Toll-like receptor 4 (TLR4) is a transmembrane receptor, which upon activation by lipopolysaccharide (LPS) from Gram-negative bacteria, plays an important role in the induction of the innate immune response. Our lab has previously demonstrated that activation of TLR4 in skeletal muscle results in the preferential oxidation of glucose for ATP production over that of fatty acids. Currently, the exact mechanism(s) for TLR4-induced modulation of metabolism are not known. The purpose of this project was to test the hypothesis that activation of TLR4 pathway causes increased ROS production, which contributes to deceased fatty acid oxidation and altered mitochondrial respiration in skeletal muscle. To this end, skeletal muscle cells were studied following acute and chronic treatments with LPS, and a mouse model with muscle-specific over expression of TLR4 (mTLR4) was studied under chow fed conditions and following 16 weeks of high fat feeding. Acute LPS treatment of C2C12 cells resulted in mitochondrial uncoupling as evidenced by higher levels of state IV respiration, reduced maximally simulated respiration, and a robust induction of uncoupling protein 3. These observations occurred in conjunction with increased pyruvate dehydrogenase activity. The LPS-induced changes in substrate preferences and maximally-stimulated mitochondrial respiration were prevented in the presence of the antioxidants, N-acetyl-L-cyteine (NAC) and catalase. Using isolated flexor digitorum brevis (FDB) muscle fibers from C57BL/6J mice, we showed that LPS treatment results in significant increases in ROS production that are evident at 15 min and still increasing at 45 min following the addition of LPS to incubation media. Hyperpolarization of mitochondrial membrane potential was also evident at 15 min post LPS treatment in FDB fibers. Fatty acid oxidation measured in skeletal muscle whole homogenates from the mTLR4 mice was significantly reduced compared to wild-type littermates on a standard chow diet. Following a 16 week high fat diet, the mTLR4, compared to wild-type mice, gained more weight and fat mass, were glucose intolerant, and displayed elevated production of mitochondrial-derived reactive oxygen species (ROS) from complex III. In conclusion, these data show that TLR4 activation elicits a change in mitochondrial substrate preference in that acetyl-CoA derived from pyruvate oxidation is the preferred substrate for the TCA cycle over that derived from β-oxidation of fatty acids. These data also lend strong support to the idea that the TLR4-mediated change in substrate preference is dependent on the production of ROS. / Ph. D.

Lipopolysaccharide (LPS), a Gram-negative endotoxin, has been well-established as the trigger for the effects of sepsis and septic shock through its binding with the innate immune receptor, Toll-like receptor 4 (TLR4). High doses of LPS signal through TLR4 to produce a massive release of pro-inflammatory cytokines including IL-6, TNFα, and other. Additionally, several recent publications have demonstrated severe metabolic alterations after LPS challenge, suppressing lipid oxidation and concurrently up-regulating glucose oxidation. Unfortunately, this switch in metabolism is inefficient for the great energy demands of the host during a systemic microbial infection which can result in vital organ failure. Meanwhile, a novel concept in several chronic disease pathologies also implicates LPS, although at very low doses. The presence of subclinically elevated circulating endotoxin levels has been termed metabolic endotoxemia and is beginning to be investigated in disease pathologies including insulin resistance and type II diabetes, atherosclerosis, cancer metastasis and Parkinson's disease. These disease phenotypes all possess a component of chronic inflammation whose source has not largely been understood, but examining the effects of very low doses of LPS may provide vital information in understanding their etiologies. However, most information on LPS signaling has been obtained using high doses of LPS (10-200ng/ml) while little to no studies have been published regarding the effects of very low doses of LPS (1pg-100pg/ml) on inflammatory and metabolic alterations. Thus, we use in vivo and in vitro models to determine that both IRAK1 and JNK are critical points of crosstalk downstream of TLR4 for the metabolic and inflammatory alterations associated with metabolic endotoxemia. Additionally, we observed significant down-regulation of nuclear receptors responsible for fatty acid metabolism, including PGC1α, PPARα, and PPARγ after very low dose LPS challenge. Further, we observe phenotypic changes in fatty acid oxidation and glucose oxidation, as well as subsequent changes in cytosolic acetyl-CoA levels and acetylation of pro-inflammatory transcription factor ATF2. Overall our studies point to several mechanisms of cross-talk between metabolism and inflammation and offer significant support to the concept of metabolic endotoxemia in the development of chronic disease. / Ph. D.

Toll like receptor-4 (TLR4) is a transmembrane inflammatory receptor expressed ubiquitously on the cell surface of immune cells as well as skeletal muscle and other metabolic tissues. A compelling body of evidence shows that muscle TLR4 and the downstream cytokine signaling modulate skeletal muscle metabolism. Intriguingly, skeletal muscle has been demonstrated to gain favorable inflammatory cytokine-mediated metabolic adaptations in the context of exercise training. This paradigm suggests a role for muscle TLR4 inflammatory signaling in the regulation of exercise metabolism. As such, the question arises as to whether exercise stress response follows similar inflammatory physiological pathways to those activated by other physical and pathogenic stimuli or not. Therefore, the objective of the present study was to investigate the role of muscle TLR4 signaling in modulating skeletal muscle cytokine, also known as myokine, response and metabolic adaptations to exercise. To this end, using Cre-mediated recombination, we developed a novel muscle-specific TLR4 knockout (mTLR4-/-) mouse model on C57BL/6JJ background. The differential inflammatory and metabolic responses between mTLR4-/- mice and wild type (WT) littermates were examined following exposure to either exercise or muscle stimulus. Accordingly, different exercise and muscle contraction modalities were pursued, focusing on voluntary wheel running, forced treadmill training, and in vivo electrical muscle stimulation. Overall, this study introduces a novel muscle-specific TLR4 knockout mouse model and discloses a crucial role for mTLR4 in basal systemic cytokine homeostasis. Furthermore, our findings identify mTLR4 as a major immunomodulatory effector of exercise-induced metabolic adaptations and suggest a link between mTLR4 and physiological determinants of maximal aerobic performance. / Ph. D. / Exercise is an effective health care modality that exerts many physiological and metabolic benefits. Yet, the magnitude of health outcome differs between individuals, which has encouraged scientists to study biological factors responsible for variable responses to exercise. Our bodies respond to exercise as a whole, which requires harmonious communication among multiple body systems. Skeletal muscle, a major metabolic tissue mainly responsible for bodily movements, plays a key role in whole body energy balance. During exercise skeletal muscle naturally undergoes mechanical and metabolic stress with a subsequent immune reaction known as inflammation. Not only is this exercise-induced inflammatory response known to repair muscle damage, it has also been shown to modulate several of the salutary metabolic effects of exercise. The goal of the study was to better understand how exercise-induced inflammatory response and the subsequent metabolic adjustments are regulated at the level of skeletal muscle. Our data indicate that mTLR4, an immune receptor imbedded in the surface of muscle cells, modulates the inflammatory signals initiated during exercise. Furthermore, we found that genetically modified mice lacking mTLR4 were unable to develop the normal metabolic adaptations to exercise training. Unlike wild type mice, these mTLR4 deficient mice failed to improve fat and/or glucose utilization after one month of either voluntary wheel running or controlled treadmill training. These findings suggest that defects in this immune receptor, commonly reported with obesity, may alter whole body metabolism and the health outcomes of exercise. Future studies should aim to investigate whether different exercise modalities, such as resistance training, could possibly bypass these limitations induced by mTLR4 abnormities.

Acidentes escorpiônicos podem evoluir com edema pulmonar de origem cardiogênica e não cardiogênica. O clearance de edema pulmonar está relacionado principalmente ao transporte ativo de sódio do espaço alveolar para o interstício. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do veneno de Tityus serrulatus e da dexametasona sobre a expressão dos transportadores de sódio e água e do TLR4 em pulmão de ratos. Foram utilizados ratos Wistar, divididos em três grupos: controle (salina); grupo Vn, que recebeu o veneno de T. serrulatus (3.8 mg/kg) por via intraperitoneal (ip), e o grupo Dx+Vn, que recebeu dexametasona (2.0 mg/kg) por via ip, uma hora antes da injeção do veneno. Os experimentos foram realizados uma hora após a injeção do veneno. Foram realizadas análise bioquímica e dosagens de citocinas no plasma. Nos pulmões foram estudados a expressão de -ENaC, Na+-K+- ATPase, NKCC1, AQP-5 e TRL4 através de western blotting, e a expressão do NF-kB e infiltração de células CD68+ (monócitos/macrófagos) e neutrófilos, através de imunoistoquímica. O veneno de T. serrulatus diminuiu a expressão pulmonar de -ENaC e AQP-5, enquanto aumentou a expressão do NKCC1. A dexametasona preveniu os efeitos do veneno sobre a expressão da -ENaC e NKCC1, mas não da AQP5. Não foi observada alteração da expressão da 1- Na+-K+-ATPase . A expressão do TLR4 foi maior nos animais envenenados que nos grupos Cont e Dx+Vn. O níveis plasmáticos de IL-6, IL-10 e TNF- estavam aumentados nos grupo Vn e Dx+Vn em relação ao controle. O infiltrado de células CD68+ foi maior no grupo Vn. A expressão de NF-kB e o infiltrado ne neutrófilos no tecido pulmonar foi semelhantes nos três grupos avaliados. Os resultados encontrados sugerem que o veneno de T. serrulatus tem efeito sobre as proteínas transportadoras de sódio em células do epitélio alveolar e também sobre a expressão do TLR4 em pulmão; a dexametasona pode regular essas ações / Scorpion envenomation can cause cardiogenic and noncardiogenic pulmonary edema. Pulmonary edema clearance is largely related to active Na+ transport out of the alveoli, rather than to reversal of Starling forces. Our objective was determine the effects of Tityus serrulatus venom and dexamethasone on the pulmonary expression of sodium and water transporters, and Toll-like receptor 4. Wistar rats were divided into groups and injected intraperitoneally: control (saline only); venom (T. serrulatus venom3.8 mg/kg body weight); and dexamethasone+venom (dexamethasone2.0 mg/kg body weight60 min before venom inoculation). At 60 min after venom inoculation, interleukin-6 and -10, together with tumor necrosis factor alpha, were analyzed in plasma. In lungs, we determined expression of the epithelial sodium channel alpha subunit; Na,K-ATPase alpha 1 subunit; Na-K-2Cl cotransporter, NKCC1; aquaporin 5; Toll-like receptor 4 (by Western blotting); and nuclear factor-kappa B. We determined CD68 and neutrophil counts by immunohistochemistry. In venom group lungs, the epithelial sodium channel alpha subunit and aquaporin 5 were markedly downregulated, whereas NKCC1 was elevated, although the Na,K-ATPase alpha 1 subunit was unaffected. Dexamethasone protected the epithelial sodium channel alpha subunit, NKCC1, and Toll-like receptor 4 but not aquaporin 5. Serum interleukin 6, interleukin 10, and tumor necrosis factor alpha were elevated in both groups, as was CD68 expression. Neutrophil counts and nuclear factor-kappa B expression were comparable across groups. Our data show that T. serrulatus venom alters sodium transport in alveolar epithelial cells and increases Toll-like receptor 4 expression. Dexamethasone appears to partially protect against those effects

O TSPO (Translocator protein 18 KDa) é uma proteína intracelular localizada na membrana mitocondrial externa, mas também na membrana citoplasmática, e no núcleo. O TSPO está envolvido na biossíntese de esteroides, proliferação celular, apoptose, estresse oxidativo, e na modulação da inflamação, principalmente no sistema nervoso central, onde a proteína é considerada um marcador da neuroinflamação. Os neutrófilos representam células-chave no processo inflamatório sendo as primeiras células a chegarem no foco inflamatório onde exercem atividades fagocíticas, secretórias e microbicidas. O presente trabalho investigou os efeitos de diferentes ligantes de TSPO Diazepam, Ro5-4864 (agonistas parciais) e PK-11195 (antagonista) na ativação dos neutrófilos in vitro focando na via de ativação do Toll-like receptor (TLR) e de receptores transmembranas ligados a proteína G (GPCR). Neutrófilos obtidos da cavidade peritoneal de camundongos BalbC machos quatro horas após injeção do glicogênio de ostra (1%), foram tratados in vitro com meio de cultura, veículo, Diazepam, Ro5-4864, PK-11195 (10, 100, e 1000 nM), e estimulados ou não com Lipopolissacarídeo (LPS) ou Leucotrieno B4 (LTB4). Foram avaliados em condições basais e após estímulo: a expressão de TSPO e de moléculas de adesão por citometria de fluxo; a migração pelo ensaio de quimiotaxia em placa; a produção de citocinas e do óxido nítrico por ELISA e pela reação de Griess, respectivamente; e finalmente, a geração de espécies reativas de oxigênio por espectrofotômetro de fluorescência. Os resultados obtidos mostram que o TSPO é expresso em neutrófilos em condições basais, e que os estímulos inflamatórios com LPS ou LTB4 não alteram essa expressão. Os ligantes de TSPO não afetam as funções de neutrófilos ativados pelo LPS, salvo a acentuação da geração de espécies reativas (ROS) observada com Ro5-4864 em células estimuladas com LPS. Os neutrófilos estimulados pelo LTB4, quando pré-tratados com os ligantes de TSPO, apresentaram redução na clivagem da L-selectina, redução de quimiotaxia, e indução da geração de ROS. Baseado nestes resultados e nos dados da literatura, concluímos que os efeitos dos ligantes de TSPO sobre as funções neutrofílicas concentram-se na expressão de moléculas de adesão, no estresse oxidativo e na migração. Estes efeitos dependem da via de ativação e do tipo celular. / TSPO (Translocator protein 18 kDa) is an intracellular protein located on the out mitochondrial membrane, but also on the cytoplasmatic membrane and in the nucleus. TSPO is involved in endogen steroids substances biosynthesis, cellular proliferation, apoptosis, oxidative stress and in the modulation of inflammatory process, principally in the central nervous system where the protein is a marker of neuroinflammation. Neutrophils are key-cells in the inflammatory process, being the first cell line that reach the inflammatory focus, where they realize their phagocytic, secretory and microbicidal activities. This study assessed the effects of TSPO ligands Diazepam, Ro5-4864 (partial agonists) and PK-11195 (antagonist) on in vitro neutrophils activation, focusing on the Toll-like receptor (TLR) and G protein coupled receptors (GPCRs) pathways. Neutrophils obtained from de peritoneal cavity of male BalbC mouse after four hours of Oyster glycogen injection (1%), were treated in vitro with culture medium, vehicle, Diazepam, Ro5-4864, PK-11195 (10, 100, e 1000 nM) and stimulated or not with lipopolysaccharide (LPS) or Leukotriene B4 (LTB4). We assessed in basal conditions and after stimulus:The TSPO and adhesion molecules proteic expression by flow cytometry; the migration by a plate chemotaxis assay; Nitric oxide and cytokines production by ELISA and the Griess reaction, respectively; and finally the reactive oxygen species generation by a fluorescence spectrophotometer. The results show that TSPO is expressed in neutrophils in basal conditions, and that inflammatory stimulus with LPS and LTB4 did not alter this expression. We also show that TSPO ligands did not affect neutrophil function activated by LPS. However, neutrophils stimulated by LTB4, when pre-treated with TSPO ligands shown a reduced L-selectina cleavage, chemotaxis reduction and induction of ROS generation. Based on these data and in literature data, we concluded that the effects of TSPO ligands in neutrophilic functions is concentrated on adhesion molecules expression, on oxidative stress and on the migration. These effects depend to the activation pathways and to the cellular type.

O TSPO (Translocator protein 18 KDa) é uma proteína intracelular localizada na membrana mitocondrial externa, mas também na membrana citoplasmática, e no núcleo. O TSPO está envolvido na biossíntese de esteroides, proliferação celular, apoptose, estresse oxidativo, e na modulação da inflamação, principalmente no sistema nervoso central, onde a proteína é considerada um marcador da neuroinflamação. Os neutrófilos representam células-chave no processo inflamatório sendo as primeiras células a chegarem no foco inflamatório onde exercem atividades fagocíticas, secretórias e microbicidas. O presente trabalho investigou os efeitos de diferentes ligantes de TSPO Diazepam, Ro5-4864 (agonistas parciais) e PK-11195 (antagonista) na ativação dos neutrófilos in vitro focando na via de ativação do Toll-like receptor (TLR) e de receptores transmembranas ligados a proteína G (GPCR). Neutrófilos obtidos da cavidade peritoneal de camundongos BalbC machos quatro horas após injeção do glicogênio de ostra (1%), foram tratados in vitro com meio de cultura, veículo, Diazepam, Ro5-4864, PK-11195 (10, 100, e 1000 nM), e estimulados ou não com Lipopolissacarídeo (LPS) ou Leucotrieno B4 (LTB4). Foram avaliados em condições basais e após estímulo: a expressão de TSPO e de moléculas de adesão por citometria de fluxo; a migração pelo ensaio de quimiotaxia em placa; a produção de citocinas e do óxido nítrico por ELISA e pela reação de Griess, respectivamente; e finalmente, a geração de espécies reativas de oxigênio por espectrofotômetro de fluorescência. Os resultados obtidos mostram que o TSPO é expresso em neutrófilos em condições basais, e que os estímulos inflamatórios com LPS ou LTB4 não alteram essa expressão. Os ligantes de TSPO não afetam as funções de neutrófilos ativados pelo LPS, salvo a acentuação da geração de espécies reativas (ROS) observada com Ro5-4864 em células estimuladas com LPS. Os neutrófilos estimulados pelo LTB4, quando pré-tratados com os ligantes de TSPO, apresentaram redução na clivagem da L-selectina, redução de quimiotaxia, e indução da geração de ROS. Baseado nestes resultados e nos dados da literatura, concluímos que os efeitos dos ligantes de TSPO sobre as funções neutrofílicas concentram-se na expressão de moléculas de adesão, no estresse oxidativo e na migração. Estes efeitos dependem da via de ativação e do tipo celular. / TSPO (Translocator protein 18 kDa) is an intracellular protein located on the out mitochondrial membrane, but also on the cytoplasmatic membrane and in the nucleus. TSPO is involved in endogen steroids substances biosynthesis, cellular proliferation, apoptosis, oxidative stress and in the modulation of inflammatory process, principally in the central nervous system where the protein is a marker of neuroinflammation. Neutrophils are key-cells in the inflammatory process, being the first cell line that reach the inflammatory focus, where they realize their phagocytic, secretory and microbicidal activities. This study assessed the effects of TSPO ligands Diazepam, Ro5-4864 (partial agonists) and PK-11195 (antagonist) on in vitro neutrophils activation, focusing on the Toll-like receptor (TLR) and G protein coupled receptors (GPCRs) pathways. Neutrophils obtained from de peritoneal cavity of male BalbC mouse after four hours of Oyster glycogen injection (1%), were treated in vitro with culture medium, vehicle, Diazepam, Ro5-4864, PK-11195 (10, 100, e 1000 nM) and stimulated or not with lipopolysaccharide (LPS) or Leukotriene B4 (LTB4). We assessed in basal conditions and after stimulus:The TSPO and adhesion molecules proteic expression by flow cytometry; the migration by a plate chemotaxis assay; Nitric oxide and cytokines production by ELISA and the Griess reaction, respectively; and finally the reactive oxygen species generation by a fluorescence spectrophotometer. The results show that TSPO is expressed in neutrophils in basal conditions, and that inflammatory stimulus with LPS and LTB4 did not alter this expression. We also show that TSPO ligands did not affect neutrophil function activated by LPS. However, neutrophils stimulated by LTB4, when pre-treated with TSPO ligands shown a reduced L-selectina cleavage, chemotaxis reduction and induction of ROS generation. Based on these data and in literature data, we concluded that the effects of TSPO ligands in neutrophilic functions is concentrated on adhesion molecules expression, on oxidative stress and on the migration. These effects depend to the activation pathways and to the cellular type.

Acidentes escorpiônicos podem evoluir com edema pulmonar de origem cardiogênica e não cardiogênica. O clearance de edema pulmonar está relacionado principalmente ao transporte ativo de sódio do espaço alveolar para o interstício. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do veneno de Tityus serrulatus e da dexametasona sobre a expressão dos transportadores de sódio e água e do TLR4 em pulmão de ratos. Foram utilizados ratos Wistar, divididos em três grupos: controle (salina); grupo Vn, que recebeu o veneno de T. serrulatus (3.8 mg/kg) por via intraperitoneal (ip), e o grupo Dx+Vn, que recebeu dexametasona (2.0 mg/kg) por via ip, uma hora antes da injeção do veneno. Os experimentos foram realizados uma hora após a injeção do veneno. Foram realizadas análise bioquímica e dosagens de citocinas no plasma. Nos pulmões foram estudados a expressão de -ENaC, Na+-K+- ATPase, NKCC1, AQP-5 e TRL4 através de western blotting, e a expressão do NF-kB e infiltração de células CD68+ (monócitos/macrófagos) e neutrófilos, através de imunoistoquímica. O veneno de T. serrulatus diminuiu a expressão pulmonar de -ENaC e AQP-5, enquanto aumentou a expressão do NKCC1. A dexametasona preveniu os efeitos do veneno sobre a expressão da -ENaC e NKCC1, mas não da AQP5. Não foi observada alteração da expressão da 1- Na+-K+-ATPase . A expressão do TLR4 foi maior nos animais envenenados que nos grupos Cont e Dx+Vn. O níveis plasmáticos de IL-6, IL-10 e TNF- estavam aumentados nos grupo Vn e Dx+Vn em relação ao controle. O infiltrado de células CD68+ foi maior no grupo Vn. A expressão de NF-kB e o infiltrado ne neutrófilos no tecido pulmonar foi semelhantes nos três grupos avaliados. Os resultados encontrados sugerem que o veneno de T. serrulatus tem efeito sobre as proteínas transportadoras de sódio em células do epitélio alveolar e também sobre a expressão do TLR4 em pulmão; a dexametasona pode regular essas ações / Scorpion envenomation can cause cardiogenic and noncardiogenic pulmonary edema. Pulmonary edema clearance is largely related to active Na+ transport out of the alveoli, rather than to reversal of Starling forces. Our objective was determine the effects of Tityus serrulatus venom and dexamethasone on the pulmonary expression of sodium and water transporters, and Toll-like receptor 4. Wistar rats were divided into groups and injected intraperitoneally: control (saline only); venom (T. serrulatus venom3.8 mg/kg body weight); and dexamethasone+venom (dexamethasone2.0 mg/kg body weight60 min before venom inoculation). At 60 min after venom inoculation, interleukin-6 and -10, together with tumor necrosis factor alpha, were analyzed in plasma. In lungs, we determined expression of the epithelial sodium channel alpha subunit; Na,K-ATPase alpha 1 subunit; Na-K-2Cl cotransporter, NKCC1; aquaporin 5; Toll-like receptor 4 (by Western blotting); and nuclear factor-kappa B. We determined CD68 and neutrophil counts by immunohistochemistry. In venom group lungs, the epithelial sodium channel alpha subunit and aquaporin 5 were markedly downregulated, whereas NKCC1 was elevated, although the Na,K-ATPase alpha 1 subunit was unaffected. Dexamethasone protected the epithelial sodium channel alpha subunit, NKCC1, and Toll-like receptor 4 but not aquaporin 5. Serum interleukin 6, interleukin 10, and tumor necrosis factor alpha were elevated in both groups, as was CD68 expression. Neutrophil counts and nuclear factor-kappa B expression were comparable across groups. Our data show that T. serrulatus venom alters sodium transport in alveolar epithelial cells and increases Toll-like receptor 4 expression. Dexamethasone appears to partially protect against those effects

Orientador: Juliana Regina Peiró / Coorientador: Sérgio Ribeiro Aoki / Banca:Lina Maria Wehrle Gomide / Banca: Flávia Lombardi Lopes / Banca:José Paes de Oliveira Filho / Banca:Glenda Nicioli da Silva / Resumo: A resposta imune inata é a principal responsável pela defesa do hospedeiro contra endotoxinas de bactérias Gram-negativas. Tal resposta se dá através dos receptores Toll-like-4 e -2, seja pela via MyD88-dependente, TRIF-dependente ou ambas. Entretanto, uma resposta exagerada pode resultar em muitos danos para o organismo e levar até mesmo ao choque séptico. Uma das formas de controle desta resposta se dá através da tolerância à endotoxina (TE). Por isso o presentes estudo tem por objetivo investigar a indução diferencial dos receptores TLR-4 e 2, suas vias de sinalização MyD88 e TRIF-dependentes e avaliar outros possíveis genes relacionados a estas vias após indução da TE. Foi coletado sangue total de cavalos saudáveis (n=6), o qual foram estimulados com diferentes doses (0, 1 ou 10ng de LSP/mL) LPS de E.coli no momento 0 e 4 horas após o primeiro estímulo e 4 horas após o segundo estímulo. O "pool" (n=6) de RNA das amostras, coletado 0, 2, 4 e 8 horas, foi utilizado para a transcrição do cDNA. A hibridização do cDNA marcado com Cy-3 foi realizada em uma lâmina 4x44 contendo sequências específicas da espécie equina. Foi identificado durante a TE, nas diferentes doses de LPS, um aumento de transcritos dos receptores TLR-4 e -2, TNFAIP3 e IL-10 e uma diminuição de outros transcritos de genes importantes, tais como: MyD88, IL1-B, TNF-a, TRAM2, o que caracteriza e esclarece, de certa forma, as alterações na sinalização do TLR nas condições de tolerância à endotoxina. / Abstract: The innate immune response is the main responsible for the host's defense against endotoxins from Gram-negative bacteria. Such response occurs via Toll-like-4 and -2 receptors, MyD88-dependent pathway, TRIF-dependent pathway or both. However, an exaggerated reponse can induce many damages to the organism, including septic shock. One way to control this exacerbated response is through endotoxin tolerance (ET). The goals of the present study were to investigate TLR-4 and 2 receptors, their signaling through MyD88 e TRIF-dependent pathways and evaluate other possible genes related to this ways after ET induction. Blood samples were collected from healthy horses (n=6) which were stimulated with different doses (0, 1 or 10ng of LSP/mL) of LPS from E.coli, for 0 and 4 hours after the first stimulus and 4 hours after second stimulus. The pool (n=6) of RNA, extracted from the samples collected at 0, 2, 4 e 8 hours, was used for the transcription of the cDNA. The hybridization of the cDNA marked with Cy-3 was done in one slide 4x44 containing specific sequences from the equine species. We identified during the ET, on the different doses of LPS, an increase of transcripts for the receptors TLR-4 and -2, TNFAIP3 and Il-10 and a reduction of transcripts of other important genes, such as: MyD88, IL1-B, TNF-a, TRAM2, what characterizes and enlightens the changes in TLR signaling during endotoxin tolerance. / Doutor

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The aim of this study was to evaluate the PAF regulatory activity on TLR2-induced TNF production. Thus, Mycoplasma fermentans PG 18 lipoproteins (LAMPf), TLR2/TLR6 agonists and Pam3Cys, a synthetic lipopeptide agonist of TLR2/TLR1 were added to human whole blood cultures and TNF was evaluated by enzyme-linked immunosorbent assay. To evaluate the effects of endogenous PAF on TNF production, a PAF receptor antagonist, WEB2170 was used, and to evaluate the effect of exogenous PAF, PAF was added to the cultures. The blood cultures were also activated with Gram-positive or negative heat-killed bacteria (Staphylococcus aureus or Escherichia coli). The TLR2 expression on polymorphonuclear (PMN) and monocytes were evaluated by flow cytometry, analyzing total cellularity for PMN and CD14+ cells for monocytes. LAMPf, Pam3Cys or LPS induced TNF and the treatment with WEB2170 increased TNF production after TLR2 activation, but not after TLR4 activation. Priming of the blood cultures with PAF up regulated TLR2- induced TNF production. Addition of PAF did not alter TNF release induced by LPS. E. coli induced higher levels of TNF than S. aureus and the treatment with WEB2170 lead to a significant reduction of S. aureus-induced TNF release. However, addition of PAF did not significantly alter bacteria-induced TNF production. With E. coli neither treatment with WEB2170 nor with PAF modulated TNF release. Results indicate that PAF can increase or decrease TNF production induced by TLR2 depending on the time when PAF is combined with TLR2. The increase of the TNF production after extended priming with PAF it was not caused by an increase in TLR2 expression. Thus, it is suggested that interaction between PAFR and TLR2 signaling determines the levels of TNF release. TLR2/PAF/TNF signaling pathway can be relevant in innate immune responses against Gram positive bacteria as well as in inflammatory diseases. / Os microrganismos expressam moléculas conservadas que ativam as células do sistema imune inato. Estas são conhecidas como padrões moleculares associados aos patógenos (PAMPs), tais como o lipopolissacarídeo (LPS) e as lipoproteínas bacterianas. Estes PAMPs são reconhecidos por receptores da família dos Toll-like receptors (TLR). A ativação das células da imunidade natural via TLR induz a produção de citocinas e mediadores lipídicos pro-inflamatórios dentre eles, o fator de necrose tumoral (TNF) e o fator ativador de plaquetas (PAF), respectivamente. A modulação da produção de TNF induzida por agonista de TLR4 (o LPS), pelo PAF, é conhecida, no entanto, a interação entre PAF e outros TLR foi pouco investigada. O presente trabalho teve o objetivo de avaliar a atividade moduladora do PAF na produção de TNF induzida por agonistas de TLR2. Para isto, foram utilizados as lipoproteínas de Mycoplasma fermentans PG 18 (LAMPf), agonistas de TLR2/TLR6 e o Pam3Cys, um lipopeptídeo sintético agonista de TLR2/TLR1. Culturas de sangue total periférico humano foram ativadas com os agonistas de TLR2 ou TLR4 e o TNF foi avaliado nos sobrenadantes, por meio do ELISA. Para avaliar os efeitos do PAF endógeno na produção do TNF, foi utilizado o antagonista do receptor do PAF (PAFR), o WEB2170, e para avaliar o efeito do PAF exógeno, o PAF foi adicionado às hemoculturas. As hemoculturas também foram ativadas com bactérias inteiras (S. aureus ou E. coli) inativadas pelo calor. A expressão de TLR2 em polimorfonucleares (PMN) e monócitos foi avaliada por citometria de fluxo, analisando a celularidade total para os PMN e as células CD14+, para os monócitos. As LAMPf, Pam3Cys ou LPS induziram TNF nas hemoculturas. O tratamento com WEB2170 aumentou a produção de TNF nas hemoculturas estimuladas com agonistas de TLR2, mas não de TLR4. A pré-estimulação das hemoculturas com o PAF aumentou a produção de TNF induzida pelos agonistas de TLR2. A adição de PAF não causou alterações significantes na produção de TNF induzida pelo LPS. Nos ensaios com as bactérias inteiras, E. coli induziu maiores concentrações de TNF do que S. aureus. O tratamento com WEB2170 das hemoculturas estimuladas com S. aureus reduziu a produção de TNF, no entanto, a adição de PAF não alterou significantemente a produção de TNF nas hemoculturas estimuladas com as bactérias. Para E. coli, nem o tratamento com WEB2170, nem com o PAF alterou significantemente a produção de TNF. Os resultados indicam que o PAF pode aumentar ou diminuir a produção de TNF induzida por agonista de TLR2, dependendo do momento em que ele ativa o PAFR em relação à ativação do TLR2. O aumento da produção de TNF após prolongada pré-ativação das hemoculturas com o PAF não foi devido a um aumento na expressão de TLR2. Assim, é sugerido que a interação entre as vias bioquímicas de sinalização do PAFR e do TLR2 determina o nível de produção de TNF. A via de sinalização TLR2/PAF/TNF pode ser importante na imunidade inata contra infecções causadas por bactérias Gram positivas tão bem quanto em doenças inflamatórias.

Orientadores: Raquel Franco Leal, Maria Lourdes Setsuko Ayrizono / Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-20T16:08:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paiva_NielceMariade_M.pdf: 3729371 bytes, checksum: 4077b1681124ea203fae5904b5fd8254 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A retocolectomia total com anastomose do reservatório ileal (RI) ao canal anal é a cirurgia de escolha para doentes com retocolite ulcerativa inespecífica (RCUI) refratária ao tratamento clínico e para a polipose adenomatosa familiar (PAF). Entretanto, a ileíte primária do reservatório é uma das complicações mais comuns após a cirurgia do RI em pacientes com RCUI, sendo rara na PAF; e somente ocorre após o fechamento da ileostomia de proteção. Neste sentido, há necessidade de estudos que avaliem a forma como as bactérias, por meio de receptores específicos, possam participar no processo inflamatório do RI. Desta forma, foi analisada a expressão dos Toll-like receptors (TLR) em mucosa do RI endoscópica e histologicamente normal em pacientes operados por RCUI e PAF, a fim de se detectar alguma anormalidade nesta via em indivíduos assintomáticos, que poderia contribuir com processo inflamatório no RI. Casuística e Método: Doze pacientes (seis com RCUI e seis com PAF) submetidos à retocolectomia total e confecção do RI em "J", foram estudados após a reconstrução do trânsito intestinal. Foram obtidas biópsias da mucosa do RI por meio de endoscopia do mesmo. O grupo controle foi constituído por seis doentes com íleo-colonoscopia normal. As biópsias foram congeladas em nitrogênio líquido e as expressões de TLR-2, TLR-4 (receptores de reconhecimento de antígenos bacterianos) e p- JNK (fator de sinalização nuclear) foram avaliadas por meio de imunoblot de extrato protéico total. A ausência de ileíte do RI foi determinada por parâmetros clínicos, histológicos e endoscópicos, de acordo com o Índice de Atividade da Ileíte do RI (PDAI). Os pacientes não estavam em uso de medicações. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Local e os participantes assinaram o termo de consentimento informado. Utilizou-se análise de variância (ANOVA), seguida por análise de significância (Teste de Tukey-Kramer) para a análise estatística. Nível de significância adotado foi p<0,05. Resultados: Houve maior expressão de TLR-4 em mucosa de RI de doentes operados por RCUI, quando comparada aos grupos Controle e PAF (p<0,05). Não houve diferença estatística das expressões de TLR-2 e p-JNK entre os diferentes grupos (p>0.05). Conclusão: Pacientes com RCUI apresentaram maior expressão de TLR4 na mucosa do RI, mesmo sem evidência clínica, endoscópica e histológica de inflamação no RI. Estes achados podem explicar a tendência de ativação de vias intracelulares deflagradas por antígenos bacterianos em pacientes com RCUI, o que pode contribuir com a produção de mediadores pró-inflamatórios, sendo coadjuvante do processo inflamatório inicial na mucosa do RI / Abstract: Introduction: Ileal pouch-anal anastomosis (IPAA) is the preferred surgical procedure for patients with refractory ulcerative colitis (UC) and familial adenomatous polyposis (FAP). However, pouchitis is the most common complication after ileal pouch-anal anastomosis (IPAA) in UC patients, being rare in FAP; and only occurs after ileostomy closure. Therefore, it is important to get more information about the role of the ileal pouch microbiota and mucosa susceptibility to inflammation. Therefore, we evaluated Toll-like receptors (TLRs) expression in normal endoscopic and histological mucosa of the ileal pouch in patients with UC and FAP, in order to find any abnormality in this pathway in asymptomatic patients, which may contribute to pouchitis. Patients and Method: Twelve patients (six with UC and six with FAP) who underwent to total rectocolectomy and "J" pouch reconstruction, were studied. Biopsies were obtained from the mucosa of the pouch by endoscopy. Normal ileum biopsies were obtained from six patients submitted to ileocolonoscopy with no abnormalities. The specimens were snap-frozen and the expressions of TLR2, TLR4 (bacterial recognition receptors) and JNK (nuclear signalization factor) were determined by immunoblot protein extract. The absence of pouchitis was assessed by clinical, histological and endoscopic parameters, according to the Pouchitis Disease Activity Index (PDAI). The patients were not under any medication. The committee approved the study and informed consent was signed by all participants. The ANOVA and Tukey-Kramer Tests were applied for statistical analysis. The level of significance was p<0.05. Results: Patients with UC had significantly higher protein levels of TLR4 than controls and FAP (p<0.05). The expressions of TLR2 and JNK were similar in the groups (p>0.05). Conclusion: Patients with UC had higher levels of TLR4, even in the absence of clinical, endoscopic and histological pouchitis. These findings may explain a tendency towards the up-regulation of intracellular pathways activated by bacterial antigens in UC patients, which could contribute to the production of proinflammatory mediators, being coadjuvant of the inflammatory process in the ileal pouch mucosa / Mestrado / Fisiopatologia Cirúrgica / Mestre em Ciências