A superfamília PII de proteínas de transdução de sinal é conhecida por conter as proteínas sinalizadoras mais amplamente distribuídas na natureza, sendo ubíquas entre bactérias. Elas desempenham um papel chave na coordenação da regulação de processos metabólicos centrais, especialmente aqueles relacionados ao metabolismo de nitrogênio. As proteínas PII atuam por interação direta com uma variedade de alvos celulares, tais como fatores transcricionais, enzimas e transportadores, resultando na modulação da atividade desses receptores. A sinalização realizada por PII apresenta o potencial de responder a três sinais metabólicos: o sinal de energia ATP, o sinal de carbono 2- oxoglutarato e o sinal de nitrogênio glutamina. Os dois primeiros são transmitidos diretamente pela ligação das moléculas efetoras, enquanto que os níveis de nitrogênio são refletidos pela uridilação reversível de PII pela enzima GlnD, em condições de deficiência de nitrogênio. Em microrganismos diazotróficos, o papel das proteínas PII é estendido para o controle do processo de fixação de nitrogênio. O gênero Azospirillum é composto de diazotróficos de vida livre capazes de se associar de forma benéfica com diversas gramíneas, como por exemplo, cana-de-açúcar e arroz. Com o objetivo de analisar os sistemas regulatórios do metabolismo e da fixação de nitrogênio no modelo de estudo Azospirillum amazonense, foi proposta uma investigação da função das proteínas PII nessas vias. Os alvos celulares dos parálogos de PII presentes em A. amazonense – chamados de GlnB e GlnK – foram investigados utilizando experimentos de pull-down. Dois extratos de A. amazonense foram testados, referindo-se a condições de crescimento em abundância e limitação de nitrogênio. Ao todo, 42 prováveis proteínas de interação das formas não modificadas das duas proteínas PII foram identificadas por espectrometria de massas em tandem, no entanto as interações mapeadas devem ser confirmadas por métodos alternativos. Entre as proteínas isoladas, destaca-se a presença de 10 fatores transcricionais. Esses podem representar pontos de conexão com outros sistemas regulatórios, tais como o sistema de controle do conteúdo celular de exopolissacarídeos e o sistema de controle redox de processos energéticos. Além desses reguladores, nossos resultados incluem 2 proteínas envolvidas no metabolismo de metais, 2 transportadores, 12 enzimas metabólicas, 7 proteínas de funções basais e 9 proteínas de função desconhecida. / The PII superfamily of signal transduction proteins is known to contain the most widely distributed signaling proteins in nature, being ubiquitous among bacteria. They play a major role in coordinating the regulation of central metabolic processes, especially those related to nitrogen metabolism. PII proteins act by direct interaction with a variety of cellular targets, such as transcription factors, enzymes and transporters, resulting in modulation of receptor activities. PII signaling has the potential to respond to three central metabolic signals: the energy signal ATP, the carbon signal 2- oxoglutarate and the nitrogen signal glutamine. The first two are sensed directly by the binding of the effector molecules. The nitrogen levels are reflected by reversible uridylation of the PII by the glutamine-sensor enzyme GlnD, under nitrogen deficiency conditions. Thus, PII proteins serve as the central processing unit for the integration of antagonistic signals of carbon and nitrogen status, and use this information to control nitrogen assimilation. In diazotrophic microorganisms, PII proteins role is extended to the control of the nitrogen fixation process. The genus Azospirillum is composed of free-living diazotrophs capable of beneficial association with a variety of Graminae plants, such as sugarcane and rice. In order to appraise the regulatory systems of nitrogen fixation and metabolism in the model organism Azospirillum amazonense, an investigation of the PII proteins functions in these networks was proposed. The cellular targets of each of the PII paralogues found in A. amazonense – named GlnB and GlnK – were investigated by pull-down assays. Two protein extracts of A. amazonense were tested, referring to growth conditions of nitrogen limitation and sufficiency. Altogether, 42 potential interacting partners of the unmodified form of the two PII proteins were identified by LC-MS/MS, and these interactions are to be further confirmed by alternative methods. It is noteworthy that 10 transcriptional factors were isolated in our experiments. These factors may represent linking points for the cross-talk between nitrogen regulation and other regulatory systems, such as the control of exopolysaccharide biosynthesis and the redox control of energetic processes. Besides these transcriptional regulators, our results comprise 2 proteins related to heavy metals metabolism, 2 transporters, 12 metabolic enzymes, 7 housekeeping function proteins and 9 unknown function proteins.

A superfamília PII de proteínas de transdução de sinal é conhecida por conter as proteínas sinalizadoras mais amplamente distribuídas na natureza, sendo ubíquas entre bactérias. Elas desempenham um papel chave na coordenação da regulação de processos metabólicos centrais, especialmente aqueles relacionados ao metabolismo de nitrogênio. As proteínas PII atuam por interação direta com uma variedade de alvos celulares, tais como fatores transcricionais, enzimas e transportadores, resultando na modulação da atividade desses receptores. A sinalização realizada por PII apresenta o potencial de responder a três sinais metabólicos: o sinal de energia ATP, o sinal de carbono 2- oxoglutarato e o sinal de nitrogênio glutamina. Os dois primeiros são transmitidos diretamente pela ligação das moléculas efetoras, enquanto que os níveis de nitrogênio são refletidos pela uridilação reversível de PII pela enzima GlnD, em condições de deficiência de nitrogênio. Em microrganismos diazotróficos, o papel das proteínas PII é estendido para o controle do processo de fixação de nitrogênio. O gênero Azospirillum é composto de diazotróficos de vida livre capazes de se associar de forma benéfica com diversas gramíneas, como por exemplo, cana-de-açúcar e arroz. Com o objetivo de analisar os sistemas regulatórios do metabolismo e da fixação de nitrogênio no modelo de estudo Azospirillum amazonense, foi proposta uma investigação da função das proteínas PII nessas vias. Os alvos celulares dos parálogos de PII presentes em A. amazonense – chamados de GlnB e GlnK – foram investigados utilizando experimentos de pull-down. Dois extratos de A. amazonense foram testados, referindo-se a condições de crescimento em abundância e limitação de nitrogênio. Ao todo, 42 prováveis proteínas de interação das formas não modificadas das duas proteínas PII foram identificadas por espectrometria de massas em tandem, no entanto as interações mapeadas devem ser confirmadas por métodos alternativos. Entre as proteínas isoladas, destaca-se a presença de 10 fatores transcricionais. Esses podem representar pontos de conexão com outros sistemas regulatórios, tais como o sistema de controle do conteúdo celular de exopolissacarídeos e o sistema de controle redox de processos energéticos. Além desses reguladores, nossos resultados incluem 2 proteínas envolvidas no metabolismo de metais, 2 transportadores, 12 enzimas metabólicas, 7 proteínas de funções basais e 9 proteínas de função desconhecida. / The PII superfamily of signal transduction proteins is known to contain the most widely distributed signaling proteins in nature, being ubiquitous among bacteria. They play a major role in coordinating the regulation of central metabolic processes, especially those related to nitrogen metabolism. PII proteins act by direct interaction with a variety of cellular targets, such as transcription factors, enzymes and transporters, resulting in modulation of receptor activities. PII signaling has the potential to respond to three central metabolic signals: the energy signal ATP, the carbon signal 2- oxoglutarate and the nitrogen signal glutamine. The first two are sensed directly by the binding of the effector molecules. The nitrogen levels are reflected by reversible uridylation of the PII by the glutamine-sensor enzyme GlnD, under nitrogen deficiency conditions. Thus, PII proteins serve as the central processing unit for the integration of antagonistic signals of carbon and nitrogen status, and use this information to control nitrogen assimilation. In diazotrophic microorganisms, PII proteins role is extended to the control of the nitrogen fixation process. The genus Azospirillum is composed of free-living diazotrophs capable of beneficial association with a variety of Graminae plants, such as sugarcane and rice. In order to appraise the regulatory systems of nitrogen fixation and metabolism in the model organism Azospirillum amazonense, an investigation of the PII proteins functions in these networks was proposed. The cellular targets of each of the PII paralogues found in A. amazonense – named GlnB and GlnK – were investigated by pull-down assays. Two protein extracts of A. amazonense were tested, referring to growth conditions of nitrogen limitation and sufficiency. Altogether, 42 potential interacting partners of the unmodified form of the two PII proteins were identified by LC-MS/MS, and these interactions are to be further confirmed by alternative methods. It is noteworthy that 10 transcriptional factors were isolated in our experiments. These factors may represent linking points for the cross-talk between nitrogen regulation and other regulatory systems, such as the control of exopolysaccharide biosynthesis and the redox control of energetic processes. Besides these transcriptional regulators, our results comprise 2 proteins related to heavy metals metabolism, 2 transporters, 12 metabolic enzymes, 7 housekeeping function proteins and 9 unknown function proteins.

A superfamília PII de proteínas de transdução de sinal é conhecida por conter as proteínas sinalizadoras mais amplamente distribuídas na natureza, sendo ubíquas entre bactérias. Elas desempenham um papel chave na coordenação da regulação de processos metabólicos centrais, especialmente aqueles relacionados ao metabolismo de nitrogênio. As proteínas PII atuam por interação direta com uma variedade de alvos celulares, tais como fatores transcricionais, enzimas e transportadores, resultando na modulação da atividade desses receptores. A sinalização realizada por PII apresenta o potencial de responder a três sinais metabólicos: o sinal de energia ATP, o sinal de carbono 2- oxoglutarato e o sinal de nitrogênio glutamina. Os dois primeiros são transmitidos diretamente pela ligação das moléculas efetoras, enquanto que os níveis de nitrogênio são refletidos pela uridilação reversível de PII pela enzima GlnD, em condições de deficiência de nitrogênio. Em microrganismos diazotróficos, o papel das proteínas PII é estendido para o controle do processo de fixação de nitrogênio. O gênero Azospirillum é composto de diazotróficos de vida livre capazes de se associar de forma benéfica com diversas gramíneas, como por exemplo, cana-de-açúcar e arroz. Com o objetivo de analisar os sistemas regulatórios do metabolismo e da fixação de nitrogênio no modelo de estudo Azospirillum amazonense, foi proposta uma investigação da função das proteínas PII nessas vias. Os alvos celulares dos parálogos de PII presentes em A. amazonense – chamados de GlnB e GlnK – foram investigados utilizando experimentos de pull-down. Dois extratos de A. amazonense foram testados, referindo-se a condições de crescimento em abundância e limitação de nitrogênio. Ao todo, 42 prováveis proteínas de interação das formas não modificadas das duas proteínas PII foram identificadas por espectrometria de massas em tandem, no entanto as interações mapeadas devem ser confirmadas por métodos alternativos. Entre as proteínas isoladas, destaca-se a presença de 10 fatores transcricionais. Esses podem representar pontos de conexão com outros sistemas regulatórios, tais como o sistema de controle do conteúdo celular de exopolissacarídeos e o sistema de controle redox de processos energéticos. Além desses reguladores, nossos resultados incluem 2 proteínas envolvidas no metabolismo de metais, 2 transportadores, 12 enzimas metabólicas, 7 proteínas de funções basais e 9 proteínas de função desconhecida. / The PII superfamily of signal transduction proteins is known to contain the most widely distributed signaling proteins in nature, being ubiquitous among bacteria. They play a major role in coordinating the regulation of central metabolic processes, especially those related to nitrogen metabolism. PII proteins act by direct interaction with a variety of cellular targets, such as transcription factors, enzymes and transporters, resulting in modulation of receptor activities. PII signaling has the potential to respond to three central metabolic signals: the energy signal ATP, the carbon signal 2- oxoglutarate and the nitrogen signal glutamine. The first two are sensed directly by the binding of the effector molecules. The nitrogen levels are reflected by reversible uridylation of the PII by the glutamine-sensor enzyme GlnD, under nitrogen deficiency conditions. Thus, PII proteins serve as the central processing unit for the integration of antagonistic signals of carbon and nitrogen status, and use this information to control nitrogen assimilation. In diazotrophic microorganisms, PII proteins role is extended to the control of the nitrogen fixation process. The genus Azospirillum is composed of free-living diazotrophs capable of beneficial association with a variety of Graminae plants, such as sugarcane and rice. In order to appraise the regulatory systems of nitrogen fixation and metabolism in the model organism Azospirillum amazonense, an investigation of the PII proteins functions in these networks was proposed. The cellular targets of each of the PII paralogues found in A. amazonense – named GlnB and GlnK – were investigated by pull-down assays. Two protein extracts of A. amazonense were tested, referring to growth conditions of nitrogen limitation and sufficiency. Altogether, 42 potential interacting partners of the unmodified form of the two PII proteins were identified by LC-MS/MS, and these interactions are to be further confirmed by alternative methods. It is noteworthy that 10 transcriptional factors were isolated in our experiments. These factors may represent linking points for the cross-talk between nitrogen regulation and other regulatory systems, such as the control of exopolysaccharide biosynthesis and the redox control of energetic processes. Besides these transcriptional regulators, our results comprise 2 proteins related to heavy metals metabolism, 2 transporters, 12 metabolic enzymes, 7 housekeeping function proteins and 9 unknown function proteins.

O telúrio é um elemento raro usado como componente industrial de muitas ligas. Estudos in vivo e in vitro demonstraram que compostos orgânicos do telúrio são neurotóxicos, entre eles podemos destacar o ditelureto de difenila [(PhTe)2]. Os efeitos provocados por esse organotelureto nos diferentes sistemas são importantes, no entanto, os observados no SNC são particularmente marcantes. Relatos têm demonstrado que o (PhTe)2 pode causar alterações no estado de fosforilação dos filamentos intermediários (FIs) neuronais e gliais, sendo os neurônios e astrócitos importantes alvos desse neurotoxicante. Considerando que o citoesqueleto é um importante alvo de neurotoxinas, nosso trabalho estudou o efeito do (PhTe)2 sobre alguns parâmetros bioquímicos do citoesqueleto neural. Ratos submetidos a uma injeção subcutânea de (PhTe)2 apresentaram alteração na fosforilação e/ou expressão das subunidades dos neurofilamentos (NF-H, NF-M e NF-L), da GFAP e da vimentina, bem como ativação das vias das MAPK e da PKA. Essas modificações são dependentes da estrutura estudada (cerebelo ou estriado) e da idade do animal. Além disso, uma única administração de (PhTe)2 em ratos jovens provocou morte neuronal e astrogliose. Quando o (PhTe)2 é administrado nas ratas mães durante os primeiros 14 dias de lactação verificamos que ocorre uma modificação no sistema fosforilante associado aos FIs nos filhotes, novamente de uma maneira estrutura (córtex cerebral, hipocampo, estrido ou cerebelo) e idade dependente. Além disso, verificou-se que esse organocalcogênio injetado nas ratas mães também age sobre as vias das MAPK e da PKA. Estudos in vitro mostraram que esse composto orgânico do telúrio causa hipofosforilação dos FIs neuronais e gliais no córtex cerebral. Esse efeito é mediado por alteração homeostase do cálcio e do glutamato, bem como pela inibição da PKA, alteração da fosforilação da proteína DARPP-32(Thr34) e ativação da PP1. No hipocampo temos uma ativação dos receptores glutamatérgicos ionotrópicos e metabotrópicos, acarretando uma alteração na homeostase do cálcio e ativação da PKC, PKCaMII e via das MAPK, conduzindo a um aumento de fosforilação dos FIs neuronais e gliais. Nossos resultados mostraram, portanto, que o (PhTe)2 altera a homeostase do citoesqueleto cerebral e que essa modificação é dependente do desenvolvimento do animal, da estrutura cerebral estudada, bem como da maneira de contato com esse neurotoxicante. Além disso, verificou-se o envolvimento de várias vias de sinalização nas ações desencadeadas pelo composto orgânico do telúrio sobre os FIs, estando elas muitas vezes interligadas. Esses resultados podem contribuir para o melhor entendimento dos mecanismos envolvidos em uma intoxicação com compostos de telúrio, sendo que o desequilíbrio do citoesqueleto pode estar associado à neurotoxicidade desse organotelureto. / Tellurium is a rare element used as a component of many industrial alloys. In vivo and in vitro studies have demonstrated that organic tellurium compounds are neurotoxic. We can highlight the organic coumpoud diphenyl ditelluride [(PhTe)2]. The effects caused by this organoteluride in different systems are important, however, the effects observed in the CNS are particularly striking. Reports have shown that (PhTe)2 can induces changes in the phosphorylation state of neuronal and glial intermediate filaments (IFs). The neurons and astrocytes are important targets of this neurotoxin. Considering that the cytoskeleton is an important target for neurotoxins, the aim of the present study was studied the effect of (PhTe)2 on some biochemical parameters of the neural cytoskeleton. Rats treated with a single subcutaneous (s.c.) injection of (PhTe)2 showed changes in the phosphorylation and / or expression of neurofilament subunit (NF-H, NF-M and NF-L), GFAP and vimentin, as well as activation of the MAPK pathway and PKA. These changes are dependent on the structure studied (cerebellum or striatum) and age of the animal. Furthermore, a single administration (PhTe)2 in young rats caused neuronal death and astrogliosis. When (PhTe)2 is administered in dams during the first 14 days of lactation we observed a change in the phosphorylating system associated with IFs in pups. This effect is dependent of the structure studied and the developmental stages of the pups. Furthermore, it was found that (PhTe)2 is administered in dams during the first 14 days of lactation also acts on the MAPK pathway and in the PKA. In vitro studies showed that the organic tellurium causes hipophosphorylation of the neuronal and glial IFs proteins in the cerebral cortex. This effect is mediated by change in calcium and glutamate homeostasis, inhibition of PKA, desphosphorylation of the protein DARPP-32 (Thr34) and activation of PP1. In the hippocampus have an activation of ionotropic and metabotropic glutamatergic receptors, causing an alteration in calcium homeostasis and activation of PKC, PKCaMII and MAPK pathway, leading to increased phosphorylation of neuronal and glial IFs. The results of this work showed that the (PhTe)2 changes cytoskeletal homeostasis in brain. This modification is dependent of the animal development, the brain structure studied, as well as the way of contact with the neurotoxin. Moreover, there is the involvement of different signaling pathways in the action of (PhTe)2 and they are often interconnected. These results may contribute to a better understanding of mechanisms involved in intoxication with tellurium compounds. The imbalance of the cytoskeleton may be associated with neurotoxicity of this organochalcogenide.

O telúrio é um elemento raro usado como componente industrial de muitas ligas. Estudos in vivo e in vitro demonstraram que compostos orgânicos do telúrio são neurotóxicos, entre eles podemos destacar o ditelureto de difenila [(PhTe)2]. Os efeitos provocados por esse organotelureto nos diferentes sistemas são importantes, no entanto, os observados no SNC são particularmente marcantes. Relatos têm demonstrado que o (PhTe)2 pode causar alterações no estado de fosforilação dos filamentos intermediários (FIs) neuronais e gliais, sendo os neurônios e astrócitos importantes alvos desse neurotoxicante. Considerando que o citoesqueleto é um importante alvo de neurotoxinas, nosso trabalho estudou o efeito do (PhTe)2 sobre alguns parâmetros bioquímicos do citoesqueleto neural. Ratos submetidos a uma injeção subcutânea de (PhTe)2 apresentaram alteração na fosforilação e/ou expressão das subunidades dos neurofilamentos (NF-H, NF-M e NF-L), da GFAP e da vimentina, bem como ativação das vias das MAPK e da PKA. Essas modificações são dependentes da estrutura estudada (cerebelo ou estriado) e da idade do animal. Além disso, uma única administração de (PhTe)2 em ratos jovens provocou morte neuronal e astrogliose. Quando o (PhTe)2 é administrado nas ratas mães durante os primeiros 14 dias de lactação verificamos que ocorre uma modificação no sistema fosforilante associado aos FIs nos filhotes, novamente de uma maneira estrutura (córtex cerebral, hipocampo, estrido ou cerebelo) e idade dependente. Além disso, verificou-se que esse organocalcogênio injetado nas ratas mães também age sobre as vias das MAPK e da PKA. Estudos in vitro mostraram que esse composto orgânico do telúrio causa hipofosforilação dos FIs neuronais e gliais no córtex cerebral. Esse efeito é mediado por alteração homeostase do cálcio e do glutamato, bem como pela inibição da PKA, alteração da fosforilação da proteína DARPP-32(Thr34) e ativação da PP1. No hipocampo temos uma ativação dos receptores glutamatérgicos ionotrópicos e metabotrópicos, acarretando uma alteração na homeostase do cálcio e ativação da PKC, PKCaMII e via das MAPK, conduzindo a um aumento de fosforilação dos FIs neuronais e gliais. Nossos resultados mostraram, portanto, que o (PhTe)2 altera a homeostase do citoesqueleto cerebral e que essa modificação é dependente do desenvolvimento do animal, da estrutura cerebral estudada, bem como da maneira de contato com esse neurotoxicante. Além disso, verificou-se o envolvimento de várias vias de sinalização nas ações desencadeadas pelo composto orgânico do telúrio sobre os FIs, estando elas muitas vezes interligadas. Esses resultados podem contribuir para o melhor entendimento dos mecanismos envolvidos em uma intoxicação com compostos de telúrio, sendo que o desequilíbrio do citoesqueleto pode estar associado à neurotoxicidade desse organotelureto. / Tellurium is a rare element used as a component of many industrial alloys. In vivo and in vitro studies have demonstrated that organic tellurium compounds are neurotoxic. We can highlight the organic coumpoud diphenyl ditelluride [(PhTe)2]. The effects caused by this organoteluride in different systems are important, however, the effects observed in the CNS are particularly striking. Reports have shown that (PhTe)2 can induces changes in the phosphorylation state of neuronal and glial intermediate filaments (IFs). The neurons and astrocytes are important targets of this neurotoxin. Considering that the cytoskeleton is an important target for neurotoxins, the aim of the present study was studied the effect of (PhTe)2 on some biochemical parameters of the neural cytoskeleton. Rats treated with a single subcutaneous (s.c.) injection of (PhTe)2 showed changes in the phosphorylation and / or expression of neurofilament subunit (NF-H, NF-M and NF-L), GFAP and vimentin, as well as activation of the MAPK pathway and PKA. These changes are dependent on the structure studied (cerebellum or striatum) and age of the animal. Furthermore, a single administration (PhTe)2 in young rats caused neuronal death and astrogliosis. When (PhTe)2 is administered in dams during the first 14 days of lactation we observed a change in the phosphorylating system associated with IFs in pups. This effect is dependent of the structure studied and the developmental stages of the pups. Furthermore, it was found that (PhTe)2 is administered in dams during the first 14 days of lactation also acts on the MAPK pathway and in the PKA. In vitro studies showed that the organic tellurium causes hipophosphorylation of the neuronal and glial IFs proteins in the cerebral cortex. This effect is mediated by change in calcium and glutamate homeostasis, inhibition of PKA, desphosphorylation of the protein DARPP-32 (Thr34) and activation of PP1. In the hippocampus have an activation of ionotropic and metabotropic glutamatergic receptors, causing an alteration in calcium homeostasis and activation of PKC, PKCaMII and MAPK pathway, leading to increased phosphorylation of neuronal and glial IFs. The results of this work showed that the (PhTe)2 changes cytoskeletal homeostasis in brain. This modification is dependent of the animal development, the brain structure studied, as well as the way of contact with the neurotoxin. Moreover, there is the involvement of different signaling pathways in the action of (PhTe)2 and they are often interconnected. These results may contribute to a better understanding of mechanisms involved in intoxication with tellurium compounds. The imbalance of the cytoskeleton may be associated with neurotoxicity of this organochalcogenide.

O telúrio é um elemento raro usado como componente industrial de muitas ligas. Estudos in vivo e in vitro demonstraram que compostos orgânicos do telúrio são neurotóxicos, entre eles podemos destacar o ditelureto de difenila [(PhTe)2]. Os efeitos provocados por esse organotelureto nos diferentes sistemas são importantes, no entanto, os observados no SNC são particularmente marcantes. Relatos têm demonstrado que o (PhTe)2 pode causar alterações no estado de fosforilação dos filamentos intermediários (FIs) neuronais e gliais, sendo os neurônios e astrócitos importantes alvos desse neurotoxicante. Considerando que o citoesqueleto é um importante alvo de neurotoxinas, nosso trabalho estudou o efeito do (PhTe)2 sobre alguns parâmetros bioquímicos do citoesqueleto neural. Ratos submetidos a uma injeção subcutânea de (PhTe)2 apresentaram alteração na fosforilação e/ou expressão das subunidades dos neurofilamentos (NF-H, NF-M e NF-L), da GFAP e da vimentina, bem como ativação das vias das MAPK e da PKA. Essas modificações são dependentes da estrutura estudada (cerebelo ou estriado) e da idade do animal. Além disso, uma única administração de (PhTe)2 em ratos jovens provocou morte neuronal e astrogliose. Quando o (PhTe)2 é administrado nas ratas mães durante os primeiros 14 dias de lactação verificamos que ocorre uma modificação no sistema fosforilante associado aos FIs nos filhotes, novamente de uma maneira estrutura (córtex cerebral, hipocampo, estrido ou cerebelo) e idade dependente. Além disso, verificou-se que esse organocalcogênio injetado nas ratas mães também age sobre as vias das MAPK e da PKA. Estudos in vitro mostraram que esse composto orgânico do telúrio causa hipofosforilação dos FIs neuronais e gliais no córtex cerebral. Esse efeito é mediado por alteração homeostase do cálcio e do glutamato, bem como pela inibição da PKA, alteração da fosforilação da proteína DARPP-32(Thr34) e ativação da PP1. No hipocampo temos uma ativação dos receptores glutamatérgicos ionotrópicos e metabotrópicos, acarretando uma alteração na homeostase do cálcio e ativação da PKC, PKCaMII e via das MAPK, conduzindo a um aumento de fosforilação dos FIs neuronais e gliais. Nossos resultados mostraram, portanto, que o (PhTe)2 altera a homeostase do citoesqueleto cerebral e que essa modificação é dependente do desenvolvimento do animal, da estrutura cerebral estudada, bem como da maneira de contato com esse neurotoxicante. Além disso, verificou-se o envolvimento de várias vias de sinalização nas ações desencadeadas pelo composto orgânico do telúrio sobre os FIs, estando elas muitas vezes interligadas. Esses resultados podem contribuir para o melhor entendimento dos mecanismos envolvidos em uma intoxicação com compostos de telúrio, sendo que o desequilíbrio do citoesqueleto pode estar associado à neurotoxicidade desse organotelureto. / Tellurium is a rare element used as a component of many industrial alloys. In vivo and in vitro studies have demonstrated that organic tellurium compounds are neurotoxic. We can highlight the organic coumpoud diphenyl ditelluride [(PhTe)2]. The effects caused by this organoteluride in different systems are important, however, the effects observed in the CNS are particularly striking. Reports have shown that (PhTe)2 can induces changes in the phosphorylation state of neuronal and glial intermediate filaments (IFs). The neurons and astrocytes are important targets of this neurotoxin. Considering that the cytoskeleton is an important target for neurotoxins, the aim of the present study was studied the effect of (PhTe)2 on some biochemical parameters of the neural cytoskeleton. Rats treated with a single subcutaneous (s.c.) injection of (PhTe)2 showed changes in the phosphorylation and / or expression of neurofilament subunit (NF-H, NF-M and NF-L), GFAP and vimentin, as well as activation of the MAPK pathway and PKA. These changes are dependent on the structure studied (cerebellum or striatum) and age of the animal. Furthermore, a single administration (PhTe)2 in young rats caused neuronal death and astrogliosis. When (PhTe)2 is administered in dams during the first 14 days of lactation we observed a change in the phosphorylating system associated with IFs in pups. This effect is dependent of the structure studied and the developmental stages of the pups. Furthermore, it was found that (PhTe)2 is administered in dams during the first 14 days of lactation also acts on the MAPK pathway and in the PKA. In vitro studies showed that the organic tellurium causes hipophosphorylation of the neuronal and glial IFs proteins in the cerebral cortex. This effect is mediated by change in calcium and glutamate homeostasis, inhibition of PKA, desphosphorylation of the protein DARPP-32 (Thr34) and activation of PP1. In the hippocampus have an activation of ionotropic and metabotropic glutamatergic receptors, causing an alteration in calcium homeostasis and activation of PKC, PKCaMII and MAPK pathway, leading to increased phosphorylation of neuronal and glial IFs. The results of this work showed that the (PhTe)2 changes cytoskeletal homeostasis in brain. This modification is dependent of the animal development, the brain structure studied, as well as the way of contact with the neurotoxin. Moreover, there is the involvement of different signaling pathways in the action of (PhTe)2 and they are often interconnected. These results may contribute to a better understanding of mechanisms involved in intoxication with tellurium compounds. The imbalance of the cytoskeleton may be associated with neurotoxicity of this organochalcogenide.

Peptídeos sinais determinam o crescimento, desenvolvimento e defesa das plantas. RALF (Rapid Alkalinization Factor) é um peptídeo de sinalização ubíquo no reino vegetal e que está envolvido com a expansão celular. Os peptídeos RALF em arabidopsis estão organizados em uma família multigênica de 37 membros, alguns com expressão tecido-específica, outros expressos em toda a planta. Os mecanismos envolvidos na expansão celular são regulados por vários hormônios, entre os quais as citocininas. A relação existente entre os peptídeos RALF e os demais hormônios é pouco conhecida e um melhor entendimento dessa relação poderá auxiliar na modulação dos processos de crescimento e desenvolvimento vegetal por engenharia genética. O objetivo desse trabalho foi estudar a relação entre o peptídeo AtRALF e as citocininas, principalmente no que diz respeito aos efeitos de ambos no crescimento e desenvolvimento das raízes. Para isso, selecionou-se as isoformas AtRALF1, AtRALF19 e AtRALF34 que apresentam diferentes padrões de expressão. Os resultados sugerem que AtRALF19 e AtRALF34, ambas expressas em toda a planta, contribuem mais com a transdução de sinal da citocinina do que a isoforma AtRALF1, com padrão de expressão específico de raízes. Os peptídeos AtRALF19 e 34 reprimem parcialmente a expressão dos genes reguladores de resposta, ARRs tipo-A, que são reguladores negativos da via de sinalização de citocinina. / Peptides signals influence the growth, development and plant defense. RALF (Rapid Alkalinization Factor) is a ubiquitous signaling peptide in the plant kingdom and is involved in cell expansion. The RALF peptides in arabidopsis are organized in a multigene family of 37 members, some with tissue-specific expression, others expressed throughout the plant. The mechanisms involved in cellular growth are regulated by various hormones, including cytokinins. The relationship between RALF peptides and other hormones is poorly understood and a better understanding of this relationship assists in modulating the processes of plant growth and development. The aim of this work was to study the relationship of AtRALF peptide with cytokinins, especially with regard to the effects of both in the growth and development of roots. For this, we selected the AtRALF1, AtRALF19 and AtRALF34 isoforms that have different expression patterns. The results suggest that AtRALF19 and AtRALF34, both expressed throughout the plant, contribute more to cytokinin signal transduction than isoform AtRALF1, with specific expression pattern in roots. The AtRALF19 and 34 repressed the expression of type-A Arabidopsis Response Regulators (ARRs), whose products act as negative regulators of cytokinin signaling.

Glioblastoma (GB) é o tumor cerebral humano mais frequente e maligno. O prognóstico dos pacientes com GB permanece alarmante, principalmente devido à baixa eficácia das estratégias terapêuticas atuais além da natureza invasiva desse tipo de câncer. Uma característica de tumores sólidos é apresentar áreas hipóxicas. Microambientes hipóxicos contribuem para a progressão do câncer, resistência ao tratamento e ao prognóstico ruim da doença. Dessa forma, neste trabalho, desenvolvemos um modelo in vitro que se aproxima ao microambiente hipóxico tumoral in vivo. Nossos resultados sugerem que a privação de oxigênio (PO) em combinação com ausência de soro forneceu um ambiente favorável à desdiferenciação das células C6 em células tronco tumorais (CTT). A doxazosina (DOX), um antihipertensivo utilizado na clínica, apresenta efeitos antitumorais em diversos tipos de câncer. Assim, avaliamos o efeito antitumoral da doxazosina em linhagens de glioma de rato (C6) e humano (U138-MG) e a toxicidade do fármaco em culturas primárias de astrócitos e culturas organotípicas de hipocampo. A doxazosina induziu morte celular nas linhagens de glioma e apresentou baixa neurotoxicidade. Além disso, o fármaco inibiu a via da PI3K/Akt e ativou GSK-3β e p53, resultando em indução de apoptose e parada no ciclo celular na fase G0/G1. Considerando a importância da mitocôndria na plasticidade de células tumorais e a resistência ao tratamento apresentada pelos GB, nós analisamos os efeitos da DOX nas interações entre núcleo e mitocôndrias. A DOX induziu biogênese mitocondrial e apoptose nas células C6 e diminuiu secreção de TNF-α. Ao analisar a estrutura química da DOX, encontramos diversas características que indicam que ela possui autofluorescência. Dessa forma, caracterizamos a autofluorescência da DOX em diversos meios. Observamos que há um padrão de distribuição do fármaco nas células C6: ele se encontra ao redor do núcleo e parece estar vesiculado. A superexpressão do receptor do fator de crescimento epidermal (EGFR) está relacionada às formas mais malignas e resistentes de GBs. Portanto, analisamos se a ação antiglioma da DOX está envolvida com EGFR. O tratamento com DOX foi capaz de diminuir os níveis de p-EGFR. O co-tratamento de DOX e AG1478 (inibidor de receptores de tirosina cinase) diminuiu a fosforilação de EGFR e causou necrose. Em vista disso, nossos resultados sugerem que o mecanismo de ação da DOX envolve sinalização de EGFR. Por fim, nós avaliamos os efeitos da DOX livre e nanoencapsulada (DOX-NC) em modelos in vitro e in vivo de glioma. Demonstramos que a DOX-NC induziu morte celular em linhagem de glioma em concentrações 100 vezes menores do que as que utilizamos para a DOX na sua forma livre. Além disso, analisamos o efeito da DOX-NC em culturas organotípicas de hipocampo e, da mesma maneira que o observado com a DOX, a DOX-NC demonstrou baixa toxicidade e diminuiu a área tumoral in vivo, sendo seletiva para células cancerosas. Nesta tese, alteramos o microambiente in vitro de células de glioma, avaliamos os efeitos antitumorais da doxazosina em sua forma livre e nanoencapsulada. Além disso, utilizamos modelos de glioma in vitro e in vivo e em diversos parâmetros celulares, descrevemos a autofluorescência do fármaco e também utilizamos essa característica para avaliar a captação e a distribuição da doxazosina em células de glioma. Nossos resultados contribuíram para aproximar os modelos de estudo com o que ocorre em gliomas in vivo e para evidenciar o potencial terapêutico da doxazosina como um agente antiglioma com baixa toxicidade neural e sistêmica. / Glioblastoma (GB) is the most frequent and malignant human brain tumor. The prognosis of patients with GB remains dismal, mainly due to the low effectiveness of current therapeutic strategies and the invasive nature of this type of cancer. A characteristic of solid tumors is the presence of hypoxic areas. Hypoxic microenvironments contribute to cancer progression, resistance to treatment, and poor prognosis of the disease. Thus, we developed an in vitro model that approximates the hypoxic tumor microenvironment found in vivo. Our results suggest that OD in combination with absence of serum provided an environment favorable to the dedifferentiation of C6 cells in cancer stem cells. Doxazosin (DOX), an antihypertensive used in the clinic, has antitumor effects in several types of cancer. Thus, we evaluated the antitumor effect of DOX on rat (C6) and human (U138-MG) glioma cell lines and drug toxicity in primary astrocyte cultures and organotypic hippocampal cultures. DOX induced cell death in glioma lines and showed low neurotoxicity. In addition, the drug inhibited the PI3K/Akt pathway and activated GSK-3β and p53, resulting in induction of apoptosis and cell cycle arrest in the G0/G1 phase. Considering the importance of mitochondria in the plasticity of tumor cells and the resistance to treatment presented by glioblastomas, we analyzed the effects of DOX the interactions between nucleus and mitochondria. DOX induced mitochondrial biogenesis and apoptosis in C6 cells, and decreased TNF-α secretion. When analyzing the chemical structure doxazosin, we find several characteristics that indicate that it has autofluorescence. Thus, we characterized the autofluorescence of DOX in several media. We observed that there is a pattern of distribution of the drug in the cell: it is around the nucleus and appears to be vesiculated. Overexpression of the Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) is related to the more malignant and resistant forms of GBs. Therefore, we analyzed whether the antiglioma action of DOX is involved with EGFR. DOX treatment was able to decrease p-EGFR levels. Co-treatment of DOX and AG1478 (a receptor tyrosine kinase inhibitor) decreased EGFR phosphorylation and caused necrosis. Thus, our results suggest that the mechanism of action of doxazosin involves EGFR signaling. We evaluated the effects of free and nanoencapsulated doxazosin (DOX-NC) in in vitro and in vivo models of glioma. We demonstrated that nanoencapsulated doxazosin (DOX-NC) induced cell death in a glioma line at concentrations 100 times lower than those used for doxazosin in its free form. In addition, we analyzed the effect of DOX-NC on organotypic hippocampal cultures and, in the same way as observed with DOX, DOX-NC demonstrated low toxicity and decreased tumor area in vivo, being selective for cancer cells. In this dissertation, we altered the in vitro microenvironment of glioma cells, we evaluated the antitumor effects of doxazosin in its free and nanoencapsulated form. In addition, we used glioma models in vitro and in vivo and analyzed several cellular parameters, we described the autofluorescence of the drug and also used this characteristic to evaluate the uptake and distribution of doxazosin in glioma cells. Our results have contributed to approximate the study models with what occurs in gliomas in vivo and to evidence the therapeutic potential of doxazosin as an antiglioma agent with low neural and systemic toxicity.

A pré-eclâmpsia (PE) é causa importante de mortalidade fetal e materna. Existem evidências que a resistência à insulina esteja implicada em sua fisiopatologia. A via Akt/PKB (Akt/ Proteína quinase B) é estimulada pela insulina e exerce várias funções vitais como crescimento, sobrevivência e metabolismo celular. O objetivo do trabalho foi comparar a expressão da Akt/PKB em placentas de pacientes normais e com pré-eclâmpsia estimuladas com insulina. Foram utilizadas amostras de placenta de 12 pacientes normais e de 12 pacientes com PE foram coletadas, estimuladas com insulina e analisadas por Western blot para quantificação da expressão da proteína Akt/PKB basal e fosforilada em serina473. Como resultados, a estimulação das amostras com a insulina foi comprovada quando comparamos grupos estimulados (1,14 ± 0,10) e não estimulados (0,91 ± 0,08), P< 0,001. A atividade da via da Akt/PKB fosforilada em serina473 foi semelhante entre placentas de mulheres normais (1,26 ± 0,16) e com PE (1,01 ± 0,11), P = 0,237. Concluímos que não há diferença de fosforilação na via da Akt/PKB, após estimulação com insulina, em placentas de pacientes com PE e normais. Contudo, não podemos descartar alterações desta via de sinalização na PE sem analisarmos os substratos da Akt/PKB quando estimulados. / Preeclampsia (PE) is an important cause of fetal and maternal mortality around the world and there are evidences that insulin resistance has been implicated in the pathophysiology of preeclampsia. Akt/PKB pathway is stimulated by insulin and performs several vital functions as growth, survival and cellular metabolism. Objective: to investigate stimulates expression of Akt/PKB pathway in the placenta, of normal and preeclampsia parturient. Method: samples were collected from 12 normal patients and 12 PE patients, stimulate and analyzed by Western blot to quantify the proteins expression in signaling of Akt/PKB. Results: stimulation of insulin samples was confirmed when comparing stimulated groups (1.14 ± 0.10) and non-stimulated (0.91 ± 0.08), P <0.001. The Akt/PKB phosphor (Ser473) was not different in placenta of the normal (1.26 ± 0.16) and PE (1.01 ± 0.11) groups, with P = 0.237. Conclusions: there was no difference of phosphorylation in Akt/PKB pathway, after stimulation with insulin, in placentas of normal and PE patients. However, we cannot discard effects in this signaling pathway as pathophysiology of PE, because it is still necessary to analyze the substrates stimulation of this pathway.

Introdução. A Hiperplasia Prostática Benigna (HPB) é uma condição prevalente na senescência masculina, caracterizada pelo aumento não maligno das células do tecido epitelial e principalmente estromal da próstata. Já foi demonstrado que a ligação dos androgênios ao seu receptor (AR) tem papel vital para o desenvolvimento prostático, mantendo não só a função tecidual, mas também sua possível contribuição para a patogênese de doenças prostáticas. Alguns estudos têm sugerido que o aumento dos hormônios IGF e Insulina circulantes podem afetar direta ou indiretamente a sinalização molecular promovendo o crescimento prostático. Uma proteína importante, componente da via de sinalização dos receptores de Insulina e IGF, é a Akt/PKB. Esta proteína está relacionada com a regulação do metabolismo, apoptose e a proliferação celular. Entretanto, os eventos moleculares que levam a interação dos receptores Insulina e IGF com o Receptor de Androgênios (AR) ainda foram bem estabelecidos. Objetivos. O objetivo deste trabalho foi estabelecer uma técnica de estimulação pela insulina e IGF-I em tecido prostático e em células provenientes de pacientes com HPB, avaliar a fosforilação da Akt/PKB, e a fosforilação do AR. Materiais e Métodos. Participaram deste estudo 15 pacientes com HPB oriundos do Hospital de Clínicas de Porto Alegre para análise das proteínas Akt/PKB e AR. A análise proteica foi realizada a partir da técnica de western blot. Os protocolos de estudo e os termos de consentimentos foram aprovados pelo comitê de ética local e nacional. Resultados. Foram realizadas duas técnicas de estimulação, uma com insulina em fatias de tecido de HPB e outra com insulina e IGF-I em suspensão celular de HPB. Ocorreu um aumento na fosforilação da proteína Akt/PKB nas células de HPB estimuladas com insulina (P=0,0113) quando comparadas com a condição controle pelo tempo de 10 minutos. Foi visto um aumento na porcentagem da fosforilação do AR quando as células foram estimuladas com insulina. Conclusão. É possível avaliar a via de ativação da Akt/PKB em um modelo de células prostáticas derivadas de Hiperplasia Prostática Benigna sob estímulo da Insulina por 10 minutos. Neste modelo, também é possível avaliar a fosforilação do Receptor de Androgênios. A padronização da técnica de estimulação in vitro poderá ser útil para novas pesquisas. Estes achados podem vir a elucidar um possível mecanismo intracelular de interação entre a transdução do sinal de Insulina e IGF-I e a fosforilação do Receptor de Androgênios, e assim, possivelmente contribuir para o entendimento da proliferação celular na HPB. / Benign prostatic hyperplasia (BPH) is a prevalent disease characterized by high levels of prostate cell proliferation. The interaction of androgen hormone with its receptor (AR) has a central role in the development of prostate growth, maintaining the tissue function as the pathogenesis of the prostate disease. Increased levels of circulating insulin and IGF can directly and/or indirectly affect different signaling pathways and promote prostatic growth. The protein AKT/PKB, member of the insulin/IGF pathway, participates in metabolism, apoptosis and cell proliferation regulation. The molecular events related to the interaction of IGF-I and insulin receptor in BPH have not been defined yet. The aim of this study were to establish an in vitro protocol with insulin or IGF-I stimulation in prostatic tissue from BPH and to evaluate both Akt and AR phosphorylation. Samples were obtained from 15 BPH patients and the Akt and AR proteins were analyzed by western blot. Slices of prostatic tissues from BPH patients were stimulated with insulin. Fragmented and dissociated prostatic tissues were stimulated with insulin or IGF-I.BPH cells stimulated with insulin for 10 minutes showed higher percentage of AR and Akt phosphorylation in relation to control (P= 0.0113). These findings may suggest that insulin and IGF-I signaling pathways may contribute to distinct signals to common downstream components in response to both insulin and IGF-I for BPH development. Our study has established insulin or IGF-I stimulation of BPH cells and can contribute to elucidate a possible intracellular interaction mechanism of AR phosphorylation.