Venoms of the Sicariidae spider family contain phospholipase D (PLD) enzyme toxins that can cause severe dermonecrosis and even death in humans. PLD toxins are known to cleave the substrates sphingomyelin (SM) and lysophosphatidylcholine (LPC) in mammalian tissues, releasing a choline headgroup and a reported monoester phospholipid formed via a hydrolytic reaction. However, some PLD toxins have demonstrated the ability to utilize substrates besides SM and LPC and other PLD toxins have demonstrated no activity against either SM or LPC. Given that the etiology of the disease state following envenomation is not well understood, we postulated that PLD toxins could be utilizing other phospholipid substrates in vivo. To determine the level of promiscuity among the PLD toxins, we developed a novel ³¹P-NMR assay to measure phospholipase activity against a panel of potential phospholipid substrates. While developing the assay, we made the surprising discovery that recombinant PLD toxins, as well as whole venoms from diverse Sicariidae species, exclusively generates cyclic phosphate rather than hydrolytic products. We also found that a distantly related PLD toxin from a pathogenic bacterium, with low sequence identity to the spider PLDs, exclusively generates cyclic phosphate products. We then established that St_βIB1i, a PLD with extremely diminished activity toward SM and LPC, actually demonstrates large preferential specificity towards ethanolamine phospholipid substrates. We solved the crystal structure of St_βIB1i to compare to PLD toxins of known structure, toward an understanding of the molecular basis of substrate specificity. The cyclic phosphate products generated by the PLD toxins have extremely different biochemical properties than their monoester counterparts and may be relevant to the pathology following envenomation or bacterial infection. In addition the specificity St_βIB1i has for ethanolamine substrates may have biological implications, as insects have high concentrations of ethanolamine-containing phospholipids.

Muitas interações entre organismos são mediadas pela liberação de substâncias biologicamente ativas. Nos Cnidários esse tipo de interação é ainda mais marcante devido a organelas características do grupo, denominadas nematocistos. Usados tanto na captura de alimento quanto para defesa do organismo, os nematocistos contêm toxinas com ações que variam de moderadas até potencialmente fatais em humanos, o que torna importante o estudo desse grupo sob ponto de vista toxinológico. As classes Anthozoa, Cubozoa e Scyphozoa têm sido extensivamente estudas sob esse ponto de vista durante décadas, porém a classe Hydrozoa, embora não menos importante, ainda carece de estudos. Os poucos trabalhos realizados com membros desse grupo se restringem a algumas espécies de hidras, caravelas (Physalia) e hidrocorais (Millepora). A espécie Macrorhynchia philippina é composta por hidróides coloniais bentônicos que podem ser encontrados ao longo de todo o Canal de São Sebastião-SP. Ela é responsável por diversos acidentes com banhistas e mergulhadores que esbarram em suas colônias, desencadeando uma sensação de dor bastante forte, aguda e localizada que persiste por alguns segundos. Contudo, este contato não leva a lesões graves ou inflamação local como as peçonhas de membros das demais classes. Embora sejam organismos comuns e farmacologicamente interessantes, não existe nenhum estudo do ponto de vista toxinológico com esta espécie. Assim, nesse trabalho, investigamos os hidróides da espécie M.philippina, além de caracterizar as toxinas obtidas de seus nematocistos. Para essa análise utilizamos dois métodos de obtenção de peçonha: a homogeneização, que consiste na maceração de fragmentos da colônia (extrato total), e a estimulação elétrica, da qual se obtém a peçonha diretamente dos nematocistos (peçonha bruta). Esses dois métodos foram submetidos a três testes farmacológicos na tentativa de se evidenciar a presença de toxinas como, citolisinas, neurotoxinas e citotoxinas. A comparação entre os dois métodos mostrou uma paradoxal diferença. Apenas o extrato total provocou efeitos positivos nos testes indicando a perda de atividade ou mesmo a ausência de toxinas que provoquem esses efeitos na peçonha bruta. A observação desses dados, somados aos relatos de dor registrados pelo contado dessa espécie com seres humanos, nos levou a submeter a peçonha bruta a mais três testes, que evidenciariam desta vez a existência de toxinas envolvidas em processos de inflamação e indução de dor. Os resultados obtidos em todos os testes sugerem a existência de uma toxina de origem não nematocística responsável pelos efeitos citolíticos e neurotóxicos observados. Assim como a existência de toxinas presentes nos nematocistos envolvidas em processos de inflamação e indução de dor. / Many interactions between animals are made by the release of bioactive substances. In Cnidarian, these interactions are greatly expressed by characteristic organelles of this group named nematocysts. Using it for prey capture or defense against predators, the nematocysts have a toxic cocktail with actions that can be moderate or potentially fatal to humans. This fact makes the studies involving these animals a very important subject. The Classes Anthozoa, Cubozoa e Scyphozoa have been studied, under this point of view, for decades. However, the Hydrozoa class, even though no less important, still need a similar approach. The few works that had been made with the members of this group include only a limited number of species of hydra, Man-of-War (Physalia) and firecorals (Millepora). The species Macrorhynchia philippina are composed by bentonic colonial hydroids. They are found along the entire São Sebastião-SP channel, being responsible for injuries to divers and bathers that entry in contact with their colony. The pain evoked from its contact is very strong, acute and pointed, that lasts for a few seconds. Nevertheless, its contact does not lead to serious injury or local inflammatory edemas like those produced by animals belonging to other classes. Even though being a species of pharmacological interest, there is no toxinological study made with these animals. In this work, we investigated the hydroids from M. philippina species trying to characterize the effects of the venom obtained from its nematocysts. In order to perform this task two methods of extraction had been used: the homogenization, that consists in the maceration of fragments of the colony (total extract), and the electrical stimulation, from which we can obtain the venom produced directly by the nematocists (crude venom). These two methods were performed using three pharmacological tests in order to try to prove the existence of toxins like, cytolysins, neurotoxins and cytotoxins. The comparison between the two methods shows a paradoxal difference. Only the total extract evoked positive effects, showing a loss of activity or even the absence of the toxins that evoke these effects in crude venom. These observation, in addition with the reports of acute pain due to the contact with this specie in humans, lead us to submit the crude venom to three more new tests, that would expose the existence of toxins that are involved in pain and inflammatory mechanisms. Our results suggest the existence of a toxin from non-nematocysts tissues, responsible for the cytolytic and neurotoxic effects observed, and a toxin in nematocysts that act in inflammatory mechanism and pain induced processes.

Muitas interações entre organismos são mediadas pela liberação de substâncias biologicamente ativas. Nos Cnidários esse tipo de interação é ainda mais marcante devido a organelas características do grupo, denominadas nematocistos. Usados tanto na captura de alimento quanto para defesa do organismo, os nematocistos contêm toxinas com ações que variam de moderadas até potencialmente fatais em humanos, o que torna importante o estudo desse grupo sob ponto de vista toxinológico. As classes Anthozoa, Cubozoa e Scyphozoa têm sido extensivamente estudas sob esse ponto de vista durante décadas, porém a classe Hydrozoa, embora não menos importante, ainda carece de estudos. Os poucos trabalhos realizados com membros desse grupo se restringem a algumas espécies de hidras, caravelas (Physalia) e hidrocorais (Millepora). A espécie Macrorhynchia philippina é composta por hidróides coloniais bentônicos que podem ser encontrados ao longo de todo o Canal de São Sebastião-SP. Ela é responsável por diversos acidentes com banhistas e mergulhadores que esbarram em suas colônias, desencadeando uma sensação de dor bastante forte, aguda e localizada que persiste por alguns segundos. Contudo, este contato não leva a lesões graves ou inflamação local como as peçonhas de membros das demais classes. Embora sejam organismos comuns e farmacologicamente interessantes, não existe nenhum estudo do ponto de vista toxinológico com esta espécie. Assim, nesse trabalho, investigamos os hidróides da espécie M.philippina, além de caracterizar as toxinas obtidas de seus nematocistos. Para essa análise utilizamos dois métodos de obtenção de peçonha: a homogeneização, que consiste na maceração de fragmentos da colônia (extrato total), e a estimulação elétrica, da qual se obtém a peçonha diretamente dos nematocistos (peçonha bruta). Esses dois métodos foram submetidos a três testes farmacológicos na tentativa de se evidenciar a presença de toxinas como, citolisinas, neurotoxinas e citotoxinas. A comparação entre os dois métodos mostrou uma paradoxal diferença. Apenas o extrato total provocou efeitos positivos nos testes indicando a perda de atividade ou mesmo a ausência de toxinas que provoquem esses efeitos na peçonha bruta. A observação desses dados, somados aos relatos de dor registrados pelo contado dessa espécie com seres humanos, nos levou a submeter a peçonha bruta a mais três testes, que evidenciariam desta vez a existência de toxinas envolvidas em processos de inflamação e indução de dor. Os resultados obtidos em todos os testes sugerem a existência de uma toxina de origem não nematocística responsável pelos efeitos citolíticos e neurotóxicos observados. Assim como a existência de toxinas presentes nos nematocistos envolvidas em processos de inflamação e indução de dor. / Many interactions between animals are made by the release of bioactive substances. In Cnidarian, these interactions are greatly expressed by characteristic organelles of this group named nematocysts. Using it for prey capture or defense against predators, the nematocysts have a toxic cocktail with actions that can be moderate or potentially fatal to humans. This fact makes the studies involving these animals a very important subject. The Classes Anthozoa, Cubozoa e Scyphozoa have been studied, under this point of view, for decades. However, the Hydrozoa class, even though no less important, still need a similar approach. The few works that had been made with the members of this group include only a limited number of species of hydra, Man-of-War (Physalia) and firecorals (Millepora). The species Macrorhynchia philippina are composed by bentonic colonial hydroids. They are found along the entire São Sebastião-SP channel, being responsible for injuries to divers and bathers that entry in contact with their colony. The pain evoked from its contact is very strong, acute and pointed, that lasts for a few seconds. Nevertheless, its contact does not lead to serious injury or local inflammatory edemas like those produced by animals belonging to other classes. Even though being a species of pharmacological interest, there is no toxinological study made with these animals. In this work, we investigated the hydroids from M. philippina species trying to characterize the effects of the venom obtained from its nematocysts. In order to perform this task two methods of extraction had been used: the homogenization, that consists in the maceration of fragments of the colony (total extract), and the electrical stimulation, from which we can obtain the venom produced directly by the nematocists (crude venom). These two methods were performed using three pharmacological tests in order to try to prove the existence of toxins like, cytolysins, neurotoxins and cytotoxins. The comparison between the two methods shows a paradoxal difference. Only the total extract evoked positive effects, showing a loss of activity or even the absence of the toxins that evoke these effects in crude venom. These observation, in addition with the reports of acute pain due to the contact with this specie in humans, lead us to submit the crude venom to three more new tests, that would expose the existence of toxins that are involved in pain and inflammatory mechanisms. Our results suggest the existence of a toxin from non-nematocysts tissues, responsible for the cytolytic and neurotoxic effects observed, and a toxin in nematocysts that act in inflammatory mechanism and pain induced processes.

De uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno da cobra coral brasileira Micrurus corallinus foi isolada uma seqüência denominada NXH8. Esta seqüência de cDNA apresenta similaridade estrutural com a família de toxinas de serpentes em 'três dígitos' ricas em pontes dissulfeto. A subclasse melhor conhecida nesta família, são as alfa neurotoxinas. Uma outra seqüência distinta, denominada NXH1 e suas isoformas NXH3 e NXH7, foram isoladas anteriormente. Pertencem à mesma família de toxinas e estão presentes na mesma biblioteca. Alguns resultados da caracterização de NXH1, são utilizados neste estudo, em comparação com NXH8. Algumas características estruturais tornam a seqüência NXH8 diferente da classe usual das alfa neurotoxinas, vindo a constituir possivelmente uma nova subclasse da família. A proteína NXH8 foi expressa em diversos vetores de expressão em Escherichia coli. A proteína recombinante, expressa pelo vetor pRSET C - NXH8 foi utilizada para imunizar camundongos. O soro contra NXH8, assim como o soro anti - elapídico do Instituto Butantan, reconhece a toxina recombinante em ELISA e Western blot. O soro anti - NXH8 detecta apenas uma banda do veneno de M. corallinus em Western blot, mas apresenta reatividade cruzada com componentes do veneno de alguns elapídeos neotropicais e do velho mundo. Em contraste, dados anteriores demonstraram que o soro anti - NXH1 é específico para um componente único do veneno de M. corallinus. O veneno de M. corallinus tem alfa neurotoxinas que bloqueiam o receptor pós - sináptico nicotínico de acetilcolina nas membranas do músculo esquelético de ratos. O soro anti - NXH8 é capaz de impedir a ligação de componentes do veneno bruto a esses receptores. Já o soro contra NXH1 não apresenta a mesma capacidade inibitória. Isto indica que NXH8 tem afinidade pelo receptor nicotínico muscular de acetilcolina, ou que NXH8 compartilha de um epítopo neutralizante presente também nas alfa neurotoxinas do veneno da cobra coral M. corallinus. / A cDNA sequence encoding a putative new toxin, NXH8, was isolated from the cDNA library constructed from the venom gland of the Brazilian coral snake, Micrurus corallinus. This sequence shows a structural similarity with the snake toxin family known as 'three-fingered' toxins, a family of toxins with approximately 60 to 70 amino acids and usually 4 to 5 disulfide bonds. Irrespective of whether these proteins are functionally different, their amino acid sequences can be readily aligned, using 8 half-cystines as conserved elements, suggesting the presence of common structural features. The best known subclass of three-finger-type toxins are the curaremimetic toxins, also called alpha-neurotoxins, found in most venoms from Elapid and Sea snakes. Another toxin with a distinct sequence, known as NXH1 and its isoforms NXH3 and NXH7 had been previously isolated. They belong to the same family of toxins and were characterized from the same cDNA library. In the present study, a comparative biochemical, pharmacological and structural analyses of NXH1 and NXH8 were described. Few structural characteristics of NXH8 seem to indicate that it differs from the usual class of alpha – neurotoxins, belonging, possibly, to a new subclass of 'three-finger' toxins. The NXH8 protein was expressed in various E. coli expression vectors and the resulted recombinant toxin from pRSETC-NXH8 plasmid was used as a "toxoid" for mice immunization. The anti - NXH8 sera, as well as the anti – elapid sera from the Butantan Institute, recognized the recombinant toxin by both ELISA and Western blot assays. In contrast to the claim that anti - NXH1 sera is specific to one component of M. corallinus’s venom, the anti – NXH8 sera show cross reactivity to venom of some Neotropical and Old World elapids. The M. corallinus's venom contains alpha – toxins, which inhibit post-synaptic nicotinic acetylcholine receptor of neonatal rat skeletal muscle membrane. The anti - NXH8 serum was capable of blocking the binding of the components of the crude venom to these receptors. In contrast, the anti – NXH1 serum did not show this inhibitory effect. This indicates that either NXH8 presents affinity for muscular nicotinic acetylcholine receptor or it shares a neutralizing epitope also present in M. corallinus’s alpha – neurotoxins.

De uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno da cobra coral brasileira Micrurus corallinus foi isolada uma seqüência denominada NXH8. Esta seqüência de cDNA apresenta similaridade estrutural com a família de toxinas de serpentes em 'três dígitos' ricas em pontes dissulfeto. A subclasse melhor conhecida nesta família, são as alfa neurotoxinas. Uma outra seqüência distinta, denominada NXH1 e suas isoformas NXH3 e NXH7, foram isoladas anteriormente. Pertencem à mesma família de toxinas e estão presentes na mesma biblioteca. Alguns resultados da caracterização de NXH1, são utilizados neste estudo, em comparação com NXH8. Algumas características estruturais tornam a seqüência NXH8 diferente da classe usual das alfa neurotoxinas, vindo a constituir possivelmente uma nova subclasse da família. A proteína NXH8 foi expressa em diversos vetores de expressão em Escherichia coli. A proteína recombinante, expressa pelo vetor pRSET C - NXH8 foi utilizada para imunizar camundongos. O soro contra NXH8, assim como o soro anti - elapídico do Instituto Butantan, reconhece a toxina recombinante em ELISA e Western blot. O soro anti - NXH8 detecta apenas uma banda do veneno de M. corallinus em Western blot, mas apresenta reatividade cruzada com componentes do veneno de alguns elapídeos neotropicais e do velho mundo. Em contraste, dados anteriores demonstraram que o soro anti - NXH1 é específico para um componente único do veneno de M. corallinus. O veneno de M. corallinus tem alfa neurotoxinas que bloqueiam o receptor pós - sináptico nicotínico de acetilcolina nas membranas do músculo esquelético de ratos. O soro anti - NXH8 é capaz de impedir a ligação de componentes do veneno bruto a esses receptores. Já o soro contra NXH1 não apresenta a mesma capacidade inibitória. Isto indica que NXH8 tem afinidade pelo receptor nicotínico muscular de acetilcolina, ou que NXH8 compartilha de um epítopo neutralizante presente também nas alfa neurotoxinas do veneno da cobra coral M. corallinus. / A cDNA sequence encoding a putative new toxin, NXH8, was isolated from the cDNA library constructed from the venom gland of the Brazilian coral snake, Micrurus corallinus. This sequence shows a structural similarity with the snake toxin family known as 'three-fingered' toxins, a family of toxins with approximately 60 to 70 amino acids and usually 4 to 5 disulfide bonds. Irrespective of whether these proteins are functionally different, their amino acid sequences can be readily aligned, using 8 half-cystines as conserved elements, suggesting the presence of common structural features. The best known subclass of three-finger-type toxins are the curaremimetic toxins, also called alpha-neurotoxins, found in most venoms from Elapid and Sea snakes. Another toxin with a distinct sequence, known as NXH1 and its isoforms NXH3 and NXH7 had been previously isolated. They belong to the same family of toxins and were characterized from the same cDNA library. In the present study, a comparative biochemical, pharmacological and structural analyses of NXH1 and NXH8 were described. Few structural characteristics of NXH8 seem to indicate that it differs from the usual class of alpha – neurotoxins, belonging, possibly, to a new subclass of 'three-finger' toxins. The NXH8 protein was expressed in various E. coli expression vectors and the resulted recombinant toxin from pRSETC-NXH8 plasmid was used as a "toxoid" for mice immunization. The anti - NXH8 sera, as well as the anti – elapid sera from the Butantan Institute, recognized the recombinant toxin by both ELISA and Western blot assays. In contrast to the claim that anti - NXH1 sera is specific to one component of M. corallinus’s venom, the anti – NXH8 sera show cross reactivity to venom of some Neotropical and Old World elapids. The M. corallinus's venom contains alpha – toxins, which inhibit post-synaptic nicotinic acetylcholine receptor of neonatal rat skeletal muscle membrane. The anti - NXH8 serum was capable of blocking the binding of the components of the crude venom to these receptors. In contrast, the anti – NXH1 serum did not show this inhibitory effect. This indicates that either NXH8 presents affinity for muscular nicotinic acetylcholine receptor or it shares a neutralizing epitope also present in M. corallinus’s alpha – neurotoxins.