, mass spectrometry, NMR and theoretical calculations. After biological tests, some of these compounds have been selected for studying the interaction with tyrosinase by NMR and theoretical calculations. The results allow us to come up with the binding modes of ligands interaction with the enzyme, giving a key step in the rational design of new drugs.

O ácido azelaico é um fármaco amplamente utilizado como tratamento em diversas doenças de pele, como acne, rosácea e melasma. A utilização de sistemas nanoestruturados para aplicação tópica se mostra interessante visto que o menor tamanho de partícula proporciona uma melhor entrega de fármacos até o seu sítio de ação. É promissor o desenvolvimento de formulações capazes de diminuir os efeitos adversos do ácido azelaico e intensificar sua eficácia no tratamento de desordens pigmentárias da pele, aliado ao desenvolvimento de uma formulação com controle de permeação e perfil sensorial que facilite a adesão ao tratamento. O objetivo do presente trabalho é desenvolver uma nanoemulsão contendo ácido azelaico e realizar ensaios da tirosinase, permeação cutânea e análise sensorial da formulação desenvolvida. A nanoemulsão foi preparada através da técnica de homogeneização a alta velocidade. A caracterização físico-química avaliou os parâmetros de diâmetro médio de partícula e distribuição do tamanho de partícula pela técnica de difração de laser, o potencial zeta foi medido por mobilidade eletroforética, o pH por potenciometria e teor e eficiência de encapsulação por CLAE. A morfologia foi observada por microscopia eletrônica de transmissão. A nanoemulsão foi estável por 30 dias a 30°C/ 65% UR. A formulação apresentou teor de 10 mg/mL, tamanho de partícula de 419 ± 23 nm, distribuição monomodal, eficiência de encapsulação de 84,65%, potencial zeta de -10,9 ± 0,44 mV e pH de 5,01 ± 0,01. Para verificar a eficácia despigmentante da formulação foi realizado o ensaio in vitro de inibição de tirosinase, onde a nanoemulsão se mostrou mais eficaz que o controle com o fármaco na sua forma livre. O ensaio de permeação cutânea in vitro em células de difusão de Franz foi realizado com pele de orelha de porcos durante 24 horas e ele demonstrou que a formulação nanotecnológica conseguiu atingir as camadas mais profundas da pele (epiderme viável e derme), permitindo que o fármaco alcance o seu sítio de ação, facilitando a inibição da síntese de melanina. Foi realizada análise sensorial descritiva, com 16 voluntários demonstrando que a formulação apresentou maior espalhabilidade e menor brilho que um produto já disponível no mercado. Portanto, a nanoemulsão desenvolvida se mostra promissora para utilização no tratamento de melasma, inclusive o dérmico. / Azelaic acid is a drug commonly used in the treatment of several skin diseases such as acne, rosacea and melasma. Nanostructured systems for topical application are interesting because its smaller particle size lead to a better drug delivery to its action site. Therefore, it is promising to develop formulations able to lower azelaic acid’s side effects and increase its efficacy as a skin whitening agent as well as control its permeation and shows a sensory profile that helps with patient adherence. The aim of the present work is to develop an azelaic-acid loaded nanoemulsion, evaluating its tyrosinase inhibition, skin permeation and sensory profile. The nanoemulsion was prepared using high shear homogenization. Its characterization was conducted evaluating the average particle diameter through laser diffraction, the zeta potential by eletrophoretic mobility, pH by potentiometry and drug content and encapsulation efficiency by HPLC. The morphology of the nanoemulsion was observed by transmission electron microscopy. The product was stable for 30 days at 30°C/ 65 % RH. The theoretical drug content was 10 mg/mL and the particle size 419 ± 23 nm with a monomodal distribution profile, encapsulation efficiency of 84,65% and the zeta potencial was -10,9 ± 0,44 mV while the pH was 5,01 ± 0,01. To evaluate the formulation’s whitening efficacy, tyrosinase inhibition was calculated and the azelaicacid loaded nanoemulsion was more effective than the control with the drug in its free form. The in vitro permeation study using Franz diffusion cells was conducted for 24 hours, using pig ear skin and showed that the formulation was able to permeate through the skin and reach the deeper layers (viable epidermis and dermis), allowing the drug to reach its action site, improving the melanin synthesis inhibition. To help understand the sensory profile of the nanoemulsion, a descriptive sensory evaluation was conducted with 16 volunteers. The nanoemulsion’s sensory profile showed a better spreadability and lower shine comparing with a product already available in pharmacies. Hence, the azelaic acid-loaded nanoemulsion developed in this word seems to be promising as a treatment for pigmentary skin disorders as dermal melasma.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2015. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2016-03-17T16:22:27Z No. of bitstreams: 1 2015_MarcelaMedeirosDeFreitas_Parcial.pdf: 84039 bytes, checksum: 51c582f2a43998d5f9ee7f5ef1bbb43c (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-03-17T16:26:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_MarcelaMedeirosDeFreitas_Parcial.pdf: 84039 bytes, checksum: 51c582f2a43998d5f9ee7f5ef1bbb43c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-17T16:26:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_MarcelaMedeirosDeFreitas_Parcial.pdf: 84039 bytes, checksum: 51c582f2a43998d5f9ee7f5ef1bbb43c (MD5) / A melanogênese é um processo responsável pela produção de melanina, a qual é armazenada em melanócitos, que contêm tirosinase. Esta enzima é responsável pela hiperpigmentação da pele devido à superprodução de melanina. A inibição desta enzima é um alvo na indústria dos cosméticos, uma vez que controla condições indesejáveis da pele. Espécies de plantas do género Morus são conhecidas pelos usos benéficos oferecidos em diferentes partes da planta, incluindo a inibição da tirosinase. Assim, este projeto teve como objetivo estudar a atividade inibitória da tirosinase por extratos das folhas de Morusnigra, bem como a caracterização do perfil cromatográfico do seu extrato e viabilidade de incorporação em produtos cosméticos a partir de sua citotoxicidade, a fim de tornar-se uma nova opção terapêutica de fonte natural. Folhas de M. nigra foram coletadas, pulverizadas, igualmente divididas em cinco lotes e o extrato padronizado foi obtido por maceração passiva. Não houve diferença significativa entre os lotes para teor de sólidos totais, rendimento e teor de umidade, o que demonstra uma boa reprodutibilidade do processo de extração, também demonstrado pelo perfil cromatográfico de CCD. Atividade enzimática de tirosinase foi determinada para cada lote, fornecendo a percentagem de inibição da enzima e os valores de IC50 obtidos através da construção de curvas dose-resposta e comparados com o ácido kójico, um inibidor conhecido da tirosinase. Alta atividade de inibição da tirosinase foi observada (acima de 90% a 15,625 g/mL) e valores de IC50 entre 5,00 g/mL ± 0,23 e 8,49 g/mL ± 0,59, comparável ao ácido kójico (3,37 g/mL ± 0,65). De acordo com as diretrizes da ICH e da Anvisa, o método cromatográfico empregado utilizando Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) foi validado. A análise por CLAE revelou a presença de ácido clorogênico, rutina e, seu composto majoritário, isoquercitrina. Desta forma, o extrato padronizado das folhas de M. nigra foi padronizado utilizando estes polifenóis como marcadores. A citotoxicidade foi avaliada pelo ensaio MTT em melanomas de murino (B16F10), queratinócitos humano (HaCat) e fibroblastos de camundongo (L-929). Não foi observada citotoxicidade para as linhagens celulares nos valores de IC50 da tirosinase. Este estudo demonstrou o potencial do extrato de M. nigra como um promissor agente de branqueamento de fonte natural contra hiperpigmentação cutânea. / Melanogenesisis a process responsible formelanin production, whichis stored inmelanocytes containing tyrosinase. This enzyme is responsible forskin hyperpigmentationdueto the overproduction of melanin. Inhibitionof this enzymeis a targetin the cosmetics industry, since it controls undesirable skin conditions. Plant speciesof theMorusgenusare knownfor the beneficial usesofferedin different partsofthe plant,includingtyrosinase inhibition. Thus, thisproject aimedto study the inhibitory activity of tyrosinase by extracts from Morusnigra leaves, as wellas the characterizationof the chromatographic profileofits extractandviabilityofincorporationin cosmetics fromtheir cytotoxicity,in order tobecome a newtherapeutic optionfrom anatural source. M.nigraleaveswere collected, pulverized, equally divided into five batches and the standardized extractwas obtained bypassivemaceration. There was no significant difference between batches for total solids content, yield and moisture content, which shows good reproducibility of the extraction process also demonstrated by TLC chromatographic profile. Tyrosinase enzymatic activitywas determined for each batch, providingthe percentage ofenzyme inhibitionand IC50valuesobtainedby constructingdose-response curvesand compared with kojic acid, a well-known tyrosinase inhibitor. High inhibition of tyrosinase activity was observed (above 90 % at 15,625 g/mL) and IC50 values ranging from 5.00 g/mL ± 0.23 to 8.49 g/mL ± 0.59, comparable to kojic acid (3.37 g/mL ± 0.65). According to ICH and Anvisa guidelines, the chromatographic method employed usingHigh Profile Liquid Chromatography (HPLC) was validated. HPLC analysis revealed the presence of chlorogenic acid, rutin and its major compound, isoquercitrin. Thus, M. nigra leaf extract was standardized using these polyphenols as markers. Cytotoxicity wasassessed by MTT assay on murine melanomas (B16F10), humankeratinocytes (HaCat) andmouse fibroblasts (L-929). Cytotoxicity was not observed to the cell lines in tyrosinase IC50 values. This study demonstrated the potential of M. nigra extract as a promising whitening agent of natural source against skin hyperpigmentation.

O ácido azelaico é um fármaco amplamente utilizado como tratamento em diversas doenças de pele, como acne, rosácea e melasma. A utilização de sistemas nanoestruturados para aplicação tópica se mostra interessante visto que o menor tamanho de partícula proporciona uma melhor entrega de fármacos até o seu sítio de ação. É promissor o desenvolvimento de formulações capazes de diminuir os efeitos adversos do ácido azelaico e intensificar sua eficácia no tratamento de desordens pigmentárias da pele, aliado ao desenvolvimento de uma formulação com controle de permeação e perfil sensorial que facilite a adesão ao tratamento. O objetivo do presente trabalho é desenvolver uma nanoemulsão contendo ácido azelaico e realizar ensaios da tirosinase, permeação cutânea e análise sensorial da formulação desenvolvida. A nanoemulsão foi preparada através da técnica de homogeneização a alta velocidade. A caracterização físico-química avaliou os parâmetros de diâmetro médio de partícula e distribuição do tamanho de partícula pela técnica de difração de laser, o potencial zeta foi medido por mobilidade eletroforética, o pH por potenciometria e teor e eficiência de encapsulação por CLAE. A morfologia foi observada por microscopia eletrônica de transmissão. A nanoemulsão foi estável por 30 dias a 30°C/ 65% UR. A formulação apresentou teor de 10 mg/mL, tamanho de partícula de 419 ± 23 nm, distribuição monomodal, eficiência de encapsulação de 84,65%, potencial zeta de -10,9 ± 0,44 mV e pH de 5,01 ± 0,01. Para verificar a eficácia despigmentante da formulação foi realizado o ensaio in vitro de inibição de tirosinase, onde a nanoemulsão se mostrou mais eficaz que o controle com o fármaco na sua forma livre. O ensaio de permeação cutânea in vitro em células de difusão de Franz foi realizado com pele de orelha de porcos durante 24 horas e ele demonstrou que a formulação nanotecnológica conseguiu atingir as camadas mais profundas da pele (epiderme viável e derme), permitindo que o fármaco alcance o seu sítio de ação, facilitando a inibição da síntese de melanina. Foi realizada análise sensorial descritiva, com 16 voluntários demonstrando que a formulação apresentou maior espalhabilidade e menor brilho que um produto já disponível no mercado. Portanto, a nanoemulsão desenvolvida se mostra promissora para utilização no tratamento de melasma, inclusive o dérmico. / Azelaic acid is a drug commonly used in the treatment of several skin diseases such as acne, rosacea and melasma. Nanostructured systems for topical application are interesting because its smaller particle size lead to a better drug delivery to its action site. Therefore, it is promising to develop formulations able to lower azelaic acid’s side effects and increase its efficacy as a skin whitening agent as well as control its permeation and shows a sensory profile that helps with patient adherence. The aim of the present work is to develop an azelaic-acid loaded nanoemulsion, evaluating its tyrosinase inhibition, skin permeation and sensory profile. The nanoemulsion was prepared using high shear homogenization. Its characterization was conducted evaluating the average particle diameter through laser diffraction, the zeta potential by eletrophoretic mobility, pH by potentiometry and drug content and encapsulation efficiency by HPLC. The morphology of the nanoemulsion was observed by transmission electron microscopy. The product was stable for 30 days at 30°C/ 65 % RH. The theoretical drug content was 10 mg/mL and the particle size 419 ± 23 nm with a monomodal distribution profile, encapsulation efficiency of 84,65% and the zeta potencial was -10,9 ± 0,44 mV while the pH was 5,01 ± 0,01. To evaluate the formulation’s whitening efficacy, tyrosinase inhibition was calculated and the azelaicacid loaded nanoemulsion was more effective than the control with the drug in its free form. The in vitro permeation study using Franz diffusion cells was conducted for 24 hours, using pig ear skin and showed that the formulation was able to permeate through the skin and reach the deeper layers (viable epidermis and dermis), allowing the drug to reach its action site, improving the melanin synthesis inhibition. To help understand the sensory profile of the nanoemulsion, a descriptive sensory evaluation was conducted with 16 volunteers. The nanoemulsion’s sensory profile showed a better spreadability and lower shine comparing with a product already available in pharmacies. Hence, the azelaic acid-loaded nanoemulsion developed in this word seems to be promising as a treatment for pigmentary skin disorders as dermal melasma.

O ácido azelaico é um fármaco amplamente utilizado como tratamento em diversas doenças de pele, como acne, rosácea e melasma. A utilização de sistemas nanoestruturados para aplicação tópica se mostra interessante visto que o menor tamanho de partícula proporciona uma melhor entrega de fármacos até o seu sítio de ação. É promissor o desenvolvimento de formulações capazes de diminuir os efeitos adversos do ácido azelaico e intensificar sua eficácia no tratamento de desordens pigmentárias da pele, aliado ao desenvolvimento de uma formulação com controle de permeação e perfil sensorial que facilite a adesão ao tratamento. O objetivo do presente trabalho é desenvolver uma nanoemulsão contendo ácido azelaico e realizar ensaios da tirosinase, permeação cutânea e análise sensorial da formulação desenvolvida. A nanoemulsão foi preparada através da técnica de homogeneização a alta velocidade. A caracterização físico-química avaliou os parâmetros de diâmetro médio de partícula e distribuição do tamanho de partícula pela técnica de difração de laser, o potencial zeta foi medido por mobilidade eletroforética, o pH por potenciometria e teor e eficiência de encapsulação por CLAE. A morfologia foi observada por microscopia eletrônica de transmissão. A nanoemulsão foi estável por 30 dias a 30°C/ 65% UR. A formulação apresentou teor de 10 mg/mL, tamanho de partícula de 419 ± 23 nm, distribuição monomodal, eficiência de encapsulação de 84,65%, potencial zeta de -10,9 ± 0,44 mV e pH de 5,01 ± 0,01. Para verificar a eficácia despigmentante da formulação foi realizado o ensaio in vitro de inibição de tirosinase, onde a nanoemulsão se mostrou mais eficaz que o controle com o fármaco na sua forma livre. O ensaio de permeação cutânea in vitro em células de difusão de Franz foi realizado com pele de orelha de porcos durante 24 horas e ele demonstrou que a formulação nanotecnológica conseguiu atingir as camadas mais profundas da pele (epiderme viável e derme), permitindo que o fármaco alcance o seu sítio de ação, facilitando a inibição da síntese de melanina. Foi realizada análise sensorial descritiva, com 16 voluntários demonstrando que a formulação apresentou maior espalhabilidade e menor brilho que um produto já disponível no mercado. Portanto, a nanoemulsão desenvolvida se mostra promissora para utilização no tratamento de melasma, inclusive o dérmico. / Azelaic acid is a drug commonly used in the treatment of several skin diseases such as acne, rosacea and melasma. Nanostructured systems for topical application are interesting because its smaller particle size lead to a better drug delivery to its action site. Therefore, it is promising to develop formulations able to lower azelaic acid’s side effects and increase its efficacy as a skin whitening agent as well as control its permeation and shows a sensory profile that helps with patient adherence. The aim of the present work is to develop an azelaic-acid loaded nanoemulsion, evaluating its tyrosinase inhibition, skin permeation and sensory profile. The nanoemulsion was prepared using high shear homogenization. Its characterization was conducted evaluating the average particle diameter through laser diffraction, the zeta potential by eletrophoretic mobility, pH by potentiometry and drug content and encapsulation efficiency by HPLC. The morphology of the nanoemulsion was observed by transmission electron microscopy. The product was stable for 30 days at 30°C/ 65 % RH. The theoretical drug content was 10 mg/mL and the particle size 419 ± 23 nm with a monomodal distribution profile, encapsulation efficiency of 84,65% and the zeta potencial was -10,9 ± 0,44 mV while the pH was 5,01 ± 0,01. To evaluate the formulation’s whitening efficacy, tyrosinase inhibition was calculated and the azelaicacid loaded nanoemulsion was more effective than the control with the drug in its free form. The in vitro permeation study using Franz diffusion cells was conducted for 24 hours, using pig ear skin and showed that the formulation was able to permeate through the skin and reach the deeper layers (viable epidermis and dermis), allowing the drug to reach its action site, improving the melanin synthesis inhibition. To help understand the sensory profile of the nanoemulsion, a descriptive sensory evaluation was conducted with 16 volunteers. The nanoemulsion’s sensory profile showed a better spreadability and lower shine comparing with a product already available in pharmacies. Hence, the azelaic acid-loaded nanoemulsion developed in this word seems to be promising as a treatment for pigmentary skin disorders as dermal melasma.

Os compostos fenólicos, quando em altas concentrações na água, são poluentes de alta periculosidade, difíceis de serem eliminados até mesmo por métodos convencionais, como por exemplo, a biorremediação microbiológica dos lodos ativados e os métodos físico-químicos. Sabendo da presença dos fenóis em muitos efluentes industriais se faz necessário o estudo de novos processos para o tratamento desses efluentes que possuam aplicações eficazes e, sobretudo, ecologicamente corretas. A presente pesquisa visou a degradação de poluentes fenólicos em soluções aquosas através da oxidação enzimática com tirosinase imobilizada em quitosana. A contribuição tecnológica relaciona-se com a possibilidade de aplicação do estudo em escala industrial em processos de tratamento de efluentes industriais que contenham poluentes fenólicos. Fenóis como o 4-clorofenol, 4-cresol, 4-nitrofenol e o próprio fenol, foram utilizados em ensaios de oxidação enzimática em vaso agitado, em regime dinâmico, em processo de batelada, temperatura de 45°C e três faixas de concentração enzimática (40, 60 e 80 U/ml). Além disso, foram testadas três formas de quitosana utilizadas na imobilização enzimática e aplicadas nos processos de oxidação de fenol: esferas, flocos e micro partículas de quitosana. A enzima tirosinase foi eficiente na degradação de fenol, 4-cresol e 4-clorofenol, diminuindo consideravelmente a concentração destes poluentes nas soluções aquosas. Porém, a tirosinase não oxidou significativamente o 4-nitrofenol. Verificou-se que o efeito de alguns substituintes do anel aromático do fenol e a posição desse substituinte no anel aromático, exerce influência direta na atividade da enzima durante as reações oxidativas envolvendo os compostos fenólicos. Embora o presente estudo tenha apresentado bons resultados na remoção de alguns compostos fenólicos em soluções aquosas por meio da oxidação de tais poluentes pela enzima tirosinase imobilizada em quitosana, o complexo enzima-suporte não apresentou a mesma eficiência nos ensaios subseqüentes, nos quais foi estudada a reutilização da enzima imobilizada. / The phenolic compounds when in high concentrations in water are extremely dangerous pollutants and difficult to be eliminated even by conventional methods such as the microbiological bioremediation with activated sludge and physico-chemical methods. Phenols are present in many industrial effluents and is necessary to develop new and effective processes for the treatment of that effluents and, if possible, environmentally friendly. This research aimed the degradation of phenolic pollutants in aqueous solutions by enzymatic oxidation with tyrosinase immobilized in chitosan. Phenols such as 4-chlorophenol, 4-cresol, 4-nitrophenol and phenol, had been used in assays of enzymatic oxidation in an agitated reactor, in dynamic regime, in a batch process, temperature of 45°C and three values of enzymatic concentration ( 40, 60 and 80 U/ml). In addition, three forms of chitosan had been used in enzymatic immobilization and applied in the processes of oxidation of phenol: pellets, flakes and small particles of chitosan. Tyrosinase was efficient in the degradation of phenol, 4-cresol and 4-chlorophenol, reducing significantly the concentration of these pollutants in aqueous solutions. However, tyrosinase did not oxidized 4-nitrophenol. It was verified that the effect of some substitutes and their position in the aromatic ring has a direct influence on the activity of the enzyme during the oxidative reactions involving phenolic compounds. Although this study has shown good results in the removal of some phenolic compounds in aqueous solutions through the oxidation of such pollutants by the tyrosinase immobilized on chitosan, the enzyme-support did not present the same efficiency in subsequent assays, in which we studied the reuse of the immobilized enzyme.

O presente trabalho apresenta o estudo de processos biotecnológicos para a remoção de fenol de soluções aquosas em regime de batelada em 3 processos distintos (A), (B) e (C) respectivamente. Sendo eles a adsorção de fenóis de soluções aquosas em Quitosana, degradação enzimática de fenóis através da tirosinase em meio aquoso e adsorção/degradação de fenóis de soluções aquosas em Quitosana contendo tirosinase imobilizada. Para isto foram estudadas as influências das variáveis temperatura, pH, concentração da Quitosana e velocidade de agitação no processo (A), temperatura, pH, concentração da tirosinase livre e velocidade de agitação no processo (B) e no processo (C), temperatura, pH, concentração da Quitosana, concentração da tirosinase imobilizada e velocidade de agitação. / This paper presents the study of biotechnology processes for the removal of pHenol from aqueous solution in batch reactor in 3 separate cases (A), (B) and (C) respectively. As they adsorption of pHenols from aqueous solutions on chitosan, enzymatic degradation of pHenols by tyrosinase in aqueous solution and adsorption / degradation of pHenols in aqueous solutions containing chitosan immobilized tyrosinase. For this we examined the influence of varying temperature, pH, concentration of chitosan and stirring speed of the process (A), temperature, pH, concentration of free tyrosinase and stirring speed of the process (B) and Case (C), temperature , pH, concentration of chitosan, concentration of tyrosinase immobilized and speed of agitation.

O presente trabalho apresenta o estudo de processos biotecnológicos para a remoção de fenol de soluções aquosas em regime de batelada em 3 processos distintos (A), (B) e (C) respectivamente. Sendo eles a adsorção de fenóis de soluções aquosas em Quitosana, degradação enzimática de fenóis através da tirosinase em meio aquoso e adsorção/degradação de fenóis de soluções aquosas em Quitosana contendo tirosinase imobilizada. Para isto foram estudadas as influências das variáveis temperatura, pH, concentração da Quitosana e velocidade de agitação no processo (A), temperatura, pH, concentração da tirosinase livre e velocidade de agitação no processo (B) e no processo (C), temperatura, pH, concentração da Quitosana, concentração da tirosinase imobilizada e velocidade de agitação. / This paper presents the study of biotechnology processes for the removal of pHenol from aqueous solution in batch reactor in 3 separate cases (A), (B) and (C) respectively. As they adsorption of pHenols from aqueous solutions on chitosan, enzymatic degradation of pHenols by tyrosinase in aqueous solution and adsorption / degradation of pHenols in aqueous solutions containing chitosan immobilized tyrosinase. For this we examined the influence of varying temperature, pH, concentration of chitosan and stirring speed of the process (A), temperature, pH, concentration of free tyrosinase and stirring speed of the process (B) and Case (C), temperature , pH, concentration of chitosan, concentration of tyrosinase immobilized and speed of agitation.

Os compostos fenólicos, quando em altas concentrações na água, são poluentes de alta periculosidade, difíceis de serem eliminados até mesmo por métodos convencionais, como por exemplo, a biorremediação microbiológica dos lodos ativados e os métodos físico-químicos. Sabendo da presença dos fenóis em muitos efluentes industriais se faz necessário o estudo de novos processos para o tratamento desses efluentes que possuam aplicações eficazes e, sobretudo, ecologicamente corretas. A presente pesquisa visou a degradação de poluentes fenólicos em soluções aquosas através da oxidação enzimática com tirosinase imobilizada em quitosana. A contribuição tecnológica relaciona-se com a possibilidade de aplicação do estudo em escala industrial em processos de tratamento de efluentes industriais que contenham poluentes fenólicos. Fenóis como o 4-clorofenol, 4-cresol, 4-nitrofenol e o próprio fenol, foram utilizados em ensaios de oxidação enzimática em vaso agitado, em regime dinâmico, em processo de batelada, temperatura de 45°C e três faixas de concentração enzimática (40, 60 e 80 U/ml). Além disso, foram testadas três formas de quitosana utilizadas na imobilização enzimática e aplicadas nos processos de oxidação de fenol: esferas, flocos e micro partículas de quitosana. A enzima tirosinase foi eficiente na degradação de fenol, 4-cresol e 4-clorofenol, diminuindo consideravelmente a concentração destes poluentes nas soluções aquosas. Porém, a tirosinase não oxidou significativamente o 4-nitrofenol. Verificou-se que o efeito de alguns substituintes do anel aromático do fenol e a posição desse substituinte no anel aromático, exerce influência direta na atividade da enzima durante as reações oxidativas envolvendo os compostos fenólicos. Embora o presente estudo tenha apresentado bons resultados na remoção de alguns compostos fenólicos em soluções aquosas por meio da oxidação de tais poluentes pela enzima tirosinase imobilizada em quitosana, o complexo enzima-suporte não apresentou a mesma eficiência nos ensaios subseqüentes, nos quais foi estudada a reutilização da enzima imobilizada. / The phenolic compounds when in high concentrations in water are extremely dangerous pollutants and difficult to be eliminated even by conventional methods such as the microbiological bioremediation with activated sludge and physico-chemical methods. Phenols are present in many industrial effluents and is necessary to develop new and effective processes for the treatment of that effluents and, if possible, environmentally friendly. This research aimed the degradation of phenolic pollutants in aqueous solutions by enzymatic oxidation with tyrosinase immobilized in chitosan. Phenols such as 4-chlorophenol, 4-cresol, 4-nitrophenol and phenol, had been used in assays of enzymatic oxidation in an agitated reactor, in dynamic regime, in a batch process, temperature of 45°C and three values of enzymatic concentration ( 40, 60 and 80 U/ml). In addition, three forms of chitosan had been used in enzymatic immobilization and applied in the processes of oxidation of phenol: pellets, flakes and small particles of chitosan. Tyrosinase was efficient in the degradation of phenol, 4-cresol and 4-chlorophenol, reducing significantly the concentration of these pollutants in aqueous solutions. However, tyrosinase did not oxidized 4-nitrophenol. It was verified that the effect of some substitutes and their position in the aromatic ring has a direct influence on the activity of the enzyme during the oxidative reactions involving phenolic compounds. Although this study has shown good results in the removal of some phenolic compounds in aqueous solutions through the oxidation of such pollutants by the tyrosinase immobilized on chitosan, the enzyme-support did not present the same efficiency in subsequent assays, in which we studied the reuse of the immobilized enzyme.

Submitted by Alisson Mota (alisson.davidbeckam@gmail.com) on 2015-07-21T20:23:22Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Fabiano de Sousa Vargas.pdf: 3768449 bytes, checksum: fcc3a57e9e6cbb1e79933d1feba3250c (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-23T18:52:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Fabiano de Sousa Vargas.pdf: 3768449 bytes, checksum: fcc3a57e9e6cbb1e79933d1feba3250c (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-23T18:56:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Fabiano de Sousa Vargas.pdf: 3768449 bytes, checksum: fcc3a57e9e6cbb1e79933d1feba3250c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-23T18:56:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Fabiano de Sousa Vargas.pdf: 3768449 bytes, checksum: fcc3a57e9e6cbb1e79933d1feba3250c (MD5) Previous issue date: 2013-08-30 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Copaíba ( Copaifera L. ) is one of the best known and Amazonian plants used by traditional populations in natural medicine . The oleoresin of copaiba is a source of terpene compounds. The previous fractionation of terpene acids contained copaiba oil for the isolation of metabolites of interest is a useful method in dispatch processes phytochemicals later. The use of ion exchange chromatography is an alternative that minimizes the inconvenience of the formation of emulsions difficult separation. This paper proposes the use of methodology by ion exchange chromatography silica treated with aqueous KOH in order to re-isolate constituent terpenoids acids present in oleoresin gender Copaifera L quantity that allows making various biological assays. Aspects of the anti-inflammatory activity and antitumor activity via biological assays, enzymatic assays being developed tests (inhibition of tyrosinase and lipoxygenase) of cytokine and cytotoxicity in model cell culture in order to get a new bioactive compound that can be used in the preparation of a phytochemical or phyto, such as bleaching or skin protectors. Were obtained and identified by spectroscopic and spectrometric methods six (06) diterpene acids: copalic, 3-hydroxy-copalic, 3-acetoxy-copalic, hardwíckiico, colávico-15-methyl ester and kaurenoic. The acid 3-hydroxy-copalic was capable of inhibiting tyrosinase enzyme with IC50=255.53 ±18.59 μM . The colávico-15-methyl ester showed a higher capacity to inhibit lipoxygenase enzyme (IC50=157.82 ±17.69 μM ) . The cytotoxic activity of the substances was evaluated in healthy cells by strains of human lymphocytes , fibroblasts and 3T3L1 murine J774 macrophages , which poisonous substances only at concentrations above 250 μM . Was also made of the APPRAISAL hemolytic potential of the compounds , and found that none had significant hemolytic activity at concentrations up to 50 mM . For lines AGP - 1 ( gastric cancer ) , HCT -116 (colon cancer) , MCF - 7 ( breast cancer) , NIHOVCAR ( ovarian cancer ) , SKAMELL - 4 ( melanoma ) and SF -295 ( human glioblastoma ) , tested at a single concentration of 20 μM , showed no significant changes in cell viability . The antiinflammatory activity of the compounds was evaluated as inhibition of NO production in murine J774 macrophage lineage stimulated with LPS where the copalic acid ( 98.48 ± 1.30 % ) and hardwickiico acid ( 92.73 ± 4.97% ) had activity equivalent to that of standard indomethacin ( 96.58 ± 1.7 % ) at concentration of 100 μM . Was investigated first the effect of compounds isolated diterpene acids on the production of TNF - α , IL -6 and IL-10. The compounds did not inhibit the production of TNF - α . The acid 3-acetoxy-copalic, kaurenoic , colávico-15-methyl ester and copalic inhibited the production of IL -6 23.84 ± 8.17 %, 11.21 ± 5.74 %, 17.34 ± 4 18 ± 1.86 % and 4.19 %, respectively, at a single concentration of 50 μM . The kaurenoic acid , 3- acetoxy - copalic copalic and induced the production of IL-10 at concentrations of 12.5 μM and 25 μM , but there was a decrease in this induction when tested at a concentration of 50 μM . The kolávic-15-methyl ester and hardwickiic acid no changes of IL -10. Thus, these diterpenes may be considered components responsible for contributing to combat inflammation, however it is necessary to develop a pharmaceutical probably topical, to conduct clinical trials aimed to demonstrate its application in the treatment of injuries acute and chronic skin. / A copaíba (Copaifera L.) é uma das plantas amazônicas mais conhecidas e utilizadas por populações tradicionais como medicamento natural. O óleo-resina de copaíba é fonte de compostos terpênicos. O fracionamento prévio dos ácidos terpênicos contidos óleo de copaíba para o isolamento de metabólitos de interesse é um método útil na celeridade dos processos fitoquímicos posteriores. A utilização da cromatografia de troca iônica é uma alternativa que minimiza o inconveniente da formação de emulsões de difícil separação. O presente trabalho propõe o uso de metodologia de cromatografia por troca iônica por sílica tratada com solução aquosa de KOH com o objetivo de re-isolar constituintes ácidos terpenoides presentes em óleo-resinas do gênero Copaifera L em quantidade que permita a realização de diversos ensaios biológicos. Foram abordados aspectos da atividade anti-inflamatória e antitumoral, por meio de ensaios biológicos, sendo desenvolvidos ensaios enzimáticos (testes de inibição da tirosinase e lipoxigenase), de dosagem de citocinas e de modelo de citotoxicidade em cultura de células, a fim de obter-se um novo composto bioativo que poderá ser utilizado na elaboração de um fitofármaco ou fitocosmético, tais como clareadores ou protetores de pele. Foram obtidos e identificados por métodos de espectroscopia e espectrometria, seis (06) ácidos diterpênicos: os ácidos copálico, 3-hidróxi-copálico, 3-acetóxi-copálico, hardwíckiico, colávico-15-metil éster e o caurenóico. Apenas o ácido 3-OH-copálico apresentou capacidade de inibição da enzima tirosinase com CI50 de 255,53 ±18,59 μM. O colávico-15-metil éster apresentou maior capacidade de inibição da enzima lipoxigenase (CI50 = 157,82 ±17,69 μM). As atividades citotoxicas das substâncias foram avaliadas em células saudáveis por linhagens de linfócitos humanos, fibroblastos murinos 3T3L1 e macrófagos J774, sendo as substancias tóxicas apenas em concentrações acima de 250 μM. Foi feita também a avalição do potencial hemolítico dos compostos, sendo verificado que nenhum apresentou atividade hemolítica significativa em concentrações de até 50 mM. Para as linhagens AGP-1 (câncer gástrico), HCT-116 (cólon retal), MCF-7 (câncer de mama), NIHOVCAR (câncer de ovário), SKAMELL-4 (melanona) e SF-295 (glioblastoma humano), testadas em concentração única de 20 μM, não apresentaram alterações significativas da viabilidade celular. A atividade antiinflamatoria dos compostos foi avaliada quanto à inibição da produção de NO na linhagem de macrófagos murinos J774 estimulados com LPS, onde o ácido copálico (98,48±1,30%) e o ácido hardwickiico (92,73±4,97%) tiveram atividade equivalente ao do padrão indometacina (96,58±1,7%), todos na concentração de 100 μM. Foi investigada pela primeira vez a influência de compostos ácidos diterpênicos isolados sobre a produção de citocina TNF-α, IL-6 e IL-10. Os compostos não inibiram a produção de TNF-α. Os ácidos 3-acetóxi-copálico, caurenóico, colávico-15-metil éster e o copálico inibiram a produção de IL-6 em 23,84±8,17%; 11,21±5,74%; 17,34±4,18% e 4,19±1,86%, respectivamente, na concentração única de 50 μM. Os ácidos caurenóico, 3-acetóxi-copálico e copálico induziram a produção de IL-10 em concentrações entre 12,5 μM e 25 μM, porém houve uma diminuição nessa indução quando testados na concentração de 50 μM. Para os ácidos colávico-15-metil éster e o hardwickiico não houve alterações da produção de IL-10. Com isso, esses diterpenos podem ser considerados componentes responsáveis por contribuir no combate ao processo inflamatório, no entanto faz-se necessário o desenvolvimento de uma formulação farmacêutica, provavelmente de uso tópico, para realização de ensaios clínicos visando comprovar a sua aplicação no tratamento de lesões de pele agudas e crônicas.