Produtos naturais derivados de planta têm contribuído enormemente para o desenvolvimento de drogas terapêuticas. Poligodial e drimanial são sesquiterpenos isolados da casca de Drymis winteri (Winteraceae), que apresenta propriedades antinociceptivas. O glutamato periférico possui ações nociceptivas; assim, neste estudo investigamos os efeitos destes compostos em vários parâmetros do sistema glutamatérgico de cérebro de ratos e camundongos. O poligodial, in vitro, inibiu significativamente a união do glutamato aos seus receptores, a captação de glutamato em céluas de astrocitos, assim como a captação de glutamato por fatias de córtex, hipocampo e estriado de cérebro de ratos, e estimulou a liberação de glutamato em preparações de sinaptossomas.O drimanial, in vitro, inibiu significativamente a união do glutamato aos seus receptores, a captação de glutamato em células de astrocitos e em preparações de vesículas sinápticas, assim como a captação de glutamato por fatias de córtex, hipocampo e estriado de cérebro de ratos, e estimulou a liberação de glutamato em preparações de sinaptossomas. Quando efetuamos experimentos, in vivo, em camundongos injetados i.p., observamos que a captação de glutamato por fatias de hipocampo e estriado foi inibida por ambos (poligodial e drimanial) enquanto em fatias de córtex não tiveram efeito. Estes resultados demonstram que há uma possibilidade destes dois compostos aumentarem as concentrações extracelulares de glutamato, apontando para um possível efeito neurotóxico, o que sugere cautela com suas utilizações terapêuticas. / Natural products including those derived from plants, have over the years greatly contributed to the development of therapeutic drugs. Polygodial and drimanial are sesquiterpenes isolated from the bark of the plant Drymis Winteri (Winteraceae) that exhibit antinociceptive properties. Since peripheral glutamate presents nociceptive actions, in this study it was investigated the effects of these compounds on the glutamatergic system in rat brain and mice. Polygodial in vitro inhibited glutamate binding, glutamate uptake by astrocytes, as well as by cortical, hippocampal and striatal slices, and increased synaptosomal glutamate release. The drimanial in vitro inhibited glutamate binding, glutamate uptake by astrocytes, synaptic vesicles, as well as by cortical, hippocampal and striatal slices, and increased synaptosomal glutamate release.When injected intraperitoneally in adult male mice, we observed that both polygodial and drimanial inhibited the glutamate uptake in slices from hippocampus and striatum, and did not affects glutamate uptake by cortical slices. These concurrent effects would predispose to an increase in the extracellular glutamate concentrations, leading to possible neurotoxic effects (excitotoxicity) of these natural compounds, which would suggest the need for some caution in their therapeutic application.

Produtos naturais derivados de planta têm contribuído enormemente para o desenvolvimento de drogas terapêuticas. Poligodial e drimanial são sesquiterpenos isolados da casca de Drymis winteri (Winteraceae), que apresenta propriedades antinociceptivas. O glutamato periférico possui ações nociceptivas; assim, neste estudo investigamos os efeitos destes compostos em vários parâmetros do sistema glutamatérgico de cérebro de ratos e camundongos. O poligodial, in vitro, inibiu significativamente a união do glutamato aos seus receptores, a captação de glutamato em céluas de astrocitos, assim como a captação de glutamato por fatias de córtex, hipocampo e estriado de cérebro de ratos, e estimulou a liberação de glutamato em preparações de sinaptossomas.O drimanial, in vitro, inibiu significativamente a união do glutamato aos seus receptores, a captação de glutamato em células de astrocitos e em preparações de vesículas sinápticas, assim como a captação de glutamato por fatias de córtex, hipocampo e estriado de cérebro de ratos, e estimulou a liberação de glutamato em preparações de sinaptossomas. Quando efetuamos experimentos, in vivo, em camundongos injetados i.p., observamos que a captação de glutamato por fatias de hipocampo e estriado foi inibida por ambos (poligodial e drimanial) enquanto em fatias de córtex não tiveram efeito. Estes resultados demonstram que há uma possibilidade destes dois compostos aumentarem as concentrações extracelulares de glutamato, apontando para um possível efeito neurotóxico, o que sugere cautela com suas utilizações terapêuticas. / Natural products including those derived from plants, have over the years greatly contributed to the development of therapeutic drugs. Polygodial and drimanial are sesquiterpenes isolated from the bark of the plant Drymis Winteri (Winteraceae) that exhibit antinociceptive properties. Since peripheral glutamate presents nociceptive actions, in this study it was investigated the effects of these compounds on the glutamatergic system in rat brain and mice. Polygodial in vitro inhibited glutamate binding, glutamate uptake by astrocytes, as well as by cortical, hippocampal and striatal slices, and increased synaptosomal glutamate release. The drimanial in vitro inhibited glutamate binding, glutamate uptake by astrocytes, synaptic vesicles, as well as by cortical, hippocampal and striatal slices, and increased synaptosomal glutamate release.When injected intraperitoneally in adult male mice, we observed that both polygodial and drimanial inhibited the glutamate uptake in slices from hippocampus and striatum, and did not affects glutamate uptake by cortical slices. These concurrent effects would predispose to an increase in the extracellular glutamate concentrations, leading to possible neurotoxic effects (excitotoxicity) of these natural compounds, which would suggest the need for some caution in their therapeutic application.

Produtos naturais derivados de planta têm contribuído enormemente para o desenvolvimento de drogas terapêuticas. Poligodial e drimanial são sesquiterpenos isolados da casca de Drymis winteri (Winteraceae), que apresenta propriedades antinociceptivas. O glutamato periférico possui ações nociceptivas; assim, neste estudo investigamos os efeitos destes compostos em vários parâmetros do sistema glutamatérgico de cérebro de ratos e camundongos. O poligodial, in vitro, inibiu significativamente a união do glutamato aos seus receptores, a captação de glutamato em céluas de astrocitos, assim como a captação de glutamato por fatias de córtex, hipocampo e estriado de cérebro de ratos, e estimulou a liberação de glutamato em preparações de sinaptossomas.O drimanial, in vitro, inibiu significativamente a união do glutamato aos seus receptores, a captação de glutamato em células de astrocitos e em preparações de vesículas sinápticas, assim como a captação de glutamato por fatias de córtex, hipocampo e estriado de cérebro de ratos, e estimulou a liberação de glutamato em preparações de sinaptossomas. Quando efetuamos experimentos, in vivo, em camundongos injetados i.p., observamos que a captação de glutamato por fatias de hipocampo e estriado foi inibida por ambos (poligodial e drimanial) enquanto em fatias de córtex não tiveram efeito. Estes resultados demonstram que há uma possibilidade destes dois compostos aumentarem as concentrações extracelulares de glutamato, apontando para um possível efeito neurotóxico, o que sugere cautela com suas utilizações terapêuticas. / Natural products including those derived from plants, have over the years greatly contributed to the development of therapeutic drugs. Polygodial and drimanial are sesquiterpenes isolated from the bark of the plant Drymis Winteri (Winteraceae) that exhibit antinociceptive properties. Since peripheral glutamate presents nociceptive actions, in this study it was investigated the effects of these compounds on the glutamatergic system in rat brain and mice. Polygodial in vitro inhibited glutamate binding, glutamate uptake by astrocytes, as well as by cortical, hippocampal and striatal slices, and increased synaptosomal glutamate release. The drimanial in vitro inhibited glutamate binding, glutamate uptake by astrocytes, synaptic vesicles, as well as by cortical, hippocampal and striatal slices, and increased synaptosomal glutamate release.When injected intraperitoneally in adult male mice, we observed that both polygodial and drimanial inhibited the glutamate uptake in slices from hippocampus and striatum, and did not affects glutamate uptake by cortical slices. These concurrent effects would predispose to an increase in the extracellular glutamate concentrations, leading to possible neurotoxic effects (excitotoxicity) of these natural compounds, which would suggest the need for some caution in their therapeutic application.

As toxinas produzidas por cianobactérias em ecossistemas aquáticos de superfície utilizados para abastecimento público constituem uma preocupação mundial, com casos de intoxicação relatados em diversos países.Sérios problemas de saúde e até mesmo óbito podem ocorrer como consequência dessas intoxicações. Em ambientes de água doce eutrofizados, florações de espécies de Microcystis são frequentemente observadas e, devido à sua ampla distribuição geográfica e capacidade de produzir toxinas, este é um dos gêneros de cianobactérias mais extensivamente estudados. Microcystis spp. são conhecidas pela produção da potente hepatotoxina microcistina. No entanto, um estudo recente com a linhagem M. aeruginosa SPC777 isolada da represa Billings (São Paulo, SP) relatou a sua capacidade de produção simultânea da [L-ser7] microcistina-RR e da neurotoxina saxitoxina (goniautoxinas 1, 2, 3 e 4). Esse foi o primeiro relato de produção de saxitoxina por uma cianobactéria unicelular. Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo identificar e sequenciar os genes envolvidos na biossíntese da microcistina e saxitoxina na linhagem M. aeruginosa SPC777 e reavaliar a produção destas toxinas após vários anos de cultivo em laboratório. Para isso, foi feito o sequenciamento do genoma de M. aeruginosa SPC777 na plataforma SOLiD V3 e a montagem ab initio das leituras foi realizada usando os algoritmos Edena e Velvet. Análises Blast no banco de dados do NCBI foram realizadas na busca de similaridade por sequências dos genes mcy e sxt e de genes que flanqueiam os agrupamentos envolvidos na biossíntese de ambas as toxinas. Além disso, PCR e sequenciamento Sanger foram empregados para auxiliar a busca dos genes de interesse. Os dez genes envolvidos na biossíntese da microcistina (mcyA-J) foram encontrados e anotados a partir do genoma da M. aeruginosa SPC777, assim como os genes dnaN e uma1, que são normalmente encontrados flanqueando o agrupamento gênico da microcistina. O arranjo dos genes mcy no agrupamento seguiu a mesma ordem de outros descritos na literatura, mas foram encontradas diferenças na sequência de nucleotídeos para alguns dos genes. Para saxitoxina, apenas cinco genes entre aqueles diretamente envolvidos na biossíntese desta neurotoxina foram encontrados usando PCR e sequenciamento Sanger. As sequências parciais dos genes sxt apresentaram alta identidade com outros encontrados em cianobactérias tóxicas. Além disso, a tradução dessas sequências em aminoácidos e as funções protéicas e domínios preditos confirmaram sua identidade como genes da sintetase de saxitoxina. Análises químicas em HPLC-MS/MS mostraram a produção de microcistina, com a detecção do íon m/z 1036, que corresponde à microcistina-YM. Entretanto, não foi observada produção de saxitoxinas. Pelo que sabemos, este é o primeiro agrupamento gênico de microcistina sequenciado de uma linhagem de Microcystis isolada da América do Sul,além de serem os primeiros genes sxt descritos em uma cianobactéria unicelular. Este estudo propiciou novos conhecimentos sobre a origem dos genes mcy e sxt e contribuiu para uma melhor compreensão da evolução destas toxinas / The toxins produced by cyanobacteria in surface aquatic ecosystems used for public supply constitute a worldwide concern, with poisoning cases reported in several countries. Serious health problems and even death can occur as a consequence of these poisonings. In eutrophic freshwater environments, blooms of Microcystis species are often observed and, due to its wide geographic distribution and ability to produce toxins, this is one of the most extensively studied cyanobacterial genera. Microcystis spp. are known for the production of the potent hepatotoxin microcystin. Nonetheless, a recent study with the strain M. aeruginosa SPC777 isolated from Billings reservoir (São Paulo, SP) reported its ability for simultaneous production of [L-ser7] microcystin-RR and the neurotoxin saxitoxin (gonyautoxins 1, 2, 3 and 4). This was the first report of saxitoxin production by a unicellular cyanobacterium. In this context, the present study aimed at the identification and sequencing of the genes involved in the biosynthesis of microcystin and saxitoxin in the strain M. aeruginosa SPC777 and re-evaluation ofthe production of these toxins after several years of cultivation in laboratory. For this, whole genome sequencing of M. aeruginosa SPC777 was done in the platform SOLiD V3 and ab initio assembly of the reads was performed using the algorithms Edena and Velvet. Blast analyses in the NCBI database were performed in the searchfor similarity to mcy and sxt gene sequences and to genes flanking the clusters involvedin the biosynthesis of both toxins. Furthermore, PCR and Sanger sequencing were employed to help the search for the genes of interest. The ten genes involved in microcystin biosynthesis (mcyA-J) were found and annotated from the genome of M. aeruginosa SPC777, as well as the genes dnaN and uma1, which are usually found flanking the microcystin gene cluster. The arrangement of mcy genes in the cluster has followed the same order than others described in literature, but differences were found in the sequence of nucleotides for some of the genes. For saxitoxin, only five genes among those directly involved in the biosynthesis of this neurotoxin were found using PCR and Sanger sequencing. The partial sxt gene sequences have shown high identities to others found in toxic cyanobacteria. Additionally, their translation into amino acids and the predicted protein functions and domains confirmed their identity as saxitoxin synthetase genes.HPLC-MS/MS chemical analyses have shown the production of microcystin, with the detection of the ion m/z1036, which corresponds to the microcystin-YM. Nevertheless, saxitoxin production was not observed. As far as we know, this is the first microcystin gene cluster sequenced from a Microcystis strain isolated from South America and it is also the first time that sxt genes are described in a unicellular cyanobacterium. This study has brought new insightson the origin of the mcy and sxt genes and contributed to a better understanding of the evolution of these toxins

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:38:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Final Fabiana da Rocha.pdf: 3124321 bytes, checksum: d2fc3491ad6e57724b78055d068e6669 (MD5) Previous issue date: 2008-12-15 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Micrurus surinamensis, the aquatic coral snake species, has distribution in Amazonian rain forest. Your venom is neurotoxic to mammals and mainly fishes, principal natural feed. Studies about biological properties and biotechnological potential from M. surinamensis venom are necessaries to obtain dates to medical and sorotherapy treatment applications and to new drugs development. Using uni and bidimensional electrophoresis techniques were detected proteins with 7-70 kDa molecular masses range, 42 spots (12-70 kDa) with pI 4-7 and 38 spots (12-17 kDa) with pI 7-11. In vitro, venom showed very low phospholipases A2 activity that was inhibited 100% by Brazilian antielapidic Butantan Institute antivenom. Zymogram method not showed proteolytic activity in M. surinamensis venom. Plasma recalcification time with 80 μg venom suggests cascade coagulation inhibitors toxins in the venom, but in vivo test (in mice) venom not induced systemic hemorrhage and plasma anticoagulant activities. Venom LD50 was 700 μg / kg. Intracranial injection of the venom showed in mice apnea, uni and bilateral palpebral ptosis, jumps with short periods of immobility, compulsive itch and spasmodic contractions, but with 4 μg venom doses was observed convulsion and death shock. Competitive antibody-antigen interaction studies by western blot test showed that Brazilian antielapidic Butantan Institute antivenom has high antibodies title against 14 kDa neurotoxins but very low antibodies title against < 10 kDa neurotoxins. Antivenom potency against M. surinamensis venom was 0,35 mg/mL, five times low to neutralizing M. frontalis venom (1,5 mg/mL). This result suggests more molecular and clinical studies to including or not venom of M. surinamensis for antielapidic antivenom production. / A cobra coral aquática, Micrurus surinamensis, apresenta ampla distribuição na Amazônia. Seu veneno é neurotóxico para mamíferos e principalmente para peixes, alimento preferencial no seu habitat. Estudos básicos sobre as propriedades biológicas e potencial biotecnológico das toxinas do veneno dessa espécie são necessários, com o intuito de obter subsídios para a aplicação clínica, na soroterapia e/ou desenvolvimento de novas drogas. Neste trabalho, foram estudadas a toxinas do veneno de M. surinamensis por técnicas proteômicas, onde foram observados os efeitos neurotóxicos e as atividades biológicas do veneno, e avaliada a potência do soro antielapídico contra essas atividades. Utilizando-se eletroforese uni e bidimensional foram detectadas proteínas com massas moleculares de 7-70 kDa, 42 spots com massas moleculares de 12-70 kDa e pI 4-7, 38 spots com massas moleculares de 12-17 kDa e pI 7-11. O veneno apresentou, in vitro, baixa atividade PLA2, que foi 100% inibida pelo soro antielapídico produzido no Instituto Butantan. Utilizando a técnica de zimograma não foi observada atividade proteolítica. Segundo o método de recalcificação in vitro, o plasma humano mostrou-se incoagulável com 80 μg do veneno, sugerindo a presença de toxinas inibidoras da cascata de coagulação. No entanto, testes in vivo (em camundongos) não revelaram a presença de hemorragia sistêmica ou sangue incoagulável. A DL50 do veneno avaliada em camundongos, por via intravenosa, foi de 700 μg / kg. Ao inocular o veneno na região intracerebral, os animais manifestaram, segundos após a inoculação, sintomas como dificuldade respiratória, ptose palpebral uni e bilateral, pulos enérgicos, seguidos por períodos de imobilidade, espasmos nas patas posteriores e coceira compulsiva. Alguns apresentaram, com 4 μg do veneno, convulsão e morte instantânea. Estudos de interação competitiva toxinaanticorpo, realizados por western blotting, evidenciaram maior quantidade de anticorpos para as neurotoxinas de 14 kDa, porém, menor quantidade de anticorpos para as neurotoxinas < 10 kDa. A potência do soro antielapídico, do Instituto Butantan, para o veneno de M. surinamensis foi de 0,35 mg/mL, inferior ao do veneno de M. frontalis (1,5 mg/mL). Contudo, a maioria dos constituintes protéicos do veneno de M. surinamensis são toxinas com baixa massa molecular, principalmente de aproximadamente 7 kDa; o veneno é altamente neurotóxico para mamíferos (camundongos), afetando tanto o sistema nervoso periférico como o central; o soro antielapídico nacional mostrou, in vivo, baixa eficácia quanto à neutralização dos sintomas neurotóxicos causados pelo veneno. Devido à baixa potência do antiveneno, sugerem-se maiores estudos moleculares e clínicos para a inclusão ou não do veneno de M. surinamensis na produção dos soros antielapídicos.

As toxinas produzidas por cianobactérias em ecossistemas aquáticos de superfície utilizados para abastecimento público constituem uma preocupação mundial, com casos de intoxicação relatados em diversos países.Sérios problemas de saúde e até mesmo óbito podem ocorrer como consequência dessas intoxicações. Em ambientes de água doce eutrofizados, florações de espécies de Microcystis são frequentemente observadas e, devido à sua ampla distribuição geográfica e capacidade de produzir toxinas, este é um dos gêneros de cianobactérias mais extensivamente estudados. Microcystis spp. são conhecidas pela produção da potente hepatotoxina microcistina. No entanto, um estudo recente com a linhagem M. aeruginosa SPC777 isolada da represa Billings (São Paulo, SP) relatou a sua capacidade de produção simultânea da [L-ser7] microcistina-RR e da neurotoxina saxitoxina (goniautoxinas 1, 2, 3 e 4). Esse foi o primeiro relato de produção de saxitoxina por uma cianobactéria unicelular. Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo identificar e sequenciar os genes envolvidos na biossíntese da microcistina e saxitoxina na linhagem M. aeruginosa SPC777 e reavaliar a produção destas toxinas após vários anos de cultivo em laboratório. Para isso, foi feito o sequenciamento do genoma de M. aeruginosa SPC777 na plataforma SOLiD V3 e a montagem ab initio das leituras foi realizada usando os algoritmos Edena e Velvet. Análises Blast no banco de dados do NCBI foram realizadas na busca de similaridade por sequências dos genes mcy e sxt e de genes que flanqueiam os agrupamentos envolvidos na biossíntese de ambas as toxinas. Além disso, PCR e sequenciamento Sanger foram empregados para auxiliar a busca dos genes de interesse. Os dez genes envolvidos na biossíntese da microcistina (mcyA-J) foram encontrados e anotados a partir do genoma da M. aeruginosa SPC777, assim como os genes dnaN e uma1, que são normalmente encontrados flanqueando o agrupamento gênico da microcistina. O arranjo dos genes mcy no agrupamento seguiu a mesma ordem de outros descritos na literatura, mas foram encontradas diferenças na sequência de nucleotídeos para alguns dos genes. Para saxitoxina, apenas cinco genes entre aqueles diretamente envolvidos na biossíntese desta neurotoxina foram encontrados usando PCR e sequenciamento Sanger. As sequências parciais dos genes sxt apresentaram alta identidade com outros encontrados em cianobactérias tóxicas. Além disso, a tradução dessas sequências em aminoácidos e as funções protéicas e domínios preditos confirmaram sua identidade como genes da sintetase de saxitoxina. Análises químicas em HPLC-MS/MS mostraram a produção de microcistina, com a detecção do íon m/z 1036, que corresponde à microcistina-YM. Entretanto, não foi observada produção de saxitoxinas. Pelo que sabemos, este é o primeiro agrupamento gênico de microcistina sequenciado de uma linhagem de Microcystis isolada da América do Sul,além de serem os primeiros genes sxt descritos em uma cianobactéria unicelular. Este estudo propiciou novos conhecimentos sobre a origem dos genes mcy e sxt e contribuiu para uma melhor compreensão da evolução destas toxinas / The toxins produced by cyanobacteria in surface aquatic ecosystems used for public supply constitute a worldwide concern, with poisoning cases reported in several countries. Serious health problems and even death can occur as a consequence of these poisonings. In eutrophic freshwater environments, blooms of Microcystis species are often observed and, due to its wide geographic distribution and ability to produce toxins, this is one of the most extensively studied cyanobacterial genera. Microcystis spp. are known for the production of the potent hepatotoxin microcystin. Nonetheless, a recent study with the strain M. aeruginosa SPC777 isolated from Billings reservoir (São Paulo, SP) reported its ability for simultaneous production of [L-ser7] microcystin-RR and the neurotoxin saxitoxin (gonyautoxins 1, 2, 3 and 4). This was the first report of saxitoxin production by a unicellular cyanobacterium. In this context, the present study aimed at the identification and sequencing of the genes involved in the biosynthesis of microcystin and saxitoxin in the strain M. aeruginosa SPC777 and re-evaluation ofthe production of these toxins after several years of cultivation in laboratory. For this, whole genome sequencing of M. aeruginosa SPC777 was done in the platform SOLiD V3 and ab initio assembly of the reads was performed using the algorithms Edena and Velvet. Blast analyses in the NCBI database were performed in the searchfor similarity to mcy and sxt gene sequences and to genes flanking the clusters involvedin the biosynthesis of both toxins. Furthermore, PCR and Sanger sequencing were employed to help the search for the genes of interest. The ten genes involved in microcystin biosynthesis (mcyA-J) were found and annotated from the genome of M. aeruginosa SPC777, as well as the genes dnaN and uma1, which are usually found flanking the microcystin gene cluster. The arrangement of mcy genes in the cluster has followed the same order than others described in literature, but differences were found in the sequence of nucleotides for some of the genes. For saxitoxin, only five genes among those directly involved in the biosynthesis of this neurotoxin were found using PCR and Sanger sequencing. The partial sxt gene sequences have shown high identities to others found in toxic cyanobacteria. Additionally, their translation into amino acids and the predicted protein functions and domains confirmed their identity as saxitoxin synthetase genes.HPLC-MS/MS chemical analyses have shown the production of microcystin, with the detection of the ion m/z1036, which corresponds to the microcystin-YM. Nevertheless, saxitoxin production was not observed. As far as we know, this is the first microcystin gene cluster sequenced from a Microcystis strain isolated from South America and it is also the first time that sxt genes are described in a unicellular cyanobacterium. This study has brought new insightson the origin of the mcy and sxt genes and contributed to a better understanding of the evolution of these toxins

O ácido L-piroglutâmico (PGA) é o principal intermediário do ciclo γ-glutamil, que está relacionado à síntese e degradação da glutationa. Altos níveis de PGA no líquido cefalorraquidiano, sangue e outros tecidos, juntamente com a alta excreção urinária do mesmo (acidúria piroglutâmica ou 5-oxoprolinúria), ocorrem em alguns erros inatos do metabolismo envolvendo diferentes enzimas do ciclo γ-glutamil. Essas desordens são clinicamente caracterizadas por anemia hemolítica, acidose metabólica e disfunção neurológica severa. No entanto, os mecanismos de dano cerebral permanecem ainda não esclarecidos. Várias ações neurotóxicas foram previamente atribuídas ao PGA, como excitotoxicidade, inibição da atividade da Na+,K+-ATPase e alteração do metabolismo energético cerebral. No presente estudo, investigamos o possível papel do estresse oxidativo na neurotoxicidade do PGA. O efeito in vitro do PGA nas concentrações de 0,5 – 3,0 mM foi estudado sobre o potencial antioxidante total (TRAP), a reatividade antioxidante total (TAR), quimiluminescência, susbtâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), e atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GPx) em córtex cerebral e cerebelo de ratos de 14 dias de vida. Tanto o TRAP quanto o TAR foram significativamente reduzidos nas estruturas estudadas. Ao contrário, a quimiluminescência e o TBA-RS não foram afetados pelo PGA. As atividades da CAT, SOD e GPx também não foram alteradas. Esses resultados mostram que o PGA pode diminuir as defesas antioxidantes nãoenzimáticas em córtex cerebral e cerebelo de ratos. Outros estudos, no entanto, parecem válidos a fim de melhor caracterizar o papel dos radicais livres na neurotoxicidade do PGA.

O ácido L-piroglutâmico (PGA) é o principal intermediário do ciclo γ-glutamil, que está relacionado à síntese e degradação da glutationa. Altos níveis de PGA no líquido cefalorraquidiano, sangue e outros tecidos, juntamente com a alta excreção urinária do mesmo (acidúria piroglutâmica ou 5-oxoprolinúria), ocorrem em alguns erros inatos do metabolismo envolvendo diferentes enzimas do ciclo γ-glutamil. Essas desordens são clinicamente caracterizadas por anemia hemolítica, acidose metabólica e disfunção neurológica severa. No entanto, os mecanismos de dano cerebral permanecem ainda não esclarecidos. Várias ações neurotóxicas foram previamente atribuídas ao PGA, como excitotoxicidade, inibição da atividade da Na+,K+-ATPase e alteração do metabolismo energético cerebral. No presente estudo, investigamos o possível papel do estresse oxidativo na neurotoxicidade do PGA. O efeito in vitro do PGA nas concentrações de 0,5 – 3,0 mM foi estudado sobre o potencial antioxidante total (TRAP), a reatividade antioxidante total (TAR), quimiluminescência, susbtâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), e atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GPx) em córtex cerebral e cerebelo de ratos de 14 dias de vida. Tanto o TRAP quanto o TAR foram significativamente reduzidos nas estruturas estudadas. Ao contrário, a quimiluminescência e o TBA-RS não foram afetados pelo PGA. As atividades da CAT, SOD e GPx também não foram alteradas. Esses resultados mostram que o PGA pode diminuir as defesas antioxidantes nãoenzimáticas em córtex cerebral e cerebelo de ratos. Outros estudos, no entanto, parecem válidos a fim de melhor caracterizar o papel dos radicais livres na neurotoxicidade do PGA.

O ácido L-piroglutâmico (PGA) é o principal intermediário do ciclo γ-glutamil, que está relacionado à síntese e degradação da glutationa. Altos níveis de PGA no líquido cefalorraquidiano, sangue e outros tecidos, juntamente com a alta excreção urinária do mesmo (acidúria piroglutâmica ou 5-oxoprolinúria), ocorrem em alguns erros inatos do metabolismo envolvendo diferentes enzimas do ciclo γ-glutamil. Essas desordens são clinicamente caracterizadas por anemia hemolítica, acidose metabólica e disfunção neurológica severa. No entanto, os mecanismos de dano cerebral permanecem ainda não esclarecidos. Várias ações neurotóxicas foram previamente atribuídas ao PGA, como excitotoxicidade, inibição da atividade da Na+,K+-ATPase e alteração do metabolismo energético cerebral. No presente estudo, investigamos o possível papel do estresse oxidativo na neurotoxicidade do PGA. O efeito in vitro do PGA nas concentrações de 0,5 – 3,0 mM foi estudado sobre o potencial antioxidante total (TRAP), a reatividade antioxidante total (TAR), quimiluminescência, susbtâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), e atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GPx) em córtex cerebral e cerebelo de ratos de 14 dias de vida. Tanto o TRAP quanto o TAR foram significativamente reduzidos nas estruturas estudadas. Ao contrário, a quimiluminescência e o TBA-RS não foram afetados pelo PGA. As atividades da CAT, SOD e GPx também não foram alteradas. Esses resultados mostram que o PGA pode diminuir as defesas antioxidantes nãoenzimáticas em córtex cerebral e cerebelo de ratos. Outros estudos, no entanto, parecem válidos a fim de melhor caracterizar o papel dos radicais livres na neurotoxicidade do PGA.

A peçonha de anêmonas do mar é uma fonte conhecida de compostos bioativos, incluindo peptídeos, que atuam em canais voltagem-dependentes. Foram descritos 4 tipos de neurotoxinas de anêmonas do mar, que atuam em canais NaV e 4 tipos que atuam em canais KV. Essas toxinas têm permitido discriminar subtipos de canais voltagem-dependentes, estreitamente relacionados, e constituem poderosas ferramentas para estudar o funcionamento e estrutura desses canais. Neste estudo, foram isolados e caracterizados três peptídeos da fração neurotóxica da anêmona do mar Anthopleura cascaia. Esses peptídeos foram nomeados como AcaIII1425, AcaIII2970 e AcaIII3090, onde Aca faz referência a espécie e os números seguem os resultados obtidos nas etapas de purificação. A peçonha foi extraída por meio de estímulos elétricos e purificada por gel-filtração (Sephadex G-50) e fase reversa por HPLC (C-18). As massas moleculares foram obtidas por meio de MALDI-TOF, apresentando 3337,4 Da para a AcaIII1425, 4881,7 Da para a AcaIII2970 e 4880,5 Da para AcaIII3090. Através da técnica de voltage-clamp, esses peptídeos foram testados em diferentes subtipos de canais NaV e KV expressados em ovócito de Xenopus. As toxinas AcaIII2970 e AcaIII3090 retardam, de maneira seletiva, a inativação rápida dos subtipos rNaV1.3, mNaV1.6 e hNaV1.5, enquanto que as outras isoformas testadas permaneceram inalteradas. É importantemente salientar que, a AcaIII2970 e AcaIII3090 também foram examinadas no canal de inseto DmNaV1, revelando uma clara \"filo-seletividade\" na eficácia da atividade das toxinas. A AcaIII2970 e AcaIII3090 inibem fortemente a inativação do canal NaV de inseto, resultando em um aumento na amplitude do pico da corrente e removendo completamente a inativação rápida. Para quantificarmos essa \"filo-seletividade\", foram construídas curvas da dependência da concentração no retardo da inativação induzida pelas toxinas AcaIII2970 e AcaIII3090 nos canais em que apresentaram maior eficácia. Os IC50 foram obtidos após a plotagem dos dados em uma curva sigmoidal. Para a AcaIII2970, os seguintes valores de IC50 foram obtidos: DmNaV1 = 162,19 ± 11,22 nM, mNaV1.6 = 645,92 ± 18,52 nM, rNaV1.3 = 572,56 ± 44,96 nM. Para a AcaIII3090, os seguintes valores de IC50 foram obtidos: DmNaV1 = 99,03 ± 9,25 nM, mNaV1.6 = 158,30 ± 33,86 nM, rNaV1.3 = 371,60 ± 6,48 nM. A AcaIII1425 atua, bloqueando, de modo seletivo os subtipos rKV1.1, rKV1.6 e rKV4.3, enquanto que as outras isoformas testadas permaneceram inalteradas. Devido à maior especificidade da toxina AcaIII1425 pelos subtipos rKV1.1 e rKV1.6, foram realizados ensaios de bloqueio da corrente do canal em função da concentração da toxina (curva dose-resposta). Os valores de IC50 para os subtipos rKV1.1 e rKV1.6 são de 7642,98 ±1601,65 nM e 241,65 ±4,27 nM, respectivamente. Desta forma, a AcaIII1425 é cerca de 32 vezes mais potente em canais do subtipo rKV1.6 do que em relação aos canais do subtipo rKV1.1. A estrutura primária das toxinas foram determinadas por degradação de Edman. A sequência parcial da AcaIII2970 e AcaIII3090 revelou que estas são similares a toxinas de canal de sódio do tipo1 de anêmonas do mar. A sequência completa da AcaIII1425 não apresenta similaridade com toxinas de anêmonas do mar, mas é similar a toxinas de Conus e aranha que possuem um motivo estrutural conhecido como ICK. Dessa forma, propomos que a AcaIII1425 seja um novo grupo de toxinas de anêmonas do mar que bloqueiam KV. Dado o ineditismo da toxina AcaIII1425, foram feitos experimentos in silico para obtermos um maior refinamento do mecanismo de interação entre a toxina e o canal rKV1.6. Estes experimentos indicaram que diferentes regiões dos canais KV são importantes para a seletividade e potência da toxina, corroborando com as propostas que vem sendo descritas / The venom of sea anemones is a known source of bioactive compounds, including peptides that act on voltage-gated ion channels. Four types of neurotoxins from sea anemones, acting on NaV channels, and four types acting on KV channels, have been reported. These toxins have developed the ability to discriminate closely related subtypes of voltage-gated channels, making them powerful tools to studying the function and structure of these channels. In this study, we isolated and characterized three peptides of the neurotoxic fraction from the venom of the sea anemone Anthopleura cascaia. These peptides were named as AcaIII1425, and AcaIII2970 AcaIII3090, where Aca refers to the species and the following numbers refer to results obtained in the purification steps. The venom was milked by electric shock and purified by molecular exclusion (Sephadex G-50) and reverse phase HPLC (C-18). Their molecular weights are 3337.4 Da to AcaIII1425, 4881.7 Da to AcaIII2970 and 4880.5 Da to AcaIII3090, obtained through a MALDI-TOF. Using the voltage-clamp technique, we have assayed the effects of these peptides on different subtypes of NaV and KV channels expressed in Xenopus oocytes. AcaIII2970 and AcaIII3090 toxins selectively slow down the fast inactivation of rNaV1.3, mNaV1.6 and hNaV1.5 subtypes, while the other mammalian isoforms remained unaffected. Importantly, AcaIII2970 and AcaIII3090 were also examined in insect DmNaV1 channel, revealing a clear phyla-selectivity with regards to the efficacy of the toxin. AcaIII2970 and AcaIII3090 strongly inhibit the inactivation of the insect NaV channel, resulting in an increase in the amplitude of the peak current, and complete removal of the fast and steady-state inactivation. In order to quantify this \"phyla-selectivity\", curves of the concentration dependence of the delayed inactivation induced by AcaIII2970 and AcaIII3090 toxins channels with higher efficacy, were built. After plotting the data on a sigmoidal curve the IC50 values were obtained. For AcaIII2970, the following IC50 values were obtained: DmNaV1 = 162.19 ± 11.22 nM, mNaV1.6 = 645.92 ± 18.52 nM and rNaV1.3 = 572.56 ± 44.96 nM. For AcaIII3090, the following IC50 values were obtained: DmNaV1 = 99.03 ± 9.25 nM, mNaV1.6 = 158.30 ± 33.86 nM and rNaV1.3 = 371.60 ± 6.48 nM. AcaIII1425 acts, selectively, blocking rKV1.1, rKV1.6 and rKV4.3 subtypes, while the others isoforms tested remained unaltered. Due the higher specificity of AcaIII1425 to rKV1.1 and rKV1.6 subtypes, assays were performed to evaluate the blocking channel current versus toxin concentration (dose-response curve). IC50 values for the subtypes rKV1.6 and rKV1.1 are 7642.98 ± 1601.65 nM and 241.65 ± 4.27 nM, respectively. Thus, AcaIII1425 is about 32 times more potent in the rKV1.6 than in the rKV1.1 channel. The primary structure of the toxins was determined by the Edman degradation. The partial sequence of AcaIII2970 and AcaIII3090 revealed that these toxins are similar to the type 1 sodium channel sea anemones neurotoxins. The complete sequence of AcaIII1425 has no similarity with other sea anemone toxins, but is similar to the Conus and spider neurotoxins which have a structural motif known as ICK. Thus, we propose that AcaIII1425 comprises a new group of sea anemones toxins that block KV channels. Given the unprecedented nature of the toxin AcaIII1425, in silico assays were carried out in order to further refining the proposed mechanism underlying the interaction between the toxin and the rKV1.6 channel. The results indicate that, in agreement to what has been proposed elsewhere, different regions of the KV channels are important for the toxin selectivity and potency