O mexilhão marrom Perna perna (Linnaeus, 1758) auxilia no monitoramento de compostos químicos em ecossistemas marinhos. No entanto, os mecanismos moleculares de detoxificação e resposta ao estresse são desconhecidos. Elucidar esses mecanismos é crucial para entender os efeitos tóxicos dos poluentes químicos e desenvolver biomarcadores para avaliar a qualidade ambiental dos ecossistemas marinhos. No presente estudo, indivíduos da espécie P. perna foram expostos a antraceno (ANT) e os RNAs mensageiros (mRNA) das brânquias foram sequenciados com a plataforma Illumina. A análise química do tecido mole dos animais identificou concentrações de ANT 268 a 715 vezes mais alta no grupo exposto comparado ao grupo controle, demonstrando que a exposição foi realizada com sucesso. O sequenciamento do transcritoma do P. perna gerou 273.152.390 pares de reads, resultando na montagem de 231.728 contigs com tamanho médio de 720 pb e N50 de 1.083 pb, os quais 66.563 contigs (28,7%) pode ser anotado utilizando banco de dados como GenBank, Pfam, Gene Ontology e KEGG. Os resultados obtidos a partir da anotação funcional sugerem que as brânquias tenham papel na biotransformação de xenobióticos, resposta antioxidante, sinalização, resposta imunológica inata, e osmorregulação. Foi possível identificar genes de biotransformação de fase I, II e III, incluindo CYPs e GSTs. Transcritos similares a CYPs e GSTs estavam sendo expressos no grupo exposto, porém nenhum deles foram classificados como diferencialmente expressos. Contudo, muitos genes hipotéticos foram diferencialmente expressos, o que sugere que P. perna utilize mecanismos desconhecidos de biotransformação para lidar com a contaminação de ANT. Genes de sistema imune inato foram regulados tanto positivamente quanto negativamente, assim como observado para Perna viridis exposto a benzo(a)pireno, sugerindo que ANT promove alterações da capacidade de resposta do sistema imune inato do P. perna. / The brown mussel Perna perna (Linnaeus, 1758) helps the monitoring of chemical compounds in marine ecosystems. However its molecular mechanisms of detoxification and stress response remain unclear. Elucidating these mechanisms is crucial to understand the toxic effects of chemical pollutants and to develop biomarkers to assess marine ecosystems. In this study, P. perna individuals were exposed to anthracene (ANT) and its mRNA complement was sampled sequenced with Illumina technology. Chemical analysis of the soft tissue identified ANT concentrations 268 - 715 fold higher in the exposed group compared to controls, demonstrating that the exposure procedure was successfully accomplished. Transcriptome sequencing of P. perna generated 273.152.390 paired reads that were assembled in 231.728 contigs of average length 720 bp and N50 1.083 bp , which 66.563 contigs (28,7%) could be annotated using GenBank genes, Pfam domains, Gene Ontology (GO) terms and KEGG pathways. The results obtained from functional annotation suggest gills play a role in xenobiotics biotransformation, antioxidant response, signal transduction, innate immune response, and osmoregulation. It was possible to identify transcripts similar to genes related with biotransformation reactions of phases I, II and III, including CYPs and GSTs. Transcripts similar to CYPs and GSTs isoforms were highly expressed in the group exposed to ANT, however no CYP, GST, or even other genes related with biotransformation reactions were classified as differentially expressed. On the other hand, several hypothetical genes were differentially expressed, which suggests that P. perna uses unknown mechanisms of biotransformation to deal with ANT stress contamination. Immune related-genes were both up and down-regulated, as was also observed for Perna viridis exposed to benzo(a)pyrene, suggesting that ANT promotes alteration in the immune response of P. perna.

O mexilhão marrom Perna perna (Linnaeus, 1758) auxilia no monitoramento de compostos químicos em ecossistemas marinhos. No entanto, os mecanismos moleculares de detoxificação e resposta ao estresse são desconhecidos. Elucidar esses mecanismos é crucial para entender os efeitos tóxicos dos poluentes químicos e desenvolver biomarcadores para avaliar a qualidade ambiental dos ecossistemas marinhos. No presente estudo, indivíduos da espécie P. perna foram expostos a antraceno (ANT) e os RNAs mensageiros (mRNA) das brânquias foram sequenciados com a plataforma Illumina. A análise química do tecido mole dos animais identificou concentrações de ANT 268 a 715 vezes mais alta no grupo exposto comparado ao grupo controle, demonstrando que a exposição foi realizada com sucesso. O sequenciamento do transcritoma do P. perna gerou 273.152.390 pares de reads, resultando na montagem de 231.728 contigs com tamanho médio de 720 pb e N50 de 1.083 pb, os quais 66.563 contigs (28,7%) pode ser anotado utilizando banco de dados como GenBank, Pfam, Gene Ontology e KEGG. Os resultados obtidos a partir da anotação funcional sugerem que as brânquias tenham papel na biotransformação de xenobióticos, resposta antioxidante, sinalização, resposta imunológica inata, e osmorregulação. Foi possível identificar genes de biotransformação de fase I, II e III, incluindo CYPs e GSTs. Transcritos similares a CYPs e GSTs estavam sendo expressos no grupo exposto, porém nenhum deles foram classificados como diferencialmente expressos. Contudo, muitos genes hipotéticos foram diferencialmente expressos, o que sugere que P. perna utilize mecanismos desconhecidos de biotransformação para lidar com a contaminação de ANT. Genes de sistema imune inato foram regulados tanto positivamente quanto negativamente, assim como observado para Perna viridis exposto a benzo(a)pireno, sugerindo que ANT promove alterações da capacidade de resposta do sistema imune inato do P. perna. / The brown mussel Perna perna (Linnaeus, 1758) helps the monitoring of chemical compounds in marine ecosystems. However its molecular mechanisms of detoxification and stress response remain unclear. Elucidating these mechanisms is crucial to understand the toxic effects of chemical pollutants and to develop biomarkers to assess marine ecosystems. In this study, P. perna individuals were exposed to anthracene (ANT) and its mRNA complement was sampled sequenced with Illumina technology. Chemical analysis of the soft tissue identified ANT concentrations 268 - 715 fold higher in the exposed group compared to controls, demonstrating that the exposure procedure was successfully accomplished. Transcriptome sequencing of P. perna generated 273.152.390 paired reads that were assembled in 231.728 contigs of average length 720 bp and N50 1.083 bp , which 66.563 contigs (28,7%) could be annotated using GenBank genes, Pfam domains, Gene Ontology (GO) terms and KEGG pathways. The results obtained from functional annotation suggest gills play a role in xenobiotics biotransformation, antioxidant response, signal transduction, innate immune response, and osmoregulation. It was possible to identify transcripts similar to genes related with biotransformation reactions of phases I, II and III, including CYPs and GSTs. Transcripts similar to CYPs and GSTs isoforms were highly expressed in the group exposed to ANT, however no CYP, GST, or even other genes related with biotransformation reactions were classified as differentially expressed. On the other hand, several hypothetical genes were differentially expressed, which suggests that P. perna uses unknown mechanisms of biotransformation to deal with ANT stress contamination. Immune related-genes were both up and down-regulated, as was also observed for Perna viridis exposed to benzo(a)pyrene, suggesting that ANT promotes alteration in the immune response of P. perna.

Neste estudo foi implementado um pipeline bioinformático para processar e analisar dados de RNA-Seq total e fita-específico gerados em nosso laboratório a partir de amostras pareadas de tumor e tecido adjacente não tumoral de 14 pacientes com o objetivo de catalogar com alta-resolução a composição e alterações no transcritoma no PDAC incluindo genes codificadores e não codificadores de proteína. / In the present work, we applied a bioinformatic pipeline to process and analyse data from total RNA-seq strand-oriented generated in our laboratory from matched samples of tumor and non-tumor adjacent pancreatic tissue from 14 patients with the goal of generate a high resolution catalog of the composition and the alterations in the transcriptome of PDAC, including protein coding and non coding genes.

Haemophilus influenzae (Hi) é uma bactéria Gram-negativa comensal da nasofaringe e um patógeno oportunista cujo único hospedeiro natural conhecido é o ser humano. As cepas de Hi que possuem cápsula de polissacarídeo estão associadas a doenças invasivas mais graves, sendo as de sorotipo b (Hib) as principais causadoras da meningite bacteriana em populações não vacinadas. Para produzir a vacina contra Hib, o polissacarídeo purificado desta bactéria é conjugado quimicamente ao toxóide tetânico. Industrialmente, a produção do polissacarídeo é realizada cultivando esse micro-organismo em biorreatores, entretanto o rendimento em polissacarídeo é baixo, mesmo com fornecimento de nutrientes, controle de pH e outros ajustes das condições no decorrer do cultivo. O estudo dos diferentes perfis fisiológicos da população bacteriana de Hib no decorrer do cultivo através da transcritômica traz a possibilidade de aprofundar o conhecimento sobre o metabolismo desse micro- organismo. As taxas de transcrição dos genes expressos em diferentes momentos considerados como pontos metabolicamente significativos do cultivo de Hib linhagem GB 3291 em batelada alimentada conduzido em Biorreator de 10 L, com aeração submersa e controles de pH (7,0) e temperatura (30° C) foram obtidas através de sequenciamento de RNA paralelo massivo (RNA-seq). A análise de co-expressão dos genes foi realizada com WGCNA, em que oito módulos de genes co-expressos foram identificados, quatro dos quais apresentaram correlação alta com dados fenotípicos dos cultivos, inclusive produtividade de acetato e de polissacarídeo. Análise de enriquecimento funcional identificou vias metabólicas associadas a ribossomo, síntese de parede celular, transportadores e consumo de carbono. A análise de expressão diferencial permitiu observar o comportamento desta bactéria durante o cultivo. Através da análise das taxas de transcrição dos genes foi possível identificar as principais vias de síntese de acetato e de polissacarídeo capsular, sendo esta última feita principalmente através da via de pentose fosfato, em detrimento da via de interconversão pentose-glucuronato. Nossos dados mostram que as diferentes etapas do cultivo de Hib leva à ação conjunta de vários grupos de genes, com destaque àqueles ligados às funções celulares básicas, como a síntese de proteínas e de parede celular, o transporte e a síntese de aminoácidos. Esses resultados contribuem para o entendimento dos processos bioquímicos e celulares que ocorrem durante o processo de cultivo de Hib, possibilitando que sejam feitas sugestões de modificações genéticas em Hib e alteração no processo de cultivo com propósito de diminuir produção de acetato e aumentar produção do polissacarídeo. / Haemophilus influenzae (Hi) is a nasopharynx commensal Gram-negative bacterium and an opportunistic pathogen whose only known natural host is human being. Hi strains with polysaccharide capsule are related to more severe invasive diseases, wherein type b capsule (Hib) strains are the main cause of bacterial meningitis in unvaccinated population. To produce Hib vaccine, purified polysaccharide of this bacterium is chemically conjugated to tetanus toxoid protein. Industrially, polysaccharide production is performed by cultivating this micro-organism in bioreactors; however, the yield of polysaccharide is low, even with supply of nutrients, pH control and further adjustments of the fermentation conditions during cultivation. The study of different physiological profiles of Hib bacterial population during cultivation by transcriptomics brings the possibility to deepen the knowledge about the metabolism of this micro-organism. Transcription of genes expressed at different times considered metabolically significant points of Hib strain GB 3291 grown in fed-batch conducted in a 10 L bioreactor with submerged aeration and pH (7.0) and temperature (30 ° C) control rates were obtained through massive parallel RNA sequencing (RNA-seq). Gene co-expression analysis was performed with WGCNA, in which eight modules of co-expressed genes were identified, four of which showed high correlation with cultivation data traits, including acetate and polysaccharide productivity. Enrichment analysis identified pathways related to ribosome, cell wall synthesis, transports and carbon consumption. Differential expression analysis allowed to observe this bacteria behaviour during cultivation. Through transcription rate analysis, it was possible to identify the main pathways for acetate and polysaccharide synthesis, which is through pentose phosphate pathway instead of glucoronate-pentose pathway. Our data show that different stages in Hib cultivation leads to joint action of several gene groups, highlighting genes related to basic cellular roles, like protein and cell wall synthesis, transport and aminoacid synthesis. These results contribute to the understanding of biochemical and cellular processes that ocurr during Hib cultivation process, allowing suggestions to be made to modify Hib gene circuitry and to change cultivation process in order to decrease acetate production and to decrease acetate production and increase polysaccharide production.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas,Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-10-27T15:00:37Z No. of bitstreams: 1 2014_MarcoAurelioNinomiaPassos.pdf: 16854510 bytes, checksum: a4998054652f2ebc80b59742693cec5f (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2014-10-31T15:40:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_MarcoAurelioNinomiaPassos.pdf: 16854510 bytes, checksum: a4998054652f2ebc80b59742693cec5f (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-31T15:40:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_MarcoAurelioNinomiaPassos.pdf: 16854510 bytes, checksum: a4998054652f2ebc80b59742693cec5f (MD5) / A Sigatoka Amarela em banana (Musa spp.), causada pelo fungo Mycosphaerellamusicola, provoca desordem significativa de área foliar e amadurecimento prematuro do fruto. O desenvolvimento de genótipos resistentes a fungos patogênicos é de fundamental importância. A fim de desenvolver um recurso de genômica funcional para essa cultura oferencendo compreensão sobre os mecanismos moleculares das respostas de Musa a estresses bióticos, foi realizado um estudo de pirosequenciamento do transcritoma de Musa acuminata utilizando genótipos contrastantes em resistência ao patógeno M. musicola. Amostras de RNA total foram preparadas a partir do material foliar dos genótipos Calcutta 4 (resistente) e Cavendish Grande Naine (suscetível), ambos não infectados (controles não inoculados) e artificialmente desafiados com o patógeno. O estudo gerou 978.133 seqüências de alta qualidade, com um comprimento médio de 334pb e totalizando 466Mb, das quatro bibliotecas de cDNAseqüenciadas usando o 454 GS-FLX Titanium. A montagem de novo gerou 36.384 e 35.269 seqüênciasunigenes de M. acuminataCalcutta 4 e Cavendish Grande Naine, respectivamente. Seqüências montadas foram funcionalmente mapeadas nos termos do Gene Ontology (GO). As funções do unigenes cobriram uma ampla gama de funções moleculares, processos biológicos e componentes celulares. Os genes oriundos de uma série de vias relacionadas com a defesa foram observadas em transcritos a partir de cada biblioteca de cDNA.Inúmeros fatores de transcrição foram identificados, que são tipicamente envolvidos na regulação do desenvolvimento vegetal, sinalização e resposta ao meio ambiente, entre outros papéis. Muitos deles são também conhecidas por estarem envolvidas na transdução de sinal e regulação da expressão de genes responsivos ao estresse. Mais de 99% dos unigenes mapearam em regiões exônicas no genoma referência de M. acuminata DH Pahang. Além disso, a extração de proteínas foi realizada a partir dos materiais foliares inoculados e não inoculados. A focalização isoelétrica foi realizada utilizando o sistema IPGphor. A segunda dimensão foi realizada utilizando um gel de SDS-PAGE a 12%, com géis corados com solução de azul de Coomassie G-250. Os géis foram digitalizados usando um scanner ImageScanner II (GE Healthcare), e as imagem foram analisadas utilizando o software Imagem Master 2D Platinum 7.0 (GeneBio). Foramfeitastambémanálisesparadetecção de spotscomunsaomesmo cultivar (controle e tratado), bemcomo a identificação de spots com expressãodiferencial, e detecção de spotspresentes em apenasumacondição, denominados de spotsexclusivos. No cultivar resistente Calcutta 4, foramobservados 7 spotscomumaexpressãopelomenos 1,5 vezesmaior no tratadoquandocomparadoaocontrole. O padrão de expressãofoidiferente no cultivar suscetível, onde 1 spotapresentoudiferença de expressão entre o controle e o tratado. Os resultados da análise proteômica desta interação poderá gerar informações importantes, tais como: os tipos de proteínas expressas, as mudanças pós-tranducionais e respostas a diferentes condições ambientais, o que representa um elo entre a informação genotípica e fenotípica. Essa análise proteômica, em sobreposição com as informações transcritômicas geradas pelo seqüenciamentomassal com NGS, podem vir a beneficiar futuros programas de melhoramento genético de Musa na obtenção de genótipos resistentes. __________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Sigatoka leaf spot disease in banana (Musa spp.), caused by Mycosphaerella mosicola, causes significant reduction in functional leaf area and premature ripening of fruit. The development of genotypes resistant to fungal pathogens is of paramount importance. In order to develop a functional genomics resource for this crop which offers insights into molecular mechanisms of responses in Musa to biotic stresses, we performed a pyrosequencing study of the transcriptome in Musa acuminata genotypes contrasting in resistance to the fungal pathogen M. musicola. Total RNA samples were prepared from whole plant leaf material from genotypes Calcutta 4 (resistant) and Cavendish Grande Naine (susceptible), both uninfected (non-inoculated controls) and artificially challenged with the pathogen. The study generated 846,762 high quality sequences reads, with an average length of 334pb and totaling 283MSb, from four full-length enriched cDNA libraries sequenced using a 454 GS-FLX system pyrosequencer with Titanium chemistry. De novo assembly generated 36,384 and 35,269 unigene sequences for M. acuminate Calcutta 4 and Cavendish Grande Naine respectively. Assembled sequences were functionally mapped to Gene Ontology (GO) terms. Unigene functions covered a diverse range of molecular functions, biological processes and cellular components. Genes from a number of defense-related pathways were observed in transcripts from each library cDNA. Numerous transcription factors were also identified, which are typically involved in regulation of plant development, signaling and response to environment, amongst others roles. Many are also known to be involved in signal transduction and expression regulation of stress-responsive genes. Over 99% of contig unigenes mapped to exon regions in the reference M. acuminata DH Pahang whole genome sequence. Furthermore, protein extraction was conducted from the inoculated and non-inoculated leaf materials. Isoelectric focusing was performed using the IPGphor system. A second dimension was performed using an SDS-PAGE gel at 12%, with gels stained with Coomassie Blue solution G-250. Gels were scanned using a scanner ImageScanner II (GE Healthcare), with image analysis performed using the software Image Master 2D Platinum 7.0 (GeneBio). Assays to detect common spots were also made at the same cultivar (control and treated), as well as the identification of differentially expressed spots, and detection of spots present in only one condition, called exclusive spots. In the resistant cultivar Calcutta 4, 7 spots were observed at least 1,5 times higher expression in the treated compared with the control. The expression pattern was different in the susceptible cultivar which showed 1 spot difference in expression between control and treated. The results of the proteomic analysis of this interaction can generate important information such as: types of expressed proteins, post-translation changes and responses to different environmental conditions, representing a link between genotyp and phenotypic information. Proteomic analysis, overlapping with transcriptome information for this pathosystem, generated by NGS sequencing, can potentially benefit future programs for genetic improvement of Musa in development of resistant genotypes

Haemophilus influenzae (Hi) é uma bactéria Gram-negativa comensal da nasofaringe e um patógeno oportunista cujo único hospedeiro natural conhecido é o ser humano. As cepas de Hi que possuem cápsula de polissacarídeo estão associadas a doenças invasivas mais graves, sendo as de sorotipo b (Hib) as principais causadoras da meningite bacteriana em populações não vacinadas. Para produzir a vacina contra Hib, o polissacarídeo purificado desta bactéria é conjugado quimicamente ao toxóide tetânico. Industrialmente, a produção do polissacarídeo é realizada cultivando esse micro-organismo em biorreatores, entretanto o rendimento em polissacarídeo é baixo, mesmo com fornecimento de nutrientes, controle de pH e outros ajustes das condições no decorrer do cultivo. O estudo dos diferentes perfis fisiológicos da população bacteriana de Hib no decorrer do cultivo através da transcritômica traz a possibilidade de aprofundar o conhecimento sobre o metabolismo desse micro- organismo. As taxas de transcrição dos genes expressos em diferentes momentos considerados como pontos metabolicamente significativos do cultivo de Hib linhagem GB 3291 em batelada alimentada conduzido em Biorreator de 10 L, com aeração submersa e controles de pH (7,0) e temperatura (30° C) foram obtidas através de sequenciamento de RNA paralelo massivo (RNA-seq). A análise de co-expressão dos genes foi realizada com WGCNA, em que oito módulos de genes co-expressos foram identificados, quatro dos quais apresentaram correlação alta com dados fenotípicos dos cultivos, inclusive produtividade de acetato e de polissacarídeo. Análise de enriquecimento funcional identificou vias metabólicas associadas a ribossomo, síntese de parede celular, transportadores e consumo de carbono. A análise de expressão diferencial permitiu observar o comportamento desta bactéria durante o cultivo. Através da análise das taxas de transcrição dos genes foi possível identificar as principais vias de síntese de acetato e de polissacarídeo capsular, sendo esta última feita principalmente através da via de pentose fosfato, em detrimento da via de interconversão pentose-glucuronato. Nossos dados mostram que as diferentes etapas do cultivo de Hib leva à ação conjunta de vários grupos de genes, com destaque àqueles ligados às funções celulares básicas, como a síntese de proteínas e de parede celular, o transporte e a síntese de aminoácidos. Esses resultados contribuem para o entendimento dos processos bioquímicos e celulares que ocorrem durante o processo de cultivo de Hib, possibilitando que sejam feitas sugestões de modificações genéticas em Hib e alteração no processo de cultivo com propósito de diminuir produção de acetato e aumentar produção do polissacarídeo. / Haemophilus influenzae (Hi) is a nasopharynx commensal Gram-negative bacterium and an opportunistic pathogen whose only known natural host is human being. Hi strains with polysaccharide capsule are related to more severe invasive diseases, wherein type b capsule (Hib) strains are the main cause of bacterial meningitis in unvaccinated population. To produce Hib vaccine, purified polysaccharide of this bacterium is chemically conjugated to tetanus toxoid protein. Industrially, polysaccharide production is performed by cultivating this micro-organism in bioreactors; however, the yield of polysaccharide is low, even with supply of nutrients, pH control and further adjustments of the fermentation conditions during cultivation. The study of different physiological profiles of Hib bacterial population during cultivation by transcriptomics brings the possibility to deepen the knowledge about the metabolism of this micro-organism. Transcription of genes expressed at different times considered metabolically significant points of Hib strain GB 3291 grown in fed-batch conducted in a 10 L bioreactor with submerged aeration and pH (7.0) and temperature (30 ° C) control rates were obtained through massive parallel RNA sequencing (RNA-seq). Gene co-expression analysis was performed with WGCNA, in which eight modules of co-expressed genes were identified, four of which showed high correlation with cultivation data traits, including acetate and polysaccharide productivity. Enrichment analysis identified pathways related to ribosome, cell wall synthesis, transports and carbon consumption. Differential expression analysis allowed to observe this bacteria behaviour during cultivation. Through transcription rate analysis, it was possible to identify the main pathways for acetate and polysaccharide synthesis, which is through pentose phosphate pathway instead of glucoronate-pentose pathway. Our data show that different stages in Hib cultivation leads to joint action of several gene groups, highlighting genes related to basic cellular roles, like protein and cell wall synthesis, transport and aminoacid synthesis. These results contribute to the understanding of biochemical and cellular processes that ocurr during Hib cultivation process, allowing suggestions to be made to modify Hib gene circuitry and to change cultivation process in order to decrease acetate production and to decrease acetate production and increase polysaccharide production.

Orchids are characterized by producing minute endosperm-lacking seeds, which depend on mycorrhizal fungi for germination and embryo development. Some aclorophyllous orchids remain dependent on the mycorrhizal association for carbon acquisition during their whole life history, whereasother orchids develop photosynthesis. Despite the biological significance of orchid mycorrhiza, gene expression studies are lacking. We have used different highthroughput approaches in order to understanding the mechanisms regulating orchid mycorrhiza development and functioning. Firstly, we have used a 2D-LC-MS/MS approach coupled to isobaric tagging for relative and absolute quantification (iTRAQ) to identify proteins with differential accumulation in Oncidium sphacelatum at different stages of mycorrhizal protocorm development (achlorophyllous and green protocorms) after seed inoculation with a Ceratobasidium sp. isolate. Quantitative analysis showed that the expected changes in carbon metabolism in green protocorms were accompanied by enhanced accumulation of proteins involved in the modulation of reactive oxygen species homeostasis, defense related responses, phytoalexins and carotenoid biosynthesis, suggesting that orchid protocorms undergo profound metabolic changes during the switch from the fully mycoheterotrophic to the photosynthethic stage. Secondly, three different proteomic techniques were carried out in independent experiments aiming to identify changes in protein accumulation in mycorrhizal roots of the terrestrial orchid Oeceoclades maculata.Finally, O. maculatamycorrhizal roots were used for transcriptome analyses. The data revealed a strong increase in general stress responses, accompanied by changes in signaling pathways possibly related to fungal recognition and establishment of a compatible interaction. Some of the upregulated genes may be involved in the reorganization of cell structure, likely related to accommodation of the fungal symbiont in the plant roots. We have also observed in mycorrhizal roots up-regulation of genes involved in carbon metabolism, including glycolysis/gluconeogenesis and amino sugars metabolism, as well as genes involved innitrogen assimilation. The down-regulation of genes involved in the jasmonate and ABA transduction pathways, and key genes encoding anti-fungal proteins, such as chitinase and a mannose-specific binding lectin, strongly suggests an alleviation of plant defense responses in O. maculata mycorrhizal roots. In general, our data suggest that the physiology of an orchid mycorrhiza is more similar to a compatible interaction than to an arm-race between plant and fungi. Overall orchid mycorrhiza have proved to be a promising model for investigating plantfungal interactions and further studies should now address the specific roles of the genes showing differential regulation in this study. / As orquídeas são caracterizadas por produzirem sementes diminutas, que não possuem endosperma. Necessitam, portanto, da interação com fungos micorrízicos para germinação e desenvolvimento do embrião. Algumas orquídeas aclorofiladas se mantêm dependentes dos fungos micorrízicos para a aquisição de carbono, enquanto outras desenvolvem a maquinaria fotossintética. Apesar do significado biológico das micorrizas de orquídeas, alterações na expressão gênica e no acúmulo de proteínas foram altamente negligenciads nos últimos anos. Neste trabalho, foram utilizadas diferentes técnicas sequenciamento e identificação de genes e proteínas em larga-escala para acessar as alterações moleculares responsáveis pela regulação das micorrizas de orquídeas. Uma abordagem baseada em 2D-LC MS/MS acoplada a técnica de quantificação absoluta e relativa iTRAQ, foiutilizada para identificar proteínas com acúmulo diferencial em Oncidium sphacelatum em diferentes estágios do desenvolvimento do protocormo (protocormos aclorofilados versus protocormos fotossintetizantes), após inoculação com um fungo do gênero Ceratobasidium. As análises mostraram que, as alterações esperadas no metabolismo do carbono foram acompanhadas de um acúmulo aumentado de proteínas envolvidas na modulação de espécies reativas de oxigênio, respostas de defesa, biossíntese de fitoalexinas e carotenóides, sugerindo que os protocormos de orquídeas passam por profundas alterações metabolicas durante a transição do metabolismo micoheterotrófico para o fotossintético. Posteriormente foram utilizadas três diferentes técnicas de proteômica quantitativa para explorar alterações fisiológicas em raízes micorrizadas e não-micorrizadas de Oeceoclades maculata.Este estudo foi ampliado, pela utilização de uma abordagem transcritômica ao mesmo modelo biológico. Em conjunto, os dados revelaram um forte aumento em respostas relacionadas ao estresse, acompanhadas de alterações em vias de transdução de sinal possivelmente relacionadas ao reconhecimento do simbionte fúngico e estabelecimento de uma interação compatível. Alguns genes com expressão aumentada devem estar envolvidos na reorganização celular, provavelmente ligada a acomodação do simbionte fúngico nas raízes das plantas. Também foi observado o aumento de genes envolvidos no metabolismo do carbono e de açúcares aminados, juntamente a genes relacionados a assimilação de nitrogênio em raízes micorrizadas. A expressão diminuída de genes envolvidas nas vias do jasmonato e ácido abscícico, juntamente a genes-chave que codificam para proteínas anti-fúngicas sugerem fortemente uma atenuação das respostas de defesa da planta em raízes micorrizadas de Oeceoclades maculata. No geral, parece que as micorrizas de orquídeas são fisiológicamente mais próximas de uma simbiose compatível do que de uma interação unilateral em favor da planta. Sobretudo, este sistema biológico provou ser promissor para investigação de interações planta-fungo e, próximas pesquisas devem agora ser focadas em funções específicas dos genes que mostraram regulação diferencial neste estudo.

Orchids are characterized by producing minute endosperm-lacking seeds, which depend on mycorrhizal fungi for germination and embryo development. Some aclorophyllous orchids remain dependent on the mycorrhizal association for carbon acquisition during their whole life history, whereasother orchids develop photosynthesis. Despite the biological significance of orchid mycorrhiza, gene expression studies are lacking. We have used different highthroughput approaches in order to understanding the mechanisms regulating orchid mycorrhiza development and functioning. Firstly, we have used a 2D-LC-MS/MS approach coupled to isobaric tagging for relative and absolute quantification (iTRAQ) to identify proteins with differential accumulation in Oncidium sphacelatum at different stages of mycorrhizal protocorm development (achlorophyllous and green protocorms) after seed inoculation with a Ceratobasidium sp. isolate. Quantitative analysis showed that the expected changes in carbon metabolism in green protocorms were accompanied by enhanced accumulation of proteins involved in the modulation of reactive oxygen species homeostasis, defense related responses, phytoalexins and carotenoid biosynthesis, suggesting that orchid protocorms undergo profound metabolic changes during the switch from the fully mycoheterotrophic to the photosynthethic stage. Secondly, three different proteomic techniques were carried out in independent experiments aiming to identify changes in protein accumulation in mycorrhizal roots of the terrestrial orchid Oeceoclades maculata.Finally, O. maculatamycorrhizal roots were used for transcriptome analyses. The data revealed a strong increase in general stress responses, accompanied by changes in signaling pathways possibly related to fungal recognition and establishment of a compatible interaction. Some of the upregulated genes may be involved in the reorganization of cell structure, likely related to accommodation of the fungal symbiont in the plant roots. We have also observed in mycorrhizal roots up-regulation of genes involved in carbon metabolism, including glycolysis/gluconeogenesis and amino sugars metabolism, as well as genes involved innitrogen assimilation. The down-regulation of genes involved in the jasmonate and ABA transduction pathways, and key genes encoding anti-fungal proteins, such as chitinase and a mannose-specific binding lectin, strongly suggests an alleviation of plant defense responses in O. maculata mycorrhizal roots. In general, our data suggest that the physiology of an orchid mycorrhiza is more similar to a compatible interaction than to an arm-race between plant and fungi. Overall orchid mycorrhiza have proved to be a promising model for investigating plantfungal interactions and further studies should now address the specific roles of the genes showing differential regulation in this study. / As orquídeas são caracterizadas por produzirem sementes diminutas, que não possuem endosperma. Necessitam, portanto, da interação com fungos micorrízicos para germinação e desenvolvimento do embrião. Algumas orquídeas aclorofiladas se mantêm dependentes dos fungos micorrízicos para a aquisição de carbono, enquanto outras desenvolvem a maquinaria fotossintética. Apesar do significado biológico das micorrizas de orquídeas, alterações na expressão gênica e no acúmulo de proteínas foram altamente negligenciads nos últimos anos. Neste trabalho, foram utilizadas diferentes técnicas sequenciamento e identificação de genes e proteínas em larga-escala para acessar as alterações moleculares responsáveis pela regulação das micorrizas de orquídeas. Uma abordagem baseada em 2D-LC MS/MS acoplada a técnica de quantificação absoluta e relativa iTRAQ, foiutilizada para identificar proteínas com acúmulo diferencial em Oncidium sphacelatum em diferentes estágios do desenvolvimento do protocormo (protocormos aclorofilados versus protocormos fotossintetizantes), após inoculação com um fungo do gênero Ceratobasidium. As análises mostraram que, as alterações esperadas no metabolismo do carbono foram acompanhadas de um acúmulo aumentado de proteínas envolvidas na modulação de espécies reativas de oxigênio, respostas de defesa, biossíntese de fitoalexinas e carotenóides, sugerindo que os protocormos de orquídeas passam por profundas alterações metabolicas durante a transição do metabolismo micoheterotrófico para o fotossintético. Posteriormente foram utilizadas três diferentes técnicas de proteômica quantitativa para explorar alterações fisiológicas em raízes micorrizadas e não-micorrizadas de Oeceoclades maculata.Este estudo foi ampliado, pela utilização de uma abordagem transcritômica ao mesmo modelo biológico. Em conjunto, os dados revelaram um forte aumento em respostas relacionadas ao estresse, acompanhadas de alterações em vias de transdução de sinal possivelmente relacionadas ao reconhecimento do simbionte fúngico e estabelecimento de uma interação compatível. Alguns genes com expressão aumentada devem estar envolvidos na reorganização celular, provavelmente ligada a acomodação do simbionte fúngico nas raízes das plantas. Também foi observado o aumento de genes envolvidos no metabolismo do carbono e de açúcares aminados, juntamente a genes relacionados a assimilação de nitrogênio em raízes micorrizadas. A expressão diminuída de genes envolvidas nas vias do jasmonato e ácido abscícico, juntamente a genes-chave que codificam para proteínas anti-fúngicas sugerem fortemente uma atenuação das respostas de defesa da planta em raízes micorrizadas de Oeceoclades maculata. No geral, parece que as micorrizas de orquídeas são fisiológicamente mais próximas de uma simbiose compatível do que de uma interação unilateral em favor da planta. Sobretudo, este sistema biológico provou ser promissor para investigação de interações planta-fungo e, próximas pesquisas devem agora ser focadas em funções específicas dos genes que mostraram regulação diferencial neste estudo.